Visualisera de tidiga stadierna av Fagocytos

Abstract

Däggdjurskroppen är utrustad med olika lager av mekanismer som bidrar till att försvara sig mot patogena invasioner. Professionella fagocyter i immunsystemet - såsom neutrofiler, dendritiska celler och makrofager - behålla den inneboende förmåga att upptäcka och rensa sådana invaderande patogener genom fagocytos ^en. Fagocytos involverar koreografe händelser av membran omorganisation och aktin remodellering vid cellytan ^{2, 3.} Fagocyter framgångsrikt internalisera och utrota främmande molekyler endast när alla stadier av fagocytos är uppfyllda. Dessa steg inkluderar igenkänning och bindning av patogenet genom mönsterigenkänningsreceptorer (PRRs) bosatt på cellytan, för att bildningen av fagocytisk kopp genom aktin berikad membranösa utsprång (pseudopods) omger den partikelformiga, och uppdelning av den phagosome följt av phagolysosome mognad som resulterar i attdödande av patogenen ^{3, 4.}

Imaging och kvantifiering av olika stadier av fagocytos är avgörande för att belysa de molekylära mekanismerna för detta cellulär process. Den nuvarande manuskriptet rapporterar metoder för att studera de olika faserna av fagocytos. Vi beskriver ett mikroskop baserad metod för att visualisera och kvantifiera bindningen, fagocytisk kopp bildning och internalisering av partiklar av fagocyter. Som fagocytos uppstår när medfödda receptorer på fagocytiska celler möter ligander på ett mål partikel större än 0,5 um, analyserna vi presenterar här omfattar användning av patogena svampar Candida albicans och andra partiklar som zymosan och IgG-belagda pärlor.

Introduction

Trots kontinuerlig exponering för patogener, såsom bakterier, virus och svampar, är vår kropp väl utrustade med immunmekanism som ger skydd mot infektion. Det medfödda immunförsvaret är den första försvarslinjen mot invaderande patogener och förlitar sig huvudsakligen på fagocytiska celler som känner igen och internaliserar utländska mål.

Fagocytos är ett evolutionärt konserverat cellulär process som omfattar omvälvning av oönskade partiklar större än 0,5 pm. Fagocytiska celler uttrycker ett brett spektrum av immunreceptorer (även känd som mönsterigenkänningsreceptorer, PRRS) vid cellytan som gör det möjligt för dem att känna igen patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) förekommer på patogener före engulfment ^3. Patogen bindning följs av receptorklusterbildning vid cellytan och utlöser bildandet av en fagocytisk kopp. Detta resulterar i aktin-driven membran ombyggnad som sticker ut runtmålet, slutligen omsluter den och nypa-off för att bilda en diskret phagosomal vacuole ^{2, 5.} Den phagosome mognar sedan och försurar genom efterföljande fusion med sena endosomer och lysosomer som bildar phagolysosome ^6.

Även fagocytos beskrivs som receptormedierad och aktin-driven händelse, denna process är också beroende av spatial-temporal modifiering av lipider som utgör plasmamembranet, såsom fosfoinositider (PI) och sfingolipider ^{7, 8.} Medan aktin polymerisation dikteras av en lokal ansamling av fosfoinositol-4,5-bifosfat (PI (4,5) _P2) vid basen av den fagocytiska cup, aktin depolymerisation beror på omvandlingen av (PI (4,5) P ₂ att fosfoinositol-3,4,5-bifosfat (PI (3,4,5) _P3) ^{3, 9.} Båda ändringarär viktigt eftersom de tidigare leder till framgångsrik utvidgning av pseudopods kring målet och senare möjliggör sjunka av partiklar i cytosolen av fagocyt ^10.

Celler som har förmåga att fagocytera är antingen yrkesmässiga fagocyter, såsom makrofager / monocyter, granulocyter / neutrofiler, och dendritiska celler (DC) eller nonprofessional fagocyter, såsom fibroblast och epitelceller ^11. Fagocytos som utförs av alla fagocyter spelar en central roll i vävnads underhåll och ombyggnad, medan fagocytos utförs av professionella fagocyter är ansvarig för samordningen av det medfödda och adaptiva immunsvar mot patogener. Professionella fagocyter inte bara uppsluka och döda patogenen, men innebär även antigener till de lymfoida celler av det adaptiva immunsystemet. Detta bidrar till frisättning av proinflammatoriska cytokiner och till ingrepp av lymfoidceller, vilket orsakarframgångsrik blockad av infektion ^12.

