Introduction
Transduksjon-transplantasjon er en nyttig metode for å modellere hematologisk malignitet i mus. Denne teknikken har vært spesielt verdifullt for å studere myeloide maligniteter som går tilbake til den første demonstrasjonen som ektopisk uttrykk for BCR-ABL1 kunne trofast rekapitulere kronisk myelogen leukemi hos mus 1. Denne teknikken har senere muliggjort omfattende studie av JAK2 V617F og MPL W515K / L mutert myeloproliferativ svulst (MPN).
MPN er en gruppe av hematologisk ondartede sykdommer karakterisert ved overproduksjon av modne myeloide celler og benmargs fibrose. Disse sykdommene vanligvis oppstår fra klonal ekspansjon av en stamcelle som har kjøpt en somatisk mutasjon i enten JAK2, MPL eller CALR. Transduksjon-transplantasjon JAK2 V617F og MPL W515K / L-modellene utstillings kliniske kjennetegn polycytemi vera og myelofibrose 2-5 </ Sup>. Nylig har en musemodell for calreticulin-mutert MPN også blitt generert med transduksjon-transplantasjon metode 6. Disse musene utvikler en essensiell trombocytemi-lignende sykdom med økt blodplater, økt antall av megakaryocytter, og benmargs fibrose. Sammen utgjør disse modellene har ikke bare gitt mulighet til å få innsikt i den molekylære patogenesen av MPN, men også kapasitet til å utvikle og studere therapeutics i en pre-klinisk setting.
Dette manuskriptet gir en detaljert beskrivelse av transduksjon-transplantasjon metodikk med fokus på CALRdel52 mutasjon. Denne teknikk innebærer transplantasjon av retroviralt transdusert benmargceller som uttrykker det muterte bygge inn i bestrålte syngeniske resipientmus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent og utført i samsvar med anbefalinger av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of California, Irvine. Alle prosedyrer ble utført under isofluran anestesi og alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse.
1. generasjon ekotropisk Retrovirus
- Fremstille høykvalitets plasmider med en konsentrasjon på minst 1 pg / pl ved anvendelse av enten et kommersielt maxi-prep kit eller cesiumklorid rensing.
MERK: Disse inkluderer en MSCV ryggrad vektor koding genet av interesse (i dette tilfellet CALR 7,8) og markør for valg (GFP, Neo, etc.) samt en ekotropisk emballasje plasmid, koding gag-pol-env (referert her som plasmid). - Tine og utvide lav-passasje 293T-celler i DMEM supplert med 10% FBS og L-glutamin med penicillin / streptomycin (D10). Plate 5 x 10 6 celler i en 10 cm vev kultur behandlet fatet i en fuktetvevskultur-inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Utvid 293T celler i kultur. På dagen før transfeksjon, vask cellene ved tilsetning av 1 ml PBS og aspireres supernatanten inn i en termosflaske.
- For å trypsineres cellene, tilsett 2 ml 0,05% trypsin og inkuber retter i en fuktet inkubator i vevskultur 2 - 3 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
- For å stoppe trypsinering, tilsett 3 ml D10 å rett og overføre cellene til en 15 ml konisk tube. Spin cellene ved 400 xg i 10 min.
- Aspirer supernatanten til en termosflaske og resuspender cellepelleten i 2 ml D10.
- Tell cellene med trypan blå eksklusjon ved hjelp av et hemocytometer.
- Seed 2 x 10 6 celler per tallerken i tre 10 cm vev kultur behandlet retter per virus generert.
MERK: For optimale resultater, ikke la cellene til å overstige 30 - 50% samløpet ved transfeksjon eller en dårlig virus avkastning kan oppnås. - Umiddelbart før transfeksjon,aspirer media i en termos og erstatte med 5 ml frisk D10.
