Abstract
El cuerpo de los mamíferos está equipado con varias capas de mecanismos que ayudan a defenderse de las invasiones de patógenos. Fagocitos profesionales del sistema inmune - como los neutrófilos, células dendríticas y macrófagos - conservan la capacidad innata para detectar y borrar dichos patógenos invasores a través de la fagocitosis 1. La fagocitosis implica eventos coreografía de reorganización de la membrana y la remodelación de la actina en la superficie celular 2, 3. Los fagocitos interiorizan con éxito y erradicar moléculas extrañas que se hayan cumplido todas las etapas de la fagocitosis. Estos pasos incluyen reconocimiento y unión del patógeno por los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) que reside en la superficie celular, la formación de la taza de fagocitosis a través de protuberancias membranosas de actina enriquecido (seudópodos) para rodear el material en partículas, y la escisión del fagosoma, seguido de maduración fagolisosoma que resultados en lamatando del patógeno 3, 4.
Imaging y cuantificación de las diversas etapas de la fagocitosis es instrumental para elucidar los mecanismos moleculares de este proceso celular. El presente trabajo reporta métodos para estudiar las diferentes fases de la fagocitosis. Se describe un enfoque basado en microscopio para visualizar y cuantificar la formación de una copa de unión, fagocítica, y la internalización de partículas por los fagocitos. Como la fagocitosis se produce cuando los receptores innatas en las células fagocíticas encuentran ligandos sobre una partícula objetivo más grande que 0,5 m, los ensayos que aquí presentamos comprender el uso de hongos patógenos Candida albicans y otras partículas tales como zymosan y perlas recubiertas con IgG.
Introduction
A pesar de la continua exposición a patógenos tales como bacterias, virus y hongos, nuestro cuerpo está bien equipado con mecanismo inmunológico que proporciona protección frente a la infección. El sistema inmune innato es la primera línea de defensa contra los patógenos invasores y se basa principalmente en las células fagocíticas que reconocen y se internalizan objetivos extranjeros.
La fagocitosis es un proceso celular evolutivamente conservada que abarca la inmersión de las partículas no deseadas de más de 0,5 micras. Las células fagocíticas expresan una amplia gama de receptores inmunes (también conocidos como receptores de reconocimiento de patrón, PRRS) en la superficie celular que les permiten reconocer patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) presentes en los patógenos antes de la inmersión 3. La unión de patógenos es seguido por la agrupación de receptores en la superficie celular y provoca la formación de una taza fagocítica. Esto da lugar a la remodelación de la membrana actina guiado que sobresale alrededorel objetivo, finalmente, que la envuelve y pellizcos-off para formar una vacuola phagosomal discreta 2, 5. El fagosoma continuación, madura y se acidifica mediante fusión posterior con los endosomas tardíos y lisosomas que forma fagolisosómica 6.
Aunque se describe como la fagocitosis mediada por el receptor de eventos y actina impulsado, este proceso también se basa en la modificación espacial-temporal de los lípidos que componen la membrana de plasma, tales como fosfoinosítidos (IP) y esfingolípidos 7, 8. Mientras que la polimerización de actina es dictada por una acumulación local de fosfoinositol-4,5-bifosfato (PI (4,5) P 2) en la base de la copa fagocítica, despolimerización de la actina depende de la conversión de (PI (4,5) P 2 a fosfoinositol-3,4,5-bifosfato (PI (3,4,5) P 3) 3, 9. Ambas modificacionesson esenciales ya que el primero lleva a la extensión de los seudópodos alrededor del objetivo y éste permite el hundimiento de las partículas en el citosol de la fagocitos 10.