Konventionella biokemiska tekniker har varit avgörande för att få kunskap om den molekylära mekanismen av olika cellulära processer under fagocytos, såsom posttranslationella modifieringar och olika hög affinitet samband mellan proteiner. Det är dock svårt att få information om den rumsliga och tidsmässiga dynamiken i fagocytiska händelser med hjälp av konventionella biokemiska metoder. Levande cell imaging inte bara tillåter oss att övervaka cellulära händelser i en tid känsligt sätt utan också ger oss möjlighet att få information på en enda cell nivå. Här beskriver vi en metod för att undersöka de olika stadierna av fagocytos, liksom att analysera hela processen spatiotemporally med hjälp av konfokalmikroskopi.

Protocol

1. Framställning av DC2.4 och RAW 264,7 cellinjer

OBS: makrofagliknande cellinjen RAW 264,7 och den dendritiska cellinjen DC2.4 är både murint ursprung, och följande villkor användes för att odla cellerna.

1. Växa RAW 264.7-celler i DMEM (Dulbeccos Minimal Eagles medium) kompletterat med 10% inaktiverat fetalt bovint serum (FBS) vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% _CO2.
2. Växa DC2.4 celler under liknande betingelser med den hos RAW 264.7-celler, med undantag av användning RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium supplementerat med L-glutamin istället för DMEM.

2. Beredning av fluorescerande Conjugated Partiklar: C. albicans, zymosan, IgG-belagda pärlor

1. Växande Candida albicans
   1. Inokulera C. albicans-stam SC5314 från en fryst glycerolstam i 25 ml YPD kompletterat med Uri (2% Bacto-pepton, 1%jästextrakt, 2% glukos och 80 | ig / ml uridin) över natten vid 30 ° C.
      OBS: Undvik odling av Candida kultur mer än en OD ₆₀₀ av 12.
   2. Ta 1 ml av de C. albicans och snurra det ned vid 2000 xg under 5 min vid rumstemperatur.
   3. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten med 1 ml PBS.
   4. Samla pelleten genom centrifugering vid 2000 xg under 5 min vid rumstemperatur.
   5. Upprepa steg 2.1.4.
   6. Beräkna infektionsmultiplicitet (MOI) på C. albicans i förhållande till det antal fagocyter och fortsätt med fagocytos-analysen som beskrivs i avsnitt 3. En OD ₆₀₀ av en är ekvivalent med 2,5 x 10 ⁷ Candida albicans per 1 ml.
      OBS: Generation av Candida-BFP beskrivs i referens ^13.
2. Framställning av Zymosan och IgG-belagda pärlor
   OBS: Zymosan är en β-glukan-innehållandesvampkolhydratpartikelpreparat som härrör från Saccharomyces cerevisiae. Zymosan är känt för att framkalla inflammatoriska signaler i makrofager och dendritiska celler, och den har använts i stor utsträckning i fagocytos studier ^{13, 14, 15.}
   1. Vortexa kort röret som innehåller den partikelformiga, och delprov en mängd tillräcklig för ett experiment i ett 1,5 ml rör.
      OBS: Vanligtvis använder vi 01:10 förhållande (för en cell, tillsätt 10 zymosan partiklar eller IgG-belagda pärlor).
   2. Tillsätt 1 ml iskall PBS, och samla partiklarna genom centrifugering under 1 min vid 10000 x g.
   3. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml iskall PBS.
   4. Upprepa steg 2.2.2-2.2.3
      OBS: Fortsätt till steg 2.2.5 eller förvara röret vid 4 ° C fram till användning.
   5. Sonikera partiklar för 10 sekunder i ultraljudsbad sonikator (120 V, 50-60 kHz) i syfte att undvika enny partikel aggregering.

3. Fagocytos

OBS: Fagocytos är en komplex process som börjar med bindning av partiklarna på cellytan av de fagocyter genom interaktion av PRRs med ligander på ytan av partikeln. Bindning följs av hopsättning av aktin och dess associerade proteiner vid stället för kontakten, och bildandet av en fagocytisk kopp. Den efterföljande aktin demontering sker vid phagosome och resulterar i den fullständiga omvälvning av det partikelformiga. Nedan beskriver vi de olika stadierna av fagocytos.