- For hver 10 cm petriskål for å bli tilført utarbeide en individuell sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Pipetter 760 mL av reduserte serum media i hvert mikrosentrifugerør, deretter tilsett forsiktig 40 ul transfeksjon reagens direkte inn i media. Inkuber rørene i vevskultur hetten ved romtemperatur i 5 min.
- Tilsett 30 ug av vektor MSCV med genet av interesse (15 ug ved bruk tom vektor) samt 5 pg av plasmid til hvert respektive rør og bland forsiktig ved å pipettere opp og ned. Inkuber ved romtemperatur i vevskultur panseret i ytterligere 15 min.
MERK: Mindre vektorer har en tendens til å ha høyere virus avkastning. - legge nøye det totale volumet av hver reaksjon (ca. 800 mL) dråpevis inn i sin respektive 10 cm petriskål og forsiktig vippe fatet fra side til side for å blande. Returner cellene til fuktet vev cuLTURE kuvøse.
- Etter en 8 timers inkubering over natten eller i vevskultur-inkubator, aspirer materiale i en termosflaske og forsiktig erstatte med 10 ml frisk D10.
- Ved 48 timer etter transfeksjon samle supernatanten til en 35 ml sprøyte og filtreres gjennom en 0,45 um membran for å fjerne celleavfall.
- EKSTRA: Place 10 ml fersk D10 tilbake på 293T celler og ekstra virus kan høstes ved 72 timer etter transfeksjon.
- Kast 293T celler i biohazard avfall når ingen ekstra virus samles.
- Delmengde viral supernatanten til engangsbruk volumer (for eksempel 1 ml for virus titer eller 6,5 ml for BM-infeksjon). Flash-fryse virus med flytende nitrogen og lagre virus ved -80 ° C.
MERK: Unngå gjentatte fryse / tine sykluser som de i stor grad redusere virus titer.
2. Bestem Relativ virustiter ved flowcytometri
- Tine 3T3 celler og opprettholde i D10. Kultur av cellene i et 10 cmvev-kultur behandlet tallerken i en fuktet vevskulturinkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Utføre viral titer i tre eksemplarer. For å fremstille cellene, vaskes cellene ved tilsetning av 1 ml PBS og aspireres supernatanten inn i en termosflaske.
- For å trypsineres cellene, tilsett 2 ml 0,05% trypsin og inkuber retter i en fuktet vevskulturinkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- For å stoppe trypsinering, tilsett 3 ml D10 å rett og overføre cellene til en 15 ml konisk tube. Spin cellene ved 400 xg i 10 min.
- Aspirer supernatanten til en termosflaske og resuspender cellepelleten i 2 ml D10.
- Tell cellene med trypan blå eksklusjon ved hjelp av et hemocytometer.
- Seed 3T3-celler ved en tetthet på 1 x 10 5 celler inn i femten 60 mm vevskultur-behandlede retter og inkuber over natten.
- Lag 1: 3, 1:10, 1:30, og 1: 100 fortynninger av tint viral supernatant bruker D10 i totalt 1 ml. inkluderer også en virusfri kontroll.
- aspirer megdia fra 3T3-celler inn i en termosflaske og erstatte med 4 ml D10.
- Overlegg av 3T3-celler med fortynninger av viral supernatant og legge polybren til en endelig konsentrasjon på 8 ug / ml til hver skål. Inkuber i 48 timer i en vevskulturinkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Bestemme relativ viral titer ved strømningscytometri:
- Å vaske celler, aspirer media i en termos og tilsett 5 ml PBS.
- Aspirer PBS inn i en termosflaske. Tilsett 1 ml 0,05% trypsin og inkuber ved 37 ° C i 2 - 5 minutter for å løsne cellene fra fatet.
- Tilsett 3 ml D10 og pipettere opp og ned for å løsne eventuelle gjenværende celler fra platen. Overfør cellene til en FACS rør og sentrifuger ved 400 xg i 10 min.
- Dekanter supernatanten og vask cellene med 3 ml PBS. Sentrifuger ved 400 xg i 10 min, og dekanter supernatanten. Resuspender i 200 mL PBS.