Las células que tienen la capacidad de fagocitar o son fagocitos profesionales, como macrófagos / monocitos, granulocitos / neutrófilos, y células dendríticas (DC) o fagocitos no profesionales, tales como fibroblastos y células epiteliales 11. La fagocitosis realizada por todos los fagocitos juega un papel central en el mantenimiento del tejido y remodelación, mientras que la fagocitosis realizada por fagocitos profesionales se encarga de la coordinación de la respuesta inmune innata y adaptativa frente a los patógenos. fagocitos profesionales no sólo engullen y matan el patógeno, sino también los antígenos presentes en las células linfoides del sistema inmune adaptativo. Esto contribuye a la liberación de citoquinas pro-inflamatorias y para la participación de las células linfoides, por lo tanto, conduce ael bloqueo con éxito de la infección 12.
técnicas bioquímicas convencionales han sido fundamentales en la obtención de conocimientos sobre el mecanismo molecular de diferentes procesos celulares durante la fagocitosis, tales como las modificaciones posteriores a la traducción y diversas asociaciones de alta afinidad entre proteínas. Sin embargo, es difícil obtener información con respecto a la dinámica espacial y temporal de los acontecimientos fagocíticas utilizando los métodos bioquímicos convencionales. imágenes de células vivas no sólo nos permite supervisar eventos celulares en cuenta la sensibilidad de tiempo sino que también nos permite obtener información a nivel de células individuales. Aquí se describe un método para investigar las diferentes etapas de la fagocitosis, así como analizar todo el proceso espaciotemporalmente usando microscopía confocal.
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Protocol
1. Preparación de DC2.4 y RAW 264.7 Líneas Celulares
NOTA: La línea celular similar a macrófagos RAW 264.7 y la DC2.4 línea de células dendríticas son tanto de origen murino, y se utilizaron las siguientes condiciones para cultivar las células.
- Crecer células RAW 264.7 en DMEM (medio de Eagle Mínimo de Dulbecco) suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado (FBS) a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2.
- Se cultivan las células DC2.4 en condiciones similares con la de las células RAW 264.7, salvo el uso del medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) suplementado con L-glutamina en lugar de DMEM.
2. Preparación de conjugados fluorescentes Partículas: Perlas de C. albicans, zimosán, recubiertas de IgG-
- Cultivo de Candida albicans
- Inocular C. albicans cepa SC5314 de un stock de glicerol congelado en 25 ml de YPD suplementado con Uri (2% Bacto-peptona, 1%extracto de levadura, 2% de glucosa y 80 mg / ml uridina) durante la noche a 30 ° C.
NOTA: Evitar crecer el cultivo de Candida más de una DO 600 de 12. - Tomar 1 ml de la C. albicans y girar hacia abajo a 2000 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento con 1 ml de PBS.
- Recoger el precipitado por centrifugación a 2000 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
- Repita el paso 2.1.4.
- Calcular la multiplicidad de infección (MOI) de C. albicans en relación con el número de fagocitos y proceder con el ensayo de fagocitosis tal como se describe en la sección 3. Un OD 600 de 1 es equivalente a 2,5 x 10 7 Candida albicans por 1 ml.
NOTA: Generación de Candida-BFP se describe en la referencia 13.
- Inocular C. albicans cepa SC5314 de un stock de glicerol congelado en 25 ml de YPD suplementado con Uri (2% Bacto-peptona, 1%extracto de levadura, 2% de glucosa y 80 mg / ml uridina) durante la noche a 30 ° C.
- Preparación de zimosán y perlas recubiertas con IgG
NOTA: Zymosan es una que contiene β-glucano-preparación de partículas de hidratos de carbono por hongos que deriva de Saccharomyces cerevisiae. Zymosan se conoce para evocar señales inflamatorias en los macrófagos y las células dendríticas, y se ha utilizado ampliamente en estudios de fagocitosis 13, 14, 15.- En resumen vórtice del tubo que contiene el material en partículas, y la alícuota una cantidad suficiente para un experimento en un tubo de 1,5 ml.
NOTA: Por lo general usamos relación 1:10 (para una celda, añadir 10 zymosan partículas o perlas recubiertas con IgG). - Añadir 1 ml de PBS enfriado en hielo, y recoger las partículas por centrifugación durante 1 min a 10.000 x g.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en PBS 1 ml de hielo-frío.
