Introduction
Optogenetic værktøjer har vundet popularitet, dels fordi de kan anvendes til at dechifrere ledningsføring signalveje 1-4. De er baseret på evnen hos fotoaktiverbare proteiner til at ændre deres konformation og bindingsaffinitet, når det belyses med lys. Fusing disse proteiner til signalering elementer giver mulighed for den specifikke regulering af en enkelt spiller i komplekse intracellulære signalveje 5-12. Følgelig kan en signaleringsvej undersøges med høj tidsmæssig og rumlig opløsning.
De fleste cellebaserede optogenetic undersøgelser udnytte mikroskopi-baserede metoder kombineret med dyrkning i nærvær af lys, efterfulgt af biokemisk analyse 11,12. Derimod kan et flowcytometer singularizes celler langs en kapillær og måler cellestørrelse, granularitet og fluorescensintensiteter. Denne metode har store fordele i forhold til mikroskopi eller biokemiske metoder, herunder evnen til at analysere tusinde guldds af levende celler ved enkeltcelle-opløsning i en meget kort tid. Derfor er det ønskeligt at kombinere optogenetics med flowcytometri.
Til vores viden, er der ingen etableret protokol for optogenetic flowcytometri. En bredt accepteret procedure er at manuelt belyse celler udefra reaktionsrøret med lommelygte enheder. Imidlertid manuel belysning i strømmen kræver, cytometer lyset passere gennem reaktionsrøret og for levende celler, en cylindrisk, opvarmet vand kammer. Dette forårsager betydelig lysspredning og lystab. Desuden lysintensiteten billede ved manuel belysningen ikke reproducerbar mellem eksperimenter (vinkel, afstand osv), og der er en praktisk grænse for antallet af bølgelængder i et eksperiment.
Ved at konstruere LED Thermo Flow enhed, var vi i stand til at overvinde disse begrænsninger. Med denne enhed, kan celler belyses med specifikke bølgelængder i en tempratur-styret måde under flowcytometriske målinger. Dette giver mulighed for præcise og reproducerbare mængder af lys i og mellem eksperimenter.
For at demonstrere anvendeligheden af vores enhed in vivo, indspillede vi fluorescens signal om Dronpa i Ramos B-celler under photoswitching. Ramos B-celler afledt af et humant Burkitts lymfom. Dronpa er et fluorescerende protein, der eksisterer som en monomer, dimer eller tetramer. I sin monomere form, det er ikke-fluorescerende. Belysning med 400 nm lys inducerer dimerisation og tetrameriseringsdomæne og gør Dronpa protein fluorescerende. Denne proces kan vendes ved belysning med 500 nm lys. Den Dronpa proteinet er blevet anvendt til at styre funktionen og placeringen af signalproteiner 4,13.
Her udtrykte vi en Dronpa-linker-Dronpa protein i Ramos B-celler til at studere photoswitching af Dronpa i et flowcytometer. Ved hjælp af vores enhed, var vi i stand til effektivt ogreproducerbart photoswitch Dronpa mens du optager sin fluorescensintensitet i realtid. Denne metode giver betydelige fordele i forhold til de nuværende belysning protokoller med manuel belysning og betydeligt udvider den eksperimentelle repertoire for optogenetic værktøjer og bur forbindelser. Ved hjælp af vores enhed i væsentlig grad vil forenkle og fremskynde opdagelse og udvikling af nye optogenetic værktøjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Design og Opbygning af enheden
- pilotforsøg
BEMÆRK: Den krævede lysintensitet for en specifik optogenetic værktøj og celletype kan variere betydeligt. Pilotforsøg med prototyper er nyttige til at vurdere den minimale lysintensitet nødvendig. Den optogenetic værktøj bruges til følgende eksperimenter er en Dronpa-linker-Dronpa fusion konstruktion. Den Dronpa sekvens blev kommercielt opnået (se liste over materialer). En lang linker blev klonet ind mellem to Dronpa sekvenser for at tillade det udtrykte konstruktionen til dannelse intramolekylære (og intermolekylære) dimerer. De nedenfor beskrevne trin kan tilpasses til mange andre optogenetic værktøjer eller optisk kontrollerede stoffer.- Transducere Ramos B-lymfocytter med en Dronpa-linker-Dronpa indeholdende konstrukt i overensstemmelse med producentens instruktioner til transduktion under anvendelse af retroviral-holdige supernatant fra pakkeceller. Harvest og tæller celler efter en forudligere offentliggjort protokol 13.
- Resuspender cellerne i en koncentration på 1 x 10 6 / ml i medium (RPMI 1640, 10% varmeinaktiveret FCS, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 U / ml streptomycin og 50 uM 2-mercaptoethanol) og overføre dem til et glas FACS rør.
