Introduction
Optogenetische gereedschappen zijn steeds populairder, mede omdat ze kunnen worden gebruikt om de bedrading van signaalwegen 1-4 ontcijferen. Zij zijn gebaseerd op het vermogen van activeerbare eiwitten om hun conformatie en bindingsaffiniteit veranderen wanneer verlicht met licht. Fuseren van deze eiwitten aan signalering elementen zorgt voor de specifieke regeling van een enkele speler binnen complexe intracellulaire signaalroutes 5-12. Bijgevolg kan een signaleringsroute worden bestudeerd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie.
De meeste cellen gebaseerde studies optogenetic gebruik microscopie gebaseerde methoden gecombineerd met kweken in de aanwezigheid van licht, gevolgd door biochemische analyse 11,12. Daarentegen een flowcytometer singularitseert cellen langs een capillaire en meet celgrootte en granulariteit fluorescentie-intensiteiten. Deze werkwijze heeft grote voordelen ten opzichte van microscopische of biochemische werkwijzen, waaronder de mogelijkheid duizend g analyserends van levende cellen bij eencellige resolutie in een zeer korte tijd. Daarom is het wenselijk om optogenetics combineren met flowcytometrie.
Voor zover wij weten, is er geen vastgesteld protocol voor optogenetic flowcytometrie. Een algemeen aanvaarde procedure handmatig cellen verlichten van buiten de reactiebuis met flitslicht apparaten. Echter, handmatige belichting in de stroom vereist cytometer het licht door de reactie buis te passeren en, voor live-cell imaging, een cilindrische, verwarmd waterreservoir. Dit veroorzaakt aanzienlijke lichtverstrooiing en lichtverlies. Bovendien, de lichtintensiteit door handmatige belichting niet reproduceerbaar tussen experimenten (hoek, afstand, etc.) en er een praktische grens aan het aantal golflengten in één experiment.
Door het construeren van de LED Thermo stromingsinrichting, waren we in staat om deze beperkingen te overwinnen. Met deze inrichting kunnen cellen worden verlicht met specifieke golflengten in een temp-Erature gecontroleerde wijze tijdens flowcytometrische metingen. Dit zorgt voor nauwkeurige en reproduceerbare hoeveelheden licht binnen en tussen experimenten.
Om het nut van onze inrichting in vivo te demonstreren, namen we het fluorescentiesignaal van Dronpa in Ramos B-cellen tijdens photoswitching. Ramos B-cellen zijn afgeleid van een menselijk Burkitt-lymfoom. Dronpa een fluorescent eiwit dat bestaat als een monomeer, dimeer of tetrameer. In zijn monomere vorm, niet-fluorescerend. Belichting met 400 nm licht induceert dimerisatie en tetramerisatie en maakt de Dronpa eiwit fluorescent. Dit proces kan door belichting met 500 nm licht. De Dronpa proteïne is gebruikt om de functie en locatie van signaaleiwitten 4,13 beheersen.
Hier, uitgedrukt we een Dronpa-Linker-Dronpa eiwit in Ramos B-cellen photoswitching van Dronpa bestuderen in een flowcytometer. Met behulp van onze apparaat, waren we in staat om efficiënt enreproduceerbaar PHOTOSWITCH Dronpa tijdens het opnemen van de fluorescentie-intensiteit in real time. Deze methode biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van de huidige verlichting protocollen met handmatige belichting en aanzienlijk verbreedt de experimentele repertoire voor optogenetic gereedschappen en kooi verbindingen. Met behulp van onze apparaat zal aanzienlijk vereenvoudigen en versnellen van de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe optogenetische gereedschappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het ontwerpen en bouwen van de Device
- Pilot Experimenten
LET OP: De vereiste lichtsterkte voor een bepaalde optogenetische gereedschap en celtype kunnen aanzienlijk verschillen. Pilot experimenten met prototypes zijn nuttig om de minimale lichtintensiteit nodig te schatten. Optogenetic het instrument voor de volgende experimenten is Dronpa-Linker-Dronpa fusieconstruct. De Dronpa sequentie werd in de handel verkregen (zie lijst van Materials). Een lange linker werd gekloneerd tussen twee Dronpa sequenties om de expressie construct intramoleculaire (en intermoleculaire) dimeren. De hieronder beschreven stappen kunnen worden aangepast aan vele andere optogenetic gereedschappen of optisch gereguleerde stoffen.- Transduceren Ramos B-lymfocyten met een Dronpa-Linker-Dronpa construct bevattende de instructies van de fabrikant voor transductie met de retrovirale-bevattende supernatant van verpakkingscellen. Oogst en tellen cellen volgens een voorafviously gepubliceerd protocol 13.