- Kjører celler på et strømningscytometer 9. Samle mellom 20.000 - 30.000 hendelser innen tHan lever celle gate (bestemt av FSC versus SSC) og beregne hvor stor andel av GFP + og GFP - celler.
MERK: viral titer anses som akseptabel når 1:30 fortynning av virus supernatant rente på minst 50% GFP + 3T3 celler. Hvis da suboptimale transduksjon resultater kan oppnås denne fortynningen resulterer i mindre enn 50% GFP + -celler. Beregningen for å bestemme viral titer ble tilpasset fra Limon et al. , Blood (1997) 9. - For å bestemme relative virus titer, bruke ligningen: virustiter = partikkeldannende enheter (PFU) / ml = [(Antall 3T3 celler × Frekvens av GFP + celler) / Volume overstående (ml)] × Fortynningsfaktor.
3. transduce Donor benmargceller
- For å forberede donor mus for benmarg (BM) innhøstingen, først bedøve mus ved isofluran vaporizer med en strømningshastighet på 5% kombinert supplerendeoksygen ved en l / min. Knip foten for å vurdere respons.
MERK: Donor mus (mindre enn 8 uker gamle) bør være forberedt på 5 dager før benmargs høst (8 dager før transplantasjon). En donor mus vil gi nok celler i minst 2 mottakere. - Injisere 150 mg / kg 5-fluorouracil (5-FU) via retro-orbital injeksjon hos bedøvede mus ved anvendelse av en 27 G x ½ "nål.
FORSIKTIGHET! 5-FU en anti-cancer kjemoterapeutisk middel. Alltid håndtere 5-FU inne en sertifisert avtrekksskap eller en ducted biosikkerhet skap. Ta kontakt med institusjonens laboratorium og dyr sikkerhet komité for å bestemme passende merking av mus behandlet med 5-FU.- Plasser en bedøvet mus på sin side og holde tilbake både ved hjelp av tommelen og pekefingeren, slik at øyet stikker litt fra hodet.
- Starter med nålen lateralt for den mediale canthus og med skråkant vendt opp, stikk nålen i en 45° vinkel i medial retning og stopper når nålen er halvveis inn. Sakte injisere celler og fjernes Fjern nål nøye.
MERK: Hvis denne teknikken er utført riktig, bør øyet trekke litt og ingen motstand skal kjennes på nålen innsetting. - Undersøk musen for tegn på skade slik som hevelse eller blødning.
- Avling benmarg 5 dager etter 5-FU behandling (3 dager før transplantasjon).
- Bedøve mus ved isofluran fordamper med en strømningshastighet på 5% kombinert ekstra oksygen ved en l / min. Knip foten for å vurdere respons.
- Sacrifice mus ved halshugging. Steriliser mus ved sprøyting sjenerøst med 70% EtOH til pels blir våt.
- Bruke dissekere saks, gjør et snitt i huden og dissekere fascia bort fra beinmuskulaturen. Deretter dissekere beinet vekk fra mus ved å skille femur ved hoften og tibia ved ankelen.
- Bøyebenet til en "L" -form og skille hvert ben ben ved å kutte ved kneleddet med disseksjonssaksen.
- For å fjerne brusk ved de distale endene av hvert ben ben, bruker disseksjonssaksen til forsiktig skrape muskel mot den ene ende av leggbenet inntil brusken er koplet ut.
- Ved hjelp av en sprøyte med en 27 G x? Tommer nål, i flukt hvert ben ben med PBS supplert med 2% FBS i løpet av en 100 pM nylonmembran i et 50 ml konisk rør. Skyll ben til ben blir hvit for å maksimere antallet celler høstet.
- Bruk stempelet av en sprøyte å mose celler gjennom nylonmembran inn i 50 ml konisk rør for å oppnå en enkel cellesuspensjon. Gjenta med andre mus ben.