- Repita los pasos 2.2.2-2.2.3
NOTA: Continúe con el punto 2.2.5 o almacenar el tubo a 4 ° C hasta su uso. - Sonicar las partículas de 10 seg en baño de ultrasonido ultrasónico (120 V, 50 a 60 kHz) con el fin de evitar unany la agregación de partículas.
- En resumen vórtice del tubo que contiene el material en partículas, y la alícuota una cantidad suficiente para un experimento en un tubo de 1,5 ml.
3. La fagocitosis
NOTA: La fagocitosis es un proceso complejo que se inicia con la unión de las partículas en la superficie celular de los fagocitos a través de la interacción de PRRS con ligandos sobre la superficie de la partícula. La unión es seguido por el montaje de actina y sus proteínas asociadas en el sitio de contacto, y la formación de una taza de fagocitosis. El desmontaje posterior actina se produce en el fagosoma y da lugar a la inmersión completa de las partículas. A continuación se describen las diferentes etapas de la fagocitosis.
- Ensayo de unión
NOTA: La finalidad de este experimento es para controlar la primera etapa de la fagocitosis que implica la interacción entre los ligandos sobre las partículas diana y los receptores en los fagocitos.- Semillas de unos 5 x 10 4 células en un portaobjetos de cámara, de modo que son 60 a 70% de confluencia en el momento del experimento. Alterntivamente, células de la placa sobre cubreobjetos (en formato de 24 ó 12 pocillos) o placas de 96 pocillos con fondo de cristal. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2.
NOTA: Las células pueden ser contados utilizando hemocitómetro o una técnica similar. - Colocar el portaobjetos de cámara (o placa) a 10 ° C durante 10 min.
- Retire con cuidado el medio de cada pocillo usando una pipeta o un aspirador.
PRECAUCIÓN: Realice este paso cuidadosamente como cada pocillo de un sistema de cámaras cubreobjetos es pequeño; es fácil de perturbar las células con la punta de una pipeta o un fuerte flujo de aire de un aspirador. - Mezclar las partículas marcadas con fluorescencia con un medio de cultivo celular (preparado como se ha descrito anteriormente). Añadir Candida -BFP (a una MOI de 10), con fluorescencia perlas-conejo-zymosan conjugado o látex IgG-FITC (10 partículas por célula) a las células. Utilizar un volumen final de 200 l medios de comunicación para una cámara bien para asegurar que todas las células están cubiertos.
- Girar por el tobogán de cámara en 277xg durante 3 min a 10 ° C.
NOTA: Este paso de centrifugación ayuda a aumentar el contacto entre las partículas y las células, y se sincroniza el proceso de unión. - Transferir inmediatamente la diapositiva cámara a un incubador humidificado 37 ° C con 5% de CO2 durante 5 min.
- Retire la diapositiva cámara de la incubadora y aspirar los medios de comunicación.
- Se lavan las células 3 veces con PBS helado.
NOTA: Compruebe la presencia de partículas sueltas con un microscopio óptico y se lava varias veces con PBS, si es necesario. Es esencial para eliminar las partículas no unidas del pozo para minimizar el ruido de fondo durante el análisis. - Fijar las células mediante la adición de 500 l 4% de paraformaldehído (PFA) diluido en PBS mediante incubación durante 30 min a temperatura ambiente.
PRECAUCIÓN: Este paso requiere el uso de PFA al 4%, que es altamente tóxico, corrosivo, y carcinógeno potencial. Adecuada se debe tener cuidado al usar este líquido. Además, proteja las muestras de la luz. - 3.1.9 Repita el paso dos veces.
NOTA: En este paso, vuelva a llenar cada vial inmediatamente después de retirar el PBS anterior. - Detener la fijación mediante la incubación con 500 l de 50 mM NH 4 Cl en PBS durante 10 min.