1. bindnings~~POS=TRUNC analys~~POS=HEADCOMP
   NOTERA: Syftet med detta experiment är att övervaka det första steget av fagocytos som innebär samverkan mellan ligander på de målpartiklar och de receptorer på fagocyter.
   1. Utsäde ca 5 x 10 ⁴ celler i en kammare slid så att de är 60-70% sammanflytande vid tiden för experimentet. Alterntivt, platt celler på täckglas (i 24- eller 12-brunnsformat) eller glasbottnade 96-brunnsplattor. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C fuktad inkubator med 5% _CO2.
      OBS: Celler kan räknas med hjälp av hemocytometer eller en liknande teknik.
   2. Placera kammaren sliden (eller platta) vid 10 ° C under 10 min.
   3. Försiktigt bort mediet från varje brunn med hjälp av en pipett eller sug.
      VARNING: Utför detta steg noggrant som varje brunn i en kammarcoverglass systemet är liten; det är lätt att störa cellerna med spetsen på en pipett eller en stark luftström av en aspirator.
   4. Blanda fluorescensmärkta partiklar med ett cellodlingsmedium (framställt såsom beskrivits ovan). Lägga Candida -BFP (vid ett MOI av 10), fluorescent konjugerad-zymosan eller latex pärlor-kanin-IgG-FITC (10 partiklar per cell) till cellerna. Använda en slutlig volym av 200 | il media för en kammare väl för att säkerställa att alla celler är täckta.
   5. Centrifugera ner kammaren sliden vid 277xg i 3 min vid 10 ° C.
      OBS: Detta centrifugeringssteg bidrar till att öka kontakten mellan partiklar och cellerna, och det synkroniserar bindningsprocessen.
   6. Överför omedelbart kammaren bild till en 37 ° C fuktad inkubator med 5% _CO2 under 5 min.
   7. Ta kammar glida ur inkubatorn och aspirera media.
   8. Tvätta cellerna 3x med iskall PBS.
      OBS: Kontrollera förekomsten av obundna partiklar med ett ljusmikroskop och tvätta flera gånger med PBS vid behov. Det är mycket viktigt att avlägsna obundna partiklar från brunnen för att minimera bakgrundsbruset under analysen.
   9. Fixera cellerna genom tillsats av 500 | j, l 4% paraformaldehyd (PFA) utspädd i PBS genom inkubation under 30 min vid rumstemperatur.
      VARNING: Detta steg kräver användning av 4% PFA som är mycket giftigt, frätande och potentiellt cancerframkallande. Korrekt försiktighet bör iakttas vid användning av denna vätska. Dessutom skyddar prover från ljus.
   10. Upprepa 3.1.9 steg två gånger.
       OBS: I detta steg, fylla varje flaska omedelbart efter att den tidigare PBS.
   11. Stoppa fixering genom inkubering med 500 | j, l av 50 mM _NH4CI i PBS under 10 min.
   12. Tvätta cellerna två gånger med PBS såsom beskrivs i steg 3.1.10.
   13. Permeabilize celler genom att tillsätta 250 | il bindningsbuffert (0,1% saponin, 0,2% BSA i PBS) under 30 min vid rumstemperatur.
   14. Stain F-aktin genom att tillsätta fluorescerande konjugerad falloidin (utspädd 1: 500 i bindningsbuffert). Inkubera cellerna under 1 h vid rumstemperatur.
   15. Tvätta cellerna tre gånger med PBS såsom beskrivs i steg 3.1.10.
   16. Fånga bilder med hjälp av en konfokalmikroskop (63x objektiv, och 402 nm och 488 nm laser) och analysera bilder med ImageJ ^16.
       OBS: En framgångsrik partikel bindning kännetecknas av närvaron av en fagocytisk cup på den plats där partikel kontakta fagocytiska cellen (Figur 1). Se steg 3.2.5.
2. Fagocytos upptagningsanalys
   OBS: Detta experiment är utformat för att övervaka komplett internalisering av fluorescensmärkta partiklar av fagocyter med användning av konfokalmikroskopi (fig 2).
   1. Utsäde ca 5 x 10 ⁴ celler i en kammare slid så att de är 60-70% sammanflytande vid tiden för experimentet. Alternativt platt celler på täckglas (i 24- eller 12-brunnsformat) eller glasbottnade 96-brunnsplattor. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C fuktad inkubator med 5% _CO2.
      OBS: Celler kan räknas med hjälp av hemocytometer eller en liknande teknik.