- Sentrifuger cellene ved 4 ° C i 10 minutter ved 400 xg og kast supernatant. Resuspender BM i ml ammoniumklorid kalium (ACK) buffer 5 for å lysere røde blodceller. Inkuber cellene på is i 10 min.
- Fylle røret med PBS for å stoppe cellelyse. CentriFUGE celler ved 4 ° C i 10 minutter ved 400 xg og kast supernatant. Gjenta lyseringstrinn hvis BM pellet har rød farge.
- Resuspender i 5 ml PBS og telle celler ved trypanblått-eksklusjon ved hjelp av et hemocytometer.
- Resuspender cellene ved 2 x 10 6 celler per m med 2x pre-Stim cocktail som inneholder DMEM supplert med 20% FBS, L-glutamin, penicillin / streptomycin, IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / ml), og SCF (112 ng / ml). Plate 2 ml per brønn i 6-brønners plater.
- Cellene inkuberes over natten ved 37 ° C og 5% CO2.
- Tilsett 2 ml viral supernatant til hver brønn inneholdende celler BM og tilsett polybren (8 ug / ml). Spin plater ved 30 ° C i 90 minutter ved 1500 xg deretter returnere platen til vevskultur-inkubator over natten.
- Pipetter cellesuspensjon inn i koniske rør og sentrifuger ved 4 ° C i 10 minutter ved 400 xg, ikke forkaste platen. Resuspender celler i 2 ml frisk 2x pre-Stim cocktail per brønn og tilbake til de opprinnelige brønnene. Utfør en 2 nd spinoculation ved å gjenta trinn 3,7-3,9.
4. Transplant donorceller i Mottaker Mus
- Forbered syngene mottaker mus for transplantasjon med dødelig dose helkroppsbestråling <24 timer før injeksjon av BM celler.
MERK: Dødelig dose bestråling for BALB / c mus er vanligvis 800-900 cGy og 1,000-1,200 cGy for C57B / 6 10. Dosen er vanligvis delt inn i to økter av bestråling avstand på minst 3-4 timers mellomrom. - Fortsatt fra trinn 3.11, slakte transduced donorceller fra de 6 brønners plater ved forsiktig pipettering supernatant inn koniske rør. Vask hver brønn med 1 ml PBS å samle gjenværende cellene og legge til 50 ml koniske rør.
- Tilsett 0,5 ml av 0,05% trypsin til brønnene og inkuber ved 37 ° C i vevskultur-inkubator i 5 min.
- Tilsett 1 ml D10 til brønner og løsne eventuelle gjenværende cellene ved forsiktig pipettering. Legg celler til det respektive rørs fra trinn 4.2 og pellet ved sentrifugering ved 4 ° C i 10 minutter ved 400 x g.
- Vask cellene med PBS og sentrifuger ved 4 ° C i 10 minutter ved 400 x g. Resuspender i 5 ml PBS og telle celler ved hjelp av en hemocytometer etter trypan blå eksklusjon.
MERK: Hvis vektoren har en GFP-tag deretter kvantifisere prosentandel av GFP-positive celler med et strømningscytometer. - Suspender 5 x 10 5 - 2 x 10 6 celler i 50-100 mL PBS for injeksjon i mus.
- Injisere cellene via retro-orbital injeksjon i bedøvet mus ved hjelp av en steril 27 G x ½ "nål.
MERK: Andre injeksjonsteknikker inkluderer halevenen, milten, eller lår.- Anesthetize musen med isofluran og klype foten for å vurdere respons.
- Plasser musen på siden og holde ved å bruke både tommel og pekefinger slik at øyet stikker litt fra hodet.
- Med skråkant vendt opp, sett needle lateralt for den mediale canthus i 45 ° vinkel.
MERK: Hvis denne teknikken er utført riktig, bør øyet trekke litt og ingen motstand skal kjennes på nålen innsetting. - Undersøk musen for tegn på skade slik som hevelse eller blødning.