- Lavar las células dos veces con PBS como se describe en el paso 3.1.10.
- Permeabilizar las células mediante la adición de 250 l de tampón de unión (0,1% de saponina, 0,2% de BSA en PBS) durante 30 min a temperatura ambiente.
- Manchas F-actina mediante la adición de faloidina conjugada con fluorescencia (diluido 1: 500 en tampón de unión). Se incuban las células durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Lavar las células tres veces con PBS como se describe en el paso 3.1.10.
- Capturar imágenes utilizando un microscopio confocal (objetivo 63X y 402 nm y 488 nm láser) y analizar las imágenes usando ImageJ 16.
NOTA: La unión Una partícula éxito se caracteriza por la presencia de un cu fagocíticap en el lugar donde el contacto de partículas de la célula fagocítica (Figura 1). Vea el paso 3.2.5.
- Semillas de unos 5 x 10 4 células en un portaobjetos de cámara, de modo que son 60 a 70% de confluencia en el momento del experimento. Alterntivamente, células de la placa sobre cubreobjetos (en formato de 24 ó 12 pocillos) o placas de 96 pocillos con fondo de cristal. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2.
- La fagocitosis Ensayo de absorción
NOTA: Este experimento está diseñado para controlar la internalización completa de las partículas marcadas con fluorescencia por los fagocitos usando microscopía confocal (Figura 2).- Semillas de unos 5 x 10 4 células en un portaobjetos de cámara, de modo que son 60 a 70% de confluencia en el momento del experimento. Alternativamente, las células de la placa sobre cubreobjetos (en formato de 24 o 12 pocillos) o placas de 96 pocillos con fondo de vidrio. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2.
NOTA: Las células pueden ser contados utilizando hemocitómetro o una técnica similar. - Mantenga los portaobjetos de cámara (o placa) a 10 ° C durante 10 minutos.
NOTA: Enfriamiento es necesario con el fin de bloquear la endocitosis, así como la fagocitosis no deseado y, posteriormente, tener un fagocitosis sincronizada. - perfORM pasos de 3.1.3 a 3.1.5
- La transferencia de la diapositiva cámara a un 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2, y se incuba durante diferentes puntos de tiempo. Fijar las células después de la infección 30, 60 y 90 minutos después. Observe C. albicans se empiezan a formar hifas después de la infección de 60 minutos; fagocitos comienzan a mostrar la muerte celular (pyroptosis) después de 90 min 8.
NOTA: Esta es una recomendación, y la optimización es esencial en función del tipo de células y el material en partículas utilizado. - Realice los pasos de 3.1.7 a 3.1.15. Analizar las imágenes usando ImageJ 16.
NOTA: una absorción exitosa se caracteriza por una internalización completa de un material en partículas en el interior del citoplasma de un fagocito (Figura 2). La tinción de los fagocitos con marcador de superficie celular tales como faloidina ayuda a delinear el contorno de las células. También es esencial para llevar a cabo z-pilas con el fin de determinar si el material en partículas se une a la superficie celular o completely internalizado.
- Semillas de unos 5 x 10 4 células en un portaobjetos de cámara, de modo que son 60 a 70% de confluencia en el momento del experimento. Alternativamente, las células de la placa sobre cubreobjetos (en formato de 24 o 12 pocillos) o placas de 96 pocillos con fondo de vidrio. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2.
- Imágenes en vivo de la fagocitosis
NOTA: En este protocolo se describe el uso de la microscopía confocal para capturar las diferentes etapas de la fagocitosis utilizando zymosan fluorescente conjugado. Nosotros usamos la línea de células dendríticas DC2.4 que expresa de forma estable etiquetada con mCherry F-actina 8, un biosensor que muestra la distribución de actina filamentosa en las células vivas. Desde la fagocitosis es un proceso actina impulsado por la formación de imágenes en vivo en esta celda no sólo nos permite capturar el movimiento y la dinámica de la red de F-actina, sino también para visualizar los diferentes eventos fagocíticas dentro de las células vivas (Figura 3, Película 1).- Semillas de unos 5 x 10 4 células en un portaobjetos de cámara, a una concentración de modo que son 60 a 70% de confluencia en el momento del experimento. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2.