   2. Hålla kammarobjektglas (eller platta) vid 10 ° C under 10 min.
      OBS: Kylning är nödvändig för att blockera endocytos såväl som oönskad fagocytos, och därefter att ha en synkroniserad fagocytos.
   3. PerfektOrm steg från 3.1.3 till 3.1.5
   4. Överföra kammaren sliden till en 37 ° C fuktad inkubator med 5% _CO2, och inkubera under olika tidpunkter. Fixera celler efter 30, 60 och 90 min efter infektion. Observera C. albicans börjar bildas hyfer vid 60 min efter infektion; fagocyter börja visa celldöd (pyroptosis) efter 90 min ^8.
      OBS: Detta är en rekommendation, och optimering är nödvändigt beroende på celltyp och partikel används.
   5. Utför steg från 3.1.7 till 3.1.15. Analysera bilder med ImageJ ^16.
      OBS: en framgångsrik upptagning kännetecknas av en fullständig internalisering av en partikel inuti cytoplasman av en fagocyt (Figur 2). Färgning av fagocyter med cellytan markör såsom falloidin bidrar till att beskriva konturen av celler. Det är också väsentligt att utföra z-stackar i syfte att fastställa om det partikelformiga är bundet till cellytan eller kompletely internaliseras.
3. Live avbildning av fagocytos
   OBS: I detta protokoll beskriver vi användning av konfokalmikroskopi för att fånga de olika stadierna av fagocytos med hjälp av fluorescerande konjugerad zymosan. Vi använder den dendritiska cellinjen DC2.4 som stabilt uttrycker mCherry-märkt F-aktin ^8, en biosensor som visar fördelningen av fintrådiga aktin i levande celler. Eftersom fagocytos är en aktin driven process inte bara levande avbildning i denna cell gör att vi kan fånga rörelse och dynamik F-aktin nätverk, men också för att visualisera olika fagocytiska händelser inom levande celler (Figur 3, Movie 1).
   1. Utsäde ca 5 x 10 ⁴ celler i en kammare slid vid en koncentration så att de är 60-70% sammanflytande vid tiden för experimentet. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C fuktad inkubator med 5% _CO2.
      OBS: Celler kan räknas med hjälp av hemocytometer eller enliknande teknik.
   2. Håll kammar glider på is under 10 minuter.
      OBS: Kylning är nödvändig för att blockera oönskat upptag och för att ha en synkroniserad fagocytos.
   3. Utför steg från 3.1.3 till 3.1.5
   4. Pre-värma mikroskopställningen till 37 ° C och ekvilibrera kammaren med 5% _CO2. Vänta 30-45 minuter för temperaturen och CO ₂ för att stabilisera innan avbildning.
      OBS: Eftersom CO ₂ och temperaturnivåer är avgörande för fagocytos, är det viktigt att slå på mikroskop värmaren före experimentet att utjämna klimatkammare.
   5. Placera kammaren sliden innehållande cellerna i mikroskopet inkubator inneslutningen i jämvikt vid 37 ° C och 5% _CO2.
   6. Uppträda live avbildning ^{17, 18.}
      OBS: Inställningarna för lasereffekt (vinst, hål, etc.) kan variera beroende på vilken typ av ee mikroskop och fluorescerande sond som används. Därför rekommenderar vi att ha hört den manuella av mikroskop för optimal kondition för levande avbildning ^17,18.
      1. Använd konfokala laserskanning mikroskop (och tillhörande programvara) för levande avbildning. Använd 63x 1.4NA olja mål med en hål av 1-1.1 Airy enheter.
      2. För att starta bild använde ljusa fältet för att hitta en representativ region på kammarobjektglas. Därefter markerar du fältet genom att klicka på alternativet Placering på programvaran. För att detektera GFP i spår 1 använt filteruppsättningen för 488 nm laser med en stråldelare vid 582 nm, för att detektera våglängder mellan 488 och 582 nm.
      3. I Spår 2 välja ett filter in optimal för mCherry (RFP) med hjälp av en stråldelare vid 578 nm och detektion av våglängder mellan 578 och 600 nm. Använd 488 nm och 578 nm lasrar med 50% lasereffekt och en vinst produktion av 600-700. Erhålla bilder every 30 sec under totalt 90 min.