MERK: Etter transplantasjon mus vil ha lave blodverdier for flere uker og så er utsatt for smitte. Profylakse med antibiotika eller bruk av surgjort vann kan benyttes.
- En måned etter transplantasjon, måle% GFP i det perifere blod som en indikator for innpodet donorceller ved strømningscytometri.
MERK: GFP alene kan ikke fastslå suksess for innpoding av cellene. Den viral transduksjon kan ha mislyktes ennå engraftment kan ha skjedd. I dette tilfellet ville det ikke noen GFP + celler påvises, men innpoding av de transplanterte cellene var vellykket.- Ta 10 mL av perifert blod by punktering av saphenous leg vein med en 21 G x 1 ½ "sprøyte og legge den til 100 mM EDTA i PBS for å hindre koagulasjon.
- Tilsett 1 ml ACK til blod og lyse på is i 10 min. Pellet cellene ved sentrifugering ved 400 x g i 10 min.
- Aspirer supernatanten i en vakuumkolbe og tilsett 1 ml PBS supplert med 2% FBS for å stoppe lysis. Pellet cellene ved sentrifugering ved 400 x g i 10 min.
- Aspirer supernatanten i en termosflaske og resuspender pelleten i 100 pl PBS supplert med 2% FBS.
- Kjør prøvene på en strømningscytometer og samle 300.000 hendelser innen levende celle gate (bestemt av FSC versus SSC) og beregne hvor stor andel av GFP + og GFP - celler 9.
- I tillegg til en måned etter transplantasjonen, utføre blodtelling (CBC) ved hjelp av en automatisert veterinær hematologimaskin 18 for å overvåke sykdomsutvikling.
MERK: Fortsett å overvåke sykdommen av%GFP i perifert blod og CBC månedlig. - For å avslutte forsøket, bedøve musen med isofluran og klype foten for å vurdere respons. Sacrifice mus ved halshugging og høste milt og benmarg for histopatologi.
MERK: Lengden av forsøket er subjektiv og sluttdato skal vurderes på grunnlag av sykdommen fenotype forventet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transduksjon-transplantasjon teknikk resulterer i hematopoetiske rekonstituering av mottaker mus med celler som uttrykker genet av interesse. Figur 1 viser en oversikt over den transduksjon-transplantasjon musemodell for calreticulin mutert MPN. I korthet, retrovirus som uttrykker CALRwt eller CALRdel52 blir brukt til å infisere BM celler fra et C57B / 6 mus donor. Transduced cellene blir transplantert inn i bestrålte C57B / 6 mottaker mus og donor celle engraftment skjer i løpet av den første måneden etter transplantasjon. Bevis for en sykdom fenotype blir åpen 3 måneder etter transplantasjon hvor mus utstillings økt blodplater og megakaryocytes, etterfulgt av benmargsfibrose på 6 - 10 måneder etter transplantasjon. Hvis donorceller klarer å innpode, kan mus døden inntreffer i løpet av de første 2 ukene etter transplantasjon. I tillegg til dårlig injeksjons eller traumer under injeksjon, kan andre tekniske feil føre til dårlig engraftment av transduced celler eller mus død. Disse inkluderer sub-optimal bestråling av mottaker mus, hvis dette skjer mest hematopoetiske celler vil være av mottakeren i stedet for donor opprinnelse. På den annen side kan overdreven bestråling av mottakerne føre til mus for å utvikle bestråling-indusert sykdom eller død. Lave virale titere vil resultere i lav effektivitet infeksjon av donorceller. Som en konsekvens lavt antall donorceller uttrykker genet av interesse, og slik at mus ikke kan demonstrere den ønskede fenotype. Av denne grunn er det viktig at viruset med høye titere blir brukt til å transdusere donorceller. Figur 2 viser hvordan du beregner relativ viral titer der% GFP beregnes ut fra hendelsene hentet fra levende celle gate. Figur 2B illustrerer en titer med mer enn én viruspartikkel per celle (1: 3 fortynning), så vel som titere med enkelt viruspartikler per celle (1:30, 1:10 og 1: 100 supernatant). Ideelt sett, ville i det minste 50% GFP + celler være Søkereted med 1:30 fortynning av viral supernatant. Figur 3 viser tegn på en vellykket transplantasjon mottaker hvor CALRdel52 mus viser en MPN fenotype med økt blodplater, økt megakaryocytes i benmargen, og benmargsfibrose.