- Sæt røret i et flowcytometer og måle fluorescensintensiteten af Dronpa (GFP kanal) 14,15.
- Bær beskyttelsesbriller for alle yderligere skridt til at beskytte øjnene mod eventuelt skadelige bølgelængder.
- Manuelt placere en 500 nm LED lys på ydersiden af røret og fortsætte med at måle fluorescensintensiteten af Dronpa.
- Øge antallet og / eller intensiteten af de LED-lys, indtil falder Dronpa fluorescensintensitet.
- Manuelt placere en 400 nm LED lys på ydersiden af røret og fortsætte med at måle fluorescensintensiteten af Dronpa.
- Øge antallet og / eller intensiteten af de LED-lys, indtil Dronpa fluorescence intensiteten.
- Brug mindst lige så mange LED-lys til at bygge enheden som forudsagt at være nødvendige fra photoswitching i trin 1.1.5 og 1.1.7.
- Opbygning indretningen
BEMÆRK: Enheden blev bygget af en professionel bearbejdning shop, Arbeitsgruppe Technik fra universitetet i Freiburg. De fleste dele er specialfremstillet og ikke kommercielt tilgængelige. De nøjagtige dimensioner af hver del er afbildet i figur 1 og 2. For at tydeliggøre samlingen af denne enhed, er supplerende Video 1 forudsat, og de mest væsentlige skridt er beskrevet nedenfor.- Mølle stykke A fra polyvinylchlorid (PVC) med de nøjagtige mål er vist i figur 1A.
- Sæt LED-lys i de borede huller i stykke A og forsegle hver hul med PVC lim for at forhindre vandlækage.
- Tilslut LED'er til en multikanal transformer (hver bølgelængde bør have en særskilt kanaliel) med en justerbar udgangseffekt 0-29 mA.
- Fastgør den ydre kappe (B) med 3 skruer til stykke A som vist for at beskytte lysdioder fra fysiske skader.
- For at kunne tilslutte enheden til en vandpumpe, lim i røret clips (C) ind i de borede huller i stykke A (afbildet i figur 1a, tværsnit Y: 9 mm og 61,5 mm) ved hjælp af PVC lim.
- Skær en 58,5 mm lang plexiglas rør (D1).
- Fremstilling stykker D2 og D3 fra plexiglas som afbildet i figur 2.
- Lim stykke D3 til bunden af D1 med plexiglas lim.
- Vedhæft en gummi O-ring til stykke D2 og lim det til toppen af D1 med plexiglas lim.
BEMÆRK: Brikkerne D1, D2 og D3 sammen danner stykke D. - Sæt stykke D i stykke A med 3 skruer.
- Test enheden for vandlækage før påføring strøm til transformeren.
2. Måling af Kinetik af en optogenetic værktøj
- Kultur Ramos B-celler i RPMI-medium (RPMI 1640, 10% varmeinaktiveret FCS, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 U / ml streptomycin og 50 uM 2-mercaptoethanol) ved en densitet på 3- 10 x 10 6 celler / ml ved 37 ° C og 5% CO2.
- Harvest Ramos B-celler ved centrifugering ved 350 xg og 4 ° C i 5 minutter.
- Tæl celler ved hjælp af en Neubauer tællekammer efter producentens anvisninger og resuspender 1-5 x 10 6 celler i 600 uL medium.
- Overfør cellerne til et glas FACS rør, lægges på is og beskytte dem mod lys indtil målingen.
- Slut enheden til en opvarmet vandpumpe og justere temperaturen til 37 ° C.
- Ved brug af glas FACS rør ombytte den sorte O-ring af flowcytometeret med en gummi O-ring og desuden gælde silicium grlethed.
- Sæt forsigtigt glasset FACS rør ind i enheden, og tilslut den til flowcytometer (Figur 3).
- Start målingen og registrere Dronpa fluorescensintensitet (GFP kanal).
- Oplys celleprøven med 400 nm eller 500 nm lys henholdsvis og registrerer Dronpa fluorescensintensitet (GFP-kanal).
- Analyse af måledata med egnet flowcytometer software. Plot fremad scatter mod sidelæns scatter og gate levende celler. Plot Dronpa fluorescensintensitet over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brug af LED Thermo Flow med et flowcytometer
Den funktionelle kerne af anordningen er et cylindrisk kammer, hvor LED-lys er anbragt i en cirkulær måde peger indad. Dette kammer kan være forbundet til en forsyning og pumpe vand, der giver mulighed for at styre temperaturen af LED'erne, samt celleprøven. LED'erne er forbundet til en transformer og dermed lysintensiteten for hver bølgelængde kan styres individuelt. I midten af indretningen rumme en standard størrelse FACS rør, som kan forbindes til de fleste standard flowcytometre (figur 4 og 5). For at vise, at belysningen i vores enhed ikke fører til uønsket opvarmning af cellerne, vi målte temperaturen i oplyste PBS over tid (figur 6) for tre forskellige bølgelængder. Belysning med 360 nm, 400 nm eller 500 nm medfører kun enmarginal temperaturstigning. Samlet er indretningen præsenteres her muliggør reproducerbar belysning af temperaturstyrede celleprøver, der skal måles i et flowcytometer.