Representative Results

Mikroskop-baserad metod för att övervaka de olika stadierna av fagocytos presenteras. De olika händelser under fagocytos av olika fluorescerande partiklar genom DC2.4 celler visas. Med hjälp av metoder som beskrivs här, undersökte vi roll sfingolipider i de tidiga stadierna av fagocytos. För detta ändamål, DC2.4 dendritiska celler genetiskt deficienta i Sptlc2, det enzym som katalyserar det första och hastighetsbegränsande steget i sfingolipiden biosyntetiska vägen, användes. Jämfört med vildtyp celler, Sptlc2 ^{- / -} DC2.4 celler har avsevärt sänkt sfingolipider inklusive ceramid, sfingomyelin och glukosylceramid ^8. Sptlc2 ^{- / -} DC2.4 celler är defekta i bindning, såväl som i upptaget av C. albicans, zymosan och IgG-latexpärlor ^8. I figur 1, är bindningen av fluorescerande konjugerade-zymosan partiklar i DC2.4 celler visas (se Avsnitn 3.1 för detaljer). Sptlc2 ^{- / -} DC2.4 celler visade signifikant mindre bindning av zymosan än styr DC2.4 celler (p = 0,0008; Figur 1A). Antalet zymosan partiklar bundna per cell var signifikant högre för kontrollceller än för Sptlc2 ^{- / -} DC2.4 celler (p <0,0001, Figur 1C). Vi undersökte nästa förmåga Sptlc2 ^{- / -} DC2.4 celler att fagocytera C. albicans. Sptlc2 ^{- / -} DC2.4 celler visade signifikant mindre fagocytos av C. albicans (p <0,0005) jämfört med kontrollcellerna (Figur 2A, 2B). Som väntat, Sptlc2-saknande celler visade signifikant högre antal icke-fagocytiska celler (p <0,05; Figur 1C) och minskade antalet C. albicans per cell (Figur 1C, D). Dessa resultat understryker den roll som en intakt sfingolipid biosyntetisk väg i bindning, såväl som i than upptag av partiklar. Figur 3 visar tidsförlopp bilder som visar de tidiga stadierna av fagocytos (se avsnitt 3.3 för detaljerade instruktioner). Film 1 visar levande avbildning av DC2.4 celler som stabilt uttrycker F-aktin, en biosensor som avslöjar utbredningen av fintrådiga aktin i levande celler (se avsnitt 3.1 för mer information).

Figur 1: Bindningsanalys av zymosan i DC2.4 celler. (A) Kontroll och Sptlc2 ^{- / -} DC2.4 celler inkuberades med fluorescerande konjugerad zymosan, och deras förmåga att binda de undersökta av konfokalmikroskopi partiklar. Pilar indikerar ställena i bindning. Skalstreck = 100 | j, m. (B, C) Kvantifiering av antalet bundna zymosan partiklar (B) och antalet zymosan partiklar bundet per cell (C) visas. Bundna partiklar kvantifierades och presenteras som den procentuella förhållande till kontrollen. Alla grafer visar SD för tre oberoende experiment, och minst 200 celler räknades för varje experiment. Oparat t-test användes för att analysera betydelsen av de observerade skillnaderna. ** P <0,001. Skalstreck = 100 | j, m. Reprint med tillstånd från Tafesse et al. 2015 ^8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Fagocytos av C. albicans i DC2.4 celler. (A) Celler infekterades med C andida -BFP såsom beskrivits i steg 3,2. Vid 90 min efter infektion fixerades celler och färgades med fluorescerande konjugerad phalloidi och avbildas med konfokalmikroskopi. (B - D) Kvantifiering av antalet internalis Candida -BFP, icke-fagocytiska celler, och antalet Candida -BFP per cell visas. Alla grafer visar SD för tre oberoende experiment, och minst 200 celler räknades för varje experiment. Oparat t-test användes för att analysera betydelsen av de observerade skillnaderna. ** P <0,001. Skalstreck = 100 | j, m. Reprint med tillstånd från Tafesse et al. 2015 ^8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Time-lapse avbildning av C. albicans upptag att visualisera de tidiga stadierna av fagocytos. Vilda typen DC2.4 celler som stabilt uttrycker F-aktin -mCherry (F-aktin) inkuberades med Candida -BFP (visas i rött) och avbildas med konfokalmikroskopi. Bilder som tagits vid 30 sek intervall visas. Asterisker visar de olika stadierna av aktin ombyggnad under fagocytos. Skalstreck = 100 | j, m. Reprint med tillstånd från Tafesse et al. 2015 ^8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Film 1: Live avbildning. Wild typ DC2.4 celler som stabilt uttrycker F-aktin-mCherry (visas i grönt) infekterades med Candida -BFP (visas i rött). Live avbildning utfördes med hjälp av konfokalmikroskopi som beskrivs i steg 3,3. Reprint med tillstånd från Tafesse et al. 2015 ^8.s / ftp_upload / 54.646 / 54646mov1.avi "target =" _ blank "> Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)

Discussion

Professionella fagocyter, såsom makrofager och dendritiska celler, uppsluka och eliminera invaderande patogener därför gör fagocytos en viktig komponent i värdförsvarssystemet. Under denna process fagocyter genomgår omfattande membran omorganisation och cytoskelettet omlagring vid sin cellyta ^{8, 19, 20.} För att bättre förstå denna dynamiska process, är väsentligt visualisering av de olika stadierna av fagocytos. Här har vi beskrivit ett mikroskop-baserad metod som användes för att övervaka de olika stegen i fagocytos.