Figur 1: Oversikt over Transduksjon-Transplantasjon musemodell for myeloproliferative neoplasmer. A) Retrovirus generering og bestemmelse av viral titer oppstår 1 - 2 uker før transplantasjon. B) D (-8) (fem dager før benmargs høst), er giver mus behandlet med 5-FU å utarme avstamning begått celler og induserer stamcelle sykling. C) På D (-3), er benmarg høstet fra leggbena og dyrket i 2x pre-Stim over natten for å indusere celle sykling av blodkreft stamceller. D) donorceller er infisert med viral supernatant på D (-2), og cellene sentrifugeres ved 400 x g ved 30 ° C i 1,5 timer for en st spinoculation. E) I D (-1), er en 2-nd spinoculation utført på donorceller. I tillegg mus er bestrålt for å utarme celler i verten benmargen nisje for å tillate donorcelle innpoding. F) transdusert donorceller blir transplantert inn i bestrålte syngeniske resipientmus på D0. G) Dersom donorceller ikke klarer å innpode deretter døden skal inntreffe ved dag 12 - 14 etter transplantasjonen dersom dødelig dose bestråling er blitt brukt. H) Den MPN fenotype blir tydelig etter 3 måneder etter transplantasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
jpg "/>
Figur 2: Bestemmelse av virustiter ved strømningscytometri. 3T3-celler transdusert med forskjellige konsentrasjoner av virus og transduksjon effektivitet overvåkes via strømningscytometri. A) Hendelser er hentet innen levende celle gate som visualiseres ved FSC versus SSC. Døde celler er ekskludert fra analyse GFP. B) viser histogrammer% GFP for hvert volum av viral supernatant undersøkt. Den virale titer er akseptabelt når minst 50% av 3T3-celler er GFP + når infisert med 1:30 fortynning av viral supernatant. Ved hjelp av ligning fra trinn 2.11.6, ble den virale titer beregnet basert på et celletall på 400.000 celler. Beregningen for viral titer ved en 1:30 fortynning følger: [(400000 x 0,56) / 1) x 30] = 6,72 x 10 6 PFU / ml. Pr trinn 3.7, infiserer 4 x 10 6 celler med 2 ml viral supernatant ville resultere i hver celle som mottar 3 virale partikler.iles / ftp_upload / 54624 / 54624fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Bevis for vellykket Donor Cell engraftment og MPN Phenotype. Bestrålt mottaker mus overlevende utover 2 uker etter transplantasjonen indikerer vellykket engraftment av injiserte celler. A) Transplantert donorceller kan overvåkes ved% GFP i perifert blod. B) I tillegg bør CBC tellinger tas for å overvåke sykdomsprogresjon. Økt blodplater blir oppdaget så tidlig som to måneder etter transplantasjon i CALRdel52 sammenlignet med CALRwt og tom vektor kontroll. C) På tidspunktet for oppsigelsen, CALRdel52 mus vise klassiske funksjonene i MPN fenotype inkludert splenomegali (ikke vist), benmarg hypercellularitet, utvidelse av megakaryocytes i benmargen, og benmargsfibrose. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| teknisk feil | Fører til | Resultat |
| Dårlig Injection eller Trauma | Transplant Avslag | Transplant Failure |
| Bad Kvaliteten på donorceller | Transplant Avslag | Transplant Failure eller død |
| Lav virustiter | Dårlig Transduksjon av HSC | Transplant Failure |
| Høy Bestråling Dose | Bestråling indusert sykdom | Død |
| Lav Bestråling Dose | Transplant Avslag | Transplant Failure |
| Gamle Donor Mus (+12 uker) | Lav HSC Input | Transplant Failure |
Tabell 1: Tekniske feil som kan resultere i Mouse Death or Transplant Failure. Denne tabellen viser eksempler på tekniske feil og tilhørende årsaker som kan oppstå med benmargstransplantasjon protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gir en detaljert beskrivelse av hvordan du utfører benmargstransplantasjon hos mus å rekapitulere en essensiell trombocytemi lignende sykdom med progresjon til myelofibrose med CALRdel52 mutasjon som føreren av sykdommen. Vellykket transplantasjon av celler som uttrykker CALRdel52 resulterer i økede blodplater, ekspansjon av megakaryocytter og benmargs fibrose. Som benmargstransplantasjon er en flertrinns prosess, er det viktig å erkjenne trinn hvor teknisk feil kan unngås for å forebygge dårlig innpoding av celler som uttrykker genet av interesse, eller til og med mus død.