Photoswitching af Dronpa
En ekspressionsvektor der koder for et Dronpa-linker-Dronpa 13,16 fusionskonstruktion blev klonet og transduceres ind Ramos B-celler. Som afbildet i figur 7, var målet at kontrollere konformation af dette fusionsprotein med lys med specifikke bølgelængder. Ved hjælp af vores enhed blev den cytosoliske Dronpa-linker-Dronpa fusionsprotein photoswitched flere gange (figur 8, til venstre). Skift til den mørke tilstand sker langsomt, mens skifte til den lyse tilstand sker næsten øjeblikkeligt. Den spontane fluorescens genopretning af Dronpa i mørke, viser, at en effektiv photoswitching til den lyse form, kræver særlig belysning ogkun langsomt sker spontant (figur 8, til højre).
Vi udførte en kinetisk analyse af photoswitching egenskaber (figur 9). Pisterne for skifte kinetik blev beregnet for den oprindelige 4 min af belysning. Hældningen for spontan helbredelse blev beregnet for den oprindelige 4 minutter i mørke.
Den kinetiske analyse viser, at Dronpa photoswitching hastighed er generelt meget reproducerbar. I modsætning hertil spontan helbredelse af Dronpa fluorescens i mørke er meget ineffektiv. Selv efter længere inkubation i mørke, er kun omkring 10% af Dronpa fluorescens udvundet. Dette viser, at faktisk belysningen i vores enhed inducerer photoswitching.
Derfor bruger den beskrevne fremgangsmåde, kan vi skabe reel tid photoswitching data i et flowcytometer, som kanoversættes til en kinetisk evaluering af mange optogenetic værktøjer.
Figur 1: Konstruktion plan af det ydre lag. Alle afbildede stykker er specialfremstillede fra polyvinylchlorid (PVC). Piece A: Cylindrisk PVC stykke med borede huller til at indsætte lysdioder og rør klip. Piece B: Den ydre kappe til at beskytte LED'erne mod fysisk skade. Piece C: Røret klip, der forbinder det indre hulrum med gummi rør for at muliggøre vandkøling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Konstruktion plan af det indre lag. Alle afbildede stykker er lavet af plexiglas. Piece D: Dette stykke består af tre stykker D1, D2 og D3 og danner enheden omslutter FACS rør. Piece D1: Cylindrisk Plexiglas-rør. Piece D2: Bottom låg af det indre lag. Piece D3: Låg af det indre lag. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Brug af enhed med et flowcytometer. A1: Prøveåbning af et flowcytometer; A2: FACS rør forbundet til prøven indløb; B: Apparatet omslutter FACS rør; C: Prøve indløb; D: Prøve indløb med enheden.ove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Arbejdsgang skematisk af indretningen. A: Celler er belyst i indretningen (nederst til venstre) og samtidigt optages og analyseres i flowcytometeret (øverst til venstre). Dette tillader for eksempel, en analyse af de kinetiske egenskaber af et optogenetic værktøj (øverst til højre). B: tværsnit af indretningen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: flowdiagram over indretningen. En eller mor e LED lys specifikke bølgelængder belyse celleprøven i en FACS rør. LED'erne er omgivet af vand, som konstant udveksles af et opvarmet bad cirkulationspumpe for at holde temperaturen af celleprøven stabil. For levende celle eksperimenter temperaturen justeret til 37 ° C. Under denne temperatur-kontrollerede belysning celler optages i flowcytometeret til analyse. Denne opsætning tillader for eksempel, at analysere de kinetiske egenskaber af et optogenetic værktøj. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Temperatur på belyste PBS over tid. 1 ml PBS i et glas FACS rør blev belyst over tid med 360 nm lys, 400 nm lys eller 500 nm lys.upload / 54.707 / 54707fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Model for photoswitching af Dronpa-linker-Dronpa protein. Belysning med 400 nm lys vil dimerisere (og tetramerisere) Dronpa og gøre det fluorescerende. Belysning med 500 nm lys vil føre til adskillelse af de Dronpa proteiner, hvor monomere Dronpa er ikke-fluorescerende. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Karakterisering af Dronpa photoswitching egenskaber ved hjælp af LED Thermo Flow kombineret med f lav cytometri. Celler blev belyst som angivet ovenfor X-aksen og Dronpa gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) er afbildet over tid. Den Dronpa-linker-Dronpa fusionsprotein kan photoswitched flere gange bruger enheden (til venstre). Spontan genopretning af Dronpa fluorescensintensitet kun sker langsomt og ineffektivt (til højre). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Kinetic analyse af Dronpa photoswitching. Kinetikken for Dronpa photoswitching blev beregnet for den oprindelige 4 min. af belysning og opsvinget blev beregnet for den oprindelige 4 min. inkubation i mørke som angivet ved de farvede områder. Skråningerne for hver beregning er afbildet i fed skrift.ource.jove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig9large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LED Thermo Flow er en innovativ enhed til at studere optogenetic værktøjer i et flowcytometer.