Den viktigaste betydelsen av den levande bildteknik är att det ger anmärkningsvärd förmåga att övervaka värdpatogen gränssnitt på molekylär nivå. Genom att låta visualisering av de viktigaste stegen i mikrobiell infektion, ger levande avbildning kritisk inblick i den grundläggande karaktären av immunsvaretmot patogener ^{8, 10, 21, 22.} I tillägg till fagocytos, kan de metoder som beskrivs här utökas för att studera andra typer av receptorförmedlad endocytos, inklusive macropinocytosis ^10. Live avbildning är också en värdefull metod för att studera värdpatogen förhållandet mellan intracellulära bakterier såsom Mycobacterium tuberculosis och Salmonella typhi, samt parasiter inklusive Leishmania och Toxoplasma gondii ^{22, 23.}

Det finns flera fördelar med levande cell imaging över andra tekniker såsom konventionella biokemiska metoder. Levande cell imaging tillåter oss att övervaka den rumsliga och tidsmässiga dynamiken i cellulära processer ^8. Dessutom tillåter levande avbildning oss att få informeraation vid en enda cell upplösning ^21. Fagocytos är en dynamisk cellulär process som involverar klustring av receptorer, aktin och membranlipid ombyggnad inom loppet av några minuter ^10. Live avbildning ger oss möjlighet att fånga upp denna information i en tidskänsligt sätt, som annars är svårt att åstadkomma.

Den huvudsakliga begränsningen med denna teknik är att den kräver noggrann optimering av försöksbetingelser och mikroskop uppställningar. Det finns flera viktiga faktorer är avgörande för att framgångsrikt få bilder. Kvaliteter av fluorescerande protein (eller biosensor) utnyttjas för att visualisera de fagocyter (såsom F-aktin) såväl som naturen av färgämnet används för att märka det partikel är kritiska aspekter av avbildning. För levande avbildning, lika viktigt är utjämning av miljö kammare mikroskop setup. Beroende på instrumentet, kan jämvikts ta från 15 min till flera timmar. Siiou _CO2 leverans syftar till att bevara ett lämpligt pH i odlingsmedia, är det nödvändigt att tillåta tillräckligt runtime före inrättandet av experimentet. I de fall när CO ₂ tillförseln är otillräcklig och / eller ojämn, zwitterjoniska organisk kemikalie buffrande medel såsom HEPES kan kompletteras till tillväxtmediet. Långvarig exponering av fluorescerande partiklar och levande celler att konfokala lasrar kan leda till fototoxicitet och blekning. Optimera lasereffekt (den mindre exponeringstid desto bättre) och se till att luckorna är stängda mellan bildförvärv kan minska dessa problem. Sammantaget de tekniker som beskrivs här är idealiska för att studera det dynamiska förhållandet mellan patogener och fagocyter under fagocytos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108
Bovine serum albumin (BSA)	Cell Signaling Technology	9998
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	ThermoFisher	D3571
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	BP-231-1
DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium)	Gibco	11965
PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline)	Corning cellgro	21-031-CV
Fetal Bovine serum	Sigma Aldrich	12003C
FITC-coupled IgG-coated latex beads	Cayman	500290
L-Glutamine 200 mM (100x)	ThermoFisher	25030081
Paraformaldehyde Solution (4% in PBS)	Affymetrix	19943 1 LT
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)	ThermoFisher	15-140-122
Phalloidin-Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A12379
RAW 264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI (Roswell Park Memorial Institute)	Gibco	61870
Saponin	Sigma Aldrich	S7900
Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS)	Corning cellgro	MT25900CI
Trypsin-EDTA (1x) (0.05%)	ThermoFisher	25300054
Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution	ThermoFisher	85114
Zymosan-Alexa Fluor 594	ThermoFisher	Z23374
Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers)	ThermoFisher	155361
Glasstic slide 10 with grids	Hycor	87144