NOTA: Las células pueden ser contados utilizando hemocitómetro o unatécnica similar. - Mantener los portaobjetos de cámara en hielo durante 10 min.
NOTA: Enfriamiento es necesario con el fin de bloquear la absorción no deseada, y tener una fagocitosis sincronizada. - Realice los pasos de 3.1.3 a 3.1.5
- Pre-calentar la platina del microscopio a 37 ° C y equilibrar la cámara con 5% de CO 2. Espere 30 a 45 min para la temperatura y el CO 2 para estabilizar antes de iniciar la formación de imágenes.
NOTA: Dado que las emisiones de CO 2 y los niveles de temperatura son críticos para la fagocitosis, es importante para encender el calentador de microscopio antes del experimento para equilibrar la cámara ambiental. - Colocar el portaobjetos cámara que contiene las células en el recinto microscopio incubador equilibrado a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Realizar las imágenes en directo 17, 18.
NOTA: Los ajustes de la potencia del láser (ganancia, agujero de alfiler, etc.) puede variar dependiendo del tipo de THe microscopio y la sonda fluorescente usada. Por lo tanto, se recomienda consultar el manual del microscopio para la condición óptima para su imágenes en vivo 17,18.- Utilice microscopio láser confocal de barrido (y el software asociado) para imágenes en vivo. Utilice petróleo objetivo 63X 1.4NA con un agujero de alfiler de 1-1.1 unidades Airy.
- Para iniciar la proyección de imagen, se utiliza el campo brillante para encontrar una región representativa en la diapositiva cámara. A continuación, seleccione el campo haciendo clic en la opción de posición sobre el software. Para detectar las buenas prácticas agrarias en la pista 1 utiliza el conjunto de filtros de 488 nm láser con un divisor de haz a 582 nm, para detectar longitudes de onda entre 488 y 582 nm.
- En la pista 2 seleccionar un conjunto de filtros óptima para mCherry (RFP), utilizando un divisor de haz a 578 nm y la detección de longitudes de onda entre 578 y 600 nm. Utilice 488 nm y 578 nm con láseres de potencia del láser 50% y una salida de ganancia de 600-700. Obtener imágenes cada 30 seg durante un total de 90 min.
- Semillas de unos 5 x 10 4 células en un portaobjetos de cámara, a una concentración de modo que son 60 a 70% de confluencia en el momento del experimento. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2.
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Representative Results
se presenta método basado en microscopio para controlar las diferentes etapas de la fagocitosis. Se muestran los diferentes eventos durante la fagocitosis de partículas fluorescentes diferentes de células DC2.4. Usando las técnicas descritas aquí, se investigó el papel de los esfingolípidos en las primeras etapas de la fagocitosis. Para este propósito, las células dendríticas DC2.4 genéticamente deficientes en Sptlc2, la enzima que cataliza la primera y la tasa de limitación de paso en la ruta de biosíntesis de los esfingolípidos, se utilizaron. En comparación con células de tipo salvaje, Sptlc2 - / - células DC2.4 han reducido significativamente el nivel de los esfingolípidos, incluyendo la ceramida, esfingomielina y glucosilceramida 8. Sptlc2 - / - células DC2.4 son defectuosos en la unión, así como en la absorción de C. albicans, zymosan y perlas de látex IgG 8. En la Figura 1, las partículas de unión de fluorescencia conjugados-zymosan en células DC2.4 se muestra (ver Sección 3.1 para más detalles). Sptlc2 - / - células DC2.4 mostraron significativamente menos unión de zymosan que las células control DC2.4 (p = 0,0008; Figura 1A). El número de partículas de zymosan unidas por célula fue significativamente mayor para las células de control que para Sptlc2 - / - células DC2.4 (p <0,0001; Figura 1C). A continuación se investigó la capacidad de los Sptlc2 - / - células DC2.4 fagocitan a C. albicans. Sptlc2 - / - células DC2.4 mostraron significativamente menos fagocitosis de C. albicans (p <0,0005) en comparación con las células de control (Figura 2A, 2B). Como era de esperar, las células Sptlc2 deficientes mostraron significativamente mayor número de células no fagocíticas (p <0,05; Figura 1C) y disminución del número de C. albicans por célula (Figura 1C, D). Estos resultados subrayan el papel de una vía de biosíntesis de los esfingolípidos intacto en la unión, así como en tque la captación de partículas. La Figura 3 muestra las imágenes con lapso de tiempo que demuestran las primeras etapas de la fagocitosis (véase la Sección 3.3 para el procedimiento detallado). Película 1 muestra la formación de imágenes en vivo de las células que expresan establemente DC2.4 F-actina, un biosensor que revela la distribución de actina filamentosa en las células (véase la Sección 3.1 para más detalles) que viven.