En kritisk faktor for en vellykket transduksjon-transplantasjon modell som ofte blir oversett er kvaliteten på viruset. Virus med høye titere til rette for god transduksjon effektivitet og således en sterk basis for sykdom, mens det ved hjelp av et virus assosiert med lav titer vil resultere i færre celler som uttrykker genet av interesse. transduksjon efficisering kan bli styrket ved reagenser som øker kontakten mellom virus og celler slike som polybrene og retronectin. Transduksjon av HSCs er kjent for å være vanskelig, selv med høye konsentrasjoner av virus, bare ekotropisk retrovirus smitter delende celler. Hensikten med "pre-Stim" medier (som inneholder SCF, IL-3, og IL-6) er å indusere sykling av hvil HSCs. Den lentiviral system kan brukes som en alternativ tilnærming hvis infeksjon av ikke-delende celler er nødvendig.
En annen faktor som kan ha en effekt på virus generasjon er den type transfeksjon reagens. Optimal transfeksjon reagenser bør bestemmes empirisk som markerte forskjeller i celletoksisitet er observert mellom forskningsmiljøer. Transfeksjon reagens som brukes her har gitt god viral utbytte med lav celletoksisitet. Andre vanlige transfeksjon reagenser innbefatter kalsiumfosfat 11 og nonliposomal transfeksjon reagens, så som Fugene. Denne protokollen bruker plasmid somemballasjen vektor med spesifikke vev trophisms for mus og rotter. Hvis vurderer andre dyremodeller for transduksjon-transplantasjon, kan andre emballasje vektorer med bredere trophisms også brukes til å generere amfotropt (mus, rotte, menneske) eller pantrophic (bredspektrede trophisms) retrovirus.
En ekstra fordel til benmargen transduksjon-transplantasjon modellen er muligheten undersøke konkurransefortrinn av to ulike giver populasjoner eller for å uttrykke flere gener av interesse samtidig ved hjelp av unike markører for å utpeke hver populasjon av interesse. Slike transplantater utnytter ofte congenic C57BL / 6-mus for å spore donorceller utover bruk av en integrert GFP markør. Fordi congenic C57BL / 6 mus kan uttrykke leukocytt-markører for enten CD45.1 eller CD45.2, kan donorceller fås fra en bakgrunn og transplantert inn i den andre. Videre kan en hybrid F1 belastning bli generert til å produsere avkom som uttrykker både CD45.1 og CD45.2markører. Alternativt er det MSCV retroviral vektor leveres med mange forskjellige koder, inkludert unicistronic (f.eks FLAG HA) eller bicistronisk (f.eks GFP, RFP, YFP, mCherry, hCD4) konstruerer. Disse konstruksjonene kan bli anvendt samtidig i konkurrerende transplantasjoner for å muliggjøre diskriminering mellom giver populasjoner og kan være spesielt nyttig i situasjoner hvor differensiering via CD45.1 / CD45.2 uttrykk ikke er tilgjengelig, slik som BALB / c musestamme.