Hidtil har optogenetic prøver blevet belyst kun med mikroskopi lasere eller lommelygte enheder 11,12. Afhængig af vinklen og afstanden af lommelygten til prøven forventes betydelig variation i mængden af belysning mellem eksperimenter. Desuden er der en grænse for antallet af lommelygter en enkelt person kan operere i et eksperiment. Dette begrænser den eksperimentelle repertoire og reproducerbarhed. Disse begrænsninger blev behandlet under udviklingen af vores enhed, som kan bruges til at karakterisere realtid photoswitching kinetik i levende celler. Så vidt vi ved, findes ikke nogen tilsvarende enhed.
I den aktuelle konfiguration, kan op til 30 lysdioder være indbygget i en Thermo strømningskammeret. Afhængig af de påkrævede lysintensiteter for hver bølgelængde, kan en enkelt anordning være osed til en bred vifte af optogenetic værktøjer. De etablerede photoswitching protokoller kan derefter optimeres til funktionelle udlæsninger, f.eks calcium flux målinger. Vores enhed kan være egnet til andre optisk kontrollerede stoffer, såsom bur forbindelser eller fotoaktiverbare fluoroforer.
Afhængig af den videnskabelige spørgsmål, og prøven anvendes, kan individualiserede protokoller etableres hurtigt. Det anbefales at bruge af glasrør i stedet for polystyren eller polypropylen rør til at begrænse lys-induceret cytotoksicitet bølgelængder mellem 400-500 nm. Alle testede cellelinier overlevede belysning (360 nm, 400 nm eller 500 nm) i op til en time i glasrør. Vi forsøgte at undersøge årsagen til celledød under belysning i plastrør ved at udføre overførsel eksperimenter. Vi belyste celler i PBS eller RPMI med lys af forskellige bølgelængder og derefter overført supernatanten til ikke-belyste celler til måling celledød. Ingen af de indsamledesupernatanter forårsagede betydelig celledød i recipientcellerne (data ikke vist). Også temperaturen af belyste PBS i polystyren eller polypropylenrør er næsten identisk med temperaturen i glasrør. Derfor kan vi kun spekulere på årsagen til celledød. Belyst plast kan frigive en ustabil stof eller stråling med en bølgelængde, der er toksisk for celler.
Valget af medium, der anvendes for hvert forsøg er vigtig. Bufferkapaciteten skal behandles og forskellige reagenser, som pH-indikatorer, absorbere forskellige bølgelængder i forskellige grader. Endvidere celleoverlevelse adskiller sig væsentligt, for eksempel, når man sammenligner FCS-free til FCS-holdige medier.
Målet med lys titrering er at anvende den minimale mængde lys nødvendig for maksimal photoswitching. For de fleste eksperimenter, er det fordelagtigt at maksimere hastigheden af photoswitch og dermed maksimere lysintensitet. Men afhængigt af wavelength og celletype, kan lys have direkte indvirkning på signalering adfærd, hvilket er grunden bør undgås overdreven belysning.
Det er muligt at programmere lys tidsplaner for vores enhed og til at tilslutte den til en computer som er almindeligt for andre lette enheder. , Da de fleste flowcytometre er i almindelige arbejdspladser deles af mange forskellige laboratorier, er det bedst at holde indretningen så lille og transportabel som muligt. Desuden manuel håndtering af vores enhed til en tofarvet setup som præsenteres her er så enkel, ville at programmeringen kun marginalt forbedre den eksperimentelle procedure.
Tilsammen præsenterer vi her et innovativt apparat, der kombinerer styrken af optogenetic værktøjer og flowcytometri. Dette vil væsentligt forenkle karakterisering og udvikling af optogenetic redskaber in vivo og udvide den eksperimentelle repertoire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12x75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
- Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T.
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
- Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
- Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898 (2015).
- Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925 (2014).
- Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
- Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
- Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
- Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Givan, A. L.
- Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).