Figura 1: Ensayo de unión de zymosan en las células DC2.4. (A) Control y Sptlc2 - / - células DC2.4 se incubaron con zymosan conjugado con fluorescencia, y su capacidad de unión a las partículas examinadas por microscopía confocal. Las flechas indican los sitios de unión. Barra de escala = 100 micras. (B, C) Cuantificación del número de partículas unidas zymosan (B) y el número de partículas de zymosan obligado por cse muestra ell (C). partículas unidas se cuantificaron y se presentan como el porcentaje con respecto al control. Todos los gráficos muestran SD de tres experimentos independientes, y se contaron al menos 200 células para cada experimento. se utilizó la prueba t no apareado para analizar la significación de las diferencias observadas. ** P <0,001. Barra de escala = 100 micras. Reimpresión con permiso de Tafesse et al. 2015 8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La fagocitosis de C. albicans en las células DC2.4. Las células (A) se infectaron con C andida -BFP como se describe en el paso 3.2. A los 90 min después de la infección, las células fueron fijadas y teñidas con phalloid conjugado con fluorescenciay utilizando imágenes de microscopía confocal. (B - D) se muestra la cuantificación del número de Candida -BFP células internalizadas, no fagocíticas, y el número de Candida -BFP por célula. Todos los gráficos muestran SD de tres experimentos independientes, y se contaron al menos 200 células para cada experimento. se utilizó la prueba t no apareado para analizar la significación de las diferencias observadas. ** P <0,001. Barra de escala = 100 micras. Reimpresión con permiso de Tafesse et al. 2015 8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Time-lapse de C. albicans captación de visualizar las primeras etapas de la fagocitosis. Las células de tipo salvaje que expresan establemente DC2.4 F-actina -mCherry (F-actina) se incubaron con Candida -BFP (se muestra en rojo) y la imagen mediante microscopía confocal. Se muestran las imágenes captadas a intervalos de 30 seg. Los asteriscos muestran las diferentes etapas de remodelación de actina durante la fagocitosis. Barra de escala = 100 micras. Reimpresión con permiso de Tafesse et al. 2015 8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1: Imágenes en vivo. Las células de tipo salvaje DC2.4 que expresan establemente la actina F-mCherry (en verde) fueron infectados con Candida -BFP (en rojo). formación de imágenes en vivo se realizó mediante microscopía confocal como se describe en el paso 3.3. Reimpresión con permiso de Tafesse et al. 2015 8.s / ftp_upload / 54646 / 54646mov1.avi "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)
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Discussion
fagocitos profesionales, como los macrófagos y las células dendríticas, envolver y eliminar los patógenos invasores por lo tanto haciendo la fagocitosis un componente importante del sistema de defensa del huésped. Durante este proceso se someten a los fagocitos extensa reorganización de la membrana y la reorganización del citoesqueleto en su superficie celular 8, 19, 20. Para entender mejor este proceso dinámico, la visualización de las diferentes etapas de la fagocitosis es esencial. Aquí describimos un método basado en el microscopio que se utilizó para controlar las diversas etapas de la fagocitosis.