- Resuspendeer cellen bij een concentratie van 1 x 10 6 / ml in medium (RPMI 1640, 10% door warmte geïnactiveerd FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 U / ml streptomycine, en 50 pM 2-mercaptoethanol) en overbrengen naar een glazen FACS buis.
- Steek de buis in een flowcytometer en het meten van de fluorescentie-intensiteit van Dronpa (GFP kanaal) 14,15.
- Draag beschermende bril voor alle verdere stappen om de ogen te beschermen tegen mogelijk schadelijke golflengten.
- Handmatig op een 500 nm LED aan de buitenzijde van de buis en verder het meten van de fluorescentie-intensiteit van Dronpa.
- Toename van het aantal en / of de intensiteit van de LED-verlichting tot Dronpa fluorescentie-intensiteit afneemt.
- Handmatig op een 400 nm LED aan de buitenzijde van de buis en verder het meten van de fluorescentie-intensiteit van Dronpa.
- Toename van het aantal en / of de intensiteit van de LED-verlichting tot de Dronpa fluocerend intensiteit toeneemt.
- Gebruik minstens evenveel LED bouw van het apparaat zoals voorspeld noodzakelijk te zijn van de photoswitching stapsgewijs 1.1.5 en 1.1.7.
- Het bouwen van het apparaat
LET OP: Het apparaat is gebouwd door een professionele machinale winkel, de Arbeitsgruppe Technik van de Universiteit van Freiburg. De meeste onderdelen zijn op maat gemaakt en niet in de handel verkrijgbaar. De exacte afmetingen van elk deel zijn weergegeven in figuren 1 en 2. Om de montage van dit apparaat te verduidelijken, Aanvullende Video 1 is aangebracht en de meest essentiële stappen worden hierna beschreven.- Molen piece A uit polyvinylchloride (PVC) met de exacte maten figuur 1A.
- Steek LED-verlichting in de gaten van het werk A en verzegelt elk gat met PVC lijm om water lekkage te voorkomen.
- Sluit LEDs naar een multichannel transformator (elke golflengte moet een aparte chann bezettenel) met een verstelbare uitgangsvermogen 0-29 mA.
- Bevestig de buitenmantel (B) met 3 schroeven piece A zoals getoond om de LED's te beschermen tegen fysieke schade.
- In staat zijn om het apparaat te verbinden met een waterpomp, lijm in de buis clips (C) in de gaten van het stuk A (weergegeven in figuur 1a, doorsnede Y: 9 mm en 61,5 mm) met behulp van PVC lijm.
- Snijd een 58,5 mm lang Plexiglas buis (D1).
- Vervaardiging stukken D2 en D3 van plexiglas zoals weergegeven in figuur 2.
- Lijm stuk D3 naar de bodem van D1 met plexiglas lijm.
- Bevestig een rubberen O-ring stuk D2 en lijm het aan de top van de D1 met plexiglas lijm.
LET OP: De stukken D1, D2 en D3 vormen samen stuk D. - Inzetstuk D in stuk A met 3 schroeven.
- Test de inrichting voor waterlekkage voordat de stroom naar de transformator.