En annen fordel ved transduksjon-transplantasjon er evnen til å undersøke bidraget fra spesifikke celletyper til sykdomsstart. Mens denne protokollen beskriver bare den transduksjon-transplantasjon av hele benmargen, kan andre eksperimentelle design nødvendig anriking eller isolering av ulike HSC avdelinger. I slike tilfeller vil antallet donorceller varierer i henhold til den bestemte donorpopulasjonen som brukes. I tillegg rednings celler fra en naiv donor børbrukes som et supplement for å støtte mus inntil HSC innpodingen og ekspansjon kan forekomme. Tabell 2 viser anbefalt antall donorceller for transplantasjon av ulike benmargen avdelinger 12-15.
| # Celler / Transplant Mottakers | # Av støtteceller / Transplant Mottakers | |
| Hele Bone Marrow | 500,000-2,000,000 | n / a |
| c-Kit + | 1.000-10.000 | 200000 |
| Lin-c-Kit + Sca-1 + (LKS) | 100-10.000 | 200000 |
| LKS CD150 + CD48 - SP | 1-100 | 200000 |
| LKS CD150 + CD34 - | 1-100 | 200000 |
Tabell 2. Antall donorceller til transplantasjon.
Videre kan sekundære transplantasjon også bli utført for å vurdere evnen til transduserte celler for å transplantere serielt sykdom.
Transduksjon-transplantasjon er et meget allsidig metode som er mye raskere og betydelig mer kostnadseffektivt i forhold til transgene, knock-in, eller xenograft-modeller. Det gjør det mulig å raskt bestemme om genet av interesse er tilstrekkelig til å indusere en hematologisk malignitet, og kan anvendes som en in vivo preklinisk modell for å teste narkotika. Andre fordeler ved transduksjon-transplantasjon teknikk er at den unngår ekspresjon i ikke-hematopoietiske celler, og at den retrovirale innføringsstedet tjener som en klonal markør. Begrensninger av denne teknikken inklue non-fysiologiske nivåer av omformet genet og forskjeller i integreringen stedet for det genet 16,17. Tar alle de ovennevnte fordeler og begrensninger i betraktning, er transduksjon-transplantasjon det opplagte valget for første in vivo modellering av mulige blodkreft onkogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Plasmids | |||
| EcoPak, also known as pCL-Eco | Addgene | 12371 | Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others. |
| Consumables | |||
| 27 G x 1/2" needles | BD | 305620 | |
| Fetal bovine serum | Corning | MT-35-010-CV | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Corning | MT-30-009-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Can be homemade |
| PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
| 10 cm dishes | Fisher | 172931 | |
| 15 ml conical tubes | Fisher | 12565268 | |
| 60 mm dishes | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100 µm cell strainers | Fisher | 22363549 | |
| 50 ml conical tubes | Fisher | 12565270 | |
| 6-well plate | Fisher | 130184 | |
| FACS tubes | Fisher | 14-959-5 | |
| 0.45 μm syringe filters | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK buffer | Lonza | 10-548E | Can be homemade |
| Recombinant murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant murine SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection reagent |
| 1.5 ml centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Equipment | |||
| BD Accuri C6 | |||
| X-ray irradiator |
References
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).
- Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model. Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).
- Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis. Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).
- Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F. PloS One. 1, e18 (2006).
- Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease. Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).
- Marty, C., Pecquet, C., et al. Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis. , Blood. (2015).
- Klampfl, T., Gisslinger, H., et al.
- Araki, M., Yang, Y., et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Blood. , (2016).
- Limón, A., Briones, J., et al. High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells. Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells. J. Vis. Exp. (10), (2007).
- Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis. Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).
- Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. Isolation and characterization of mouse side population cells. Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).
- Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells. Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades. Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).
- Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L.
- Scil animal care company GmbH. , Source: http://www.scilvet.us/company-downloads (2005).