La principal importancia de la técnica de imagen en vivo es que proporciona la capacidad notable para controlar la interfaz de huésped-patógeno a nivel molecular. Al permitir la visualización de los pasos clave de la infección microbiana, imágenes en vivo ofrece una visión crítica de la naturaleza fundamental de la respuesta inmunecontra patógenos 8, 10, 21, 22. Además de la fagocitosis, las técnicas descritas aquí se pueden extender a estudios de otros tipos de endocitosis mediada por receptor, incluyendo macropinocytosis 10. Formación de imágenes en vivo es también un enfoque valioso para estudiar la relación huésped-patógeno de bacterias intracelulares, tales como Mycobacterium tuberculosis y Salmonella typhi, así como parásitos incluyendo Leishmania y Toxoplasma gondii 22, 23.
Hay varias ventajas de imágenes de células vivas sobre las otras técnicas, tales como los enfoques bioquímicos convencionales. Imágenes de células vivas nos permite monitorear la dinámica espacial y temporal de los procesos celulares 8. Por otra parte, las imágenes en directo nos permite ganar informaración en una sola resolución de la celda 21. La fagocitosis es un proceso celular dinámico que implica el agrupamiento de receptores, la actina y la remodelación de lípidos de membrana en cuestión de unos pocos minutos a 10. Imágenes en vivo nos permite capturar la información de una manera sensible al tiempo, por lo demás difícil de lograr.
La principal limitación de esta técnica es que requiere una cuidadosa optimización de las condiciones experimentales y configuraciones de microscopio. Hay varios factores clave esenciales para el éxito la obtención de imágenes. Las cualidades de la proteína fluorescente (o biosensor) utilizado para visualizar los fagocitos (tales como F-actina), así como la naturaleza del colorante usado para marcar las partículas son aspectos críticos de la formación de imágenes. Para imágenes en vivo, igual de importante es el equilibrio de la cámara ambiental de la configuración del microscopio. Dependiendo del instrumento, el equilibrio puede tomar de 15 min a varias horas. Sina vez que el suministro de CO 2 está destinada a preservar un pH apropiado dentro del medio de cultivo, es necesario para permitir suficiente tiempo de ejecución antes de configurar el experimento. En los casos en que el suministro de CO2 es insuficiente y / o irregular, agente tampón química orgánica de ion híbrido tales como HEPES se pueden complementar a los medios de cultivo. La exposición a largo plazo de las partículas fluorescentes y las células vivas para confocal láser puede conducir a la fototoxicidad y blanqueo. La optimización de la potencia del láser (la menos tiempo de exposición, mejor) y asegurarse de que los obturadores están cerrados entre adquisiciones de imágenes puede reducir estos problemas. En general, las técnicas descritas aquí son ideales para el estudio de la relación dinámica entre los agentes patógenos y los fagocitos durante la fagocitosis.
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Acknowledgments
Damos las gracias a Wendy salmón y Nicki Watson de la instalación Keck en el Instituto Whitehead del MIT para la formación de imágenes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Cell Signaling Technology | 9998 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | BP-231-1 | |
| DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium) | Gibco | 11965 | |
| PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | |
| FITC-coupled IgG-coated latex beads | Cayman | 500290 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| Paraformaldehyde Solution (4% in PBS) | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15-140-122 | |
| Phalloidin-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A12379 | |
| RAW 264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute) | Gibco | 61870 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | S7900 | |
| Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS) | Corning cellgro | MT25900CI | |
| Trypsin-EDTA (1x) (0.05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85114 | |
| Zymosan-Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | Z23374 | |
| Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers) | ThermoFisher | 155361 | |
| Glasstic slide 10 with grids | Hycor | 87144 |
References
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