2. Het meten van de kinetiek van een optogenetische Tool
- Cultuur Ramos B-cellen in RPMI-medium (RPMI 1640, 10% door warmte geïnactiveerd FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 U / ml streptomycine, en 50 pM 2-mercaptoethanol) bij een dichtheid van 3- 10 x 10 6 cellen / ml bij 37 ° C en 5% CO2.
- Oogst Ramos B-cellen door centrifugatie bij 350 xg en 4 ° C gedurende 5 minuten.
- Aantal cellen met behulp van een Neubauer telkamer volgens de instructies van de fabrikant en resuspendeer 1-5 x 10 6 cellen in 600 pl medium.
- Overdracht van de cellen om een glazen FACS buis, leg ze op ijs en hen te beschermen tegen licht tot de meting.
- Sluit het apparaat aan een verwarmde waterpomp en de temperatuur op 37 ° C.
- Bij het gebruik van glazen FACS buizen, wisselen de zwarte O-ring van de flowcytometer met een rubberen O-ring en bovendien passen silicium grgemak.
- Steek de glazen FACS buis in het apparaat en sluit deze aan op de flowcytometer (figuur 3).
- Start de meting en noteer Dronpa fluorescentie-intensiteit (GFP kanaal).
- Verlichten de cel monster met 400 nm of 500 nm licht respectievelijk en noteer de Dronpa fluorescentie-intensiteit (GFP kanaal).
- Analyseer experimentele gegevens met geschikte software flowcytometer. Plot voorwaartse verstrooiing tegen zijwaartse scatter en de poort van de levende cellen. Zet de Dronpa fluorescentie-intensiteit in de tijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de LED Thermo Flow met een flowcytometer
De functionele kern van de inrichting een cilindrische kamer waarin LED-lampen zijn in een cirkelvormig naar binnen gerichte wijze. Deze kamer kan worden verbonden met een watertoevoer en de pomp, die het mogelijk maakt de temperatuur van de LED's, evenals het celmonster. De LED's zijn aangesloten op een transformator en derhalve de lichtsterkte van elke golflengte kan individueel worden geregeld. Het midden van het apparaat voorziet een standaard formaat FACS buis, die kan worden aangesloten op de meeste standaard flowcytometers (figuren 4 en 5). Die verlichting in onze apparaat niet leidt tot ongewenste opwarming van de cellen vertonen, maten we de temperatuur van verlichte PBS tijd (figuur 6) voor drie verschillende golflengten. Belichting met 360 nm, 400 nm of 500 nm leidt tot slechtsmarginale temperatuurstijging. Kortom, de inrichting hier gepresenteerde maakt de reproduceerbare verlichting van temperatuurgeregelde celmonsters te meten in een stroomcytometer.
Photoswitching van Dronpa
Een expressievector coderend voor een Dronpa-Linker-Dronpa 13,16 fusieconstruct werd gekloneerd en getransduceerd in Ramos B-cellen. Zoals weergegeven in figuur 7, het doel was om de conformatie van het fusie-eiwit onder controle met licht met specifieke golflengten. Met onze inrichting werd de cytosolische Dronpa-Linker-Dronpa fusieproteïne meerdere malen photoswitched (Figuur 8, links). Overschakelen naar de donkere toestand optreedt langzaam, terwijl de overstap naar de heldere toestand gebeurt vrijwel onmiddellijk. De spontane fluorescentie herstel van Dronpa in het donker laat zien dat efficiënte photoswitching naar de heldere vorm vereist specifieke verlichting enslechts langzaam gebeurt spontaan (Figuur 8, rechts).
We hebben een kinetische analyse van de photoswitching eigenschappen (Figuur 9). De hellingen van de schakelmiddelen kinetiek werden berekend voor de eerste 4 min van verlichting. De helling van het spontane herstel werd berekend voor de eerste 4 minuten in het donker.
De kinetische analyse blijkt, dat de Dronpa photoswitching snelheid is over het algemeen zeer reproduceerbaar. In tegenstelling tot spontaan herstel van Dronpa fluorescentie in het donker is zeer inefficiënt. Ook na langere incubatie in het donker, wordt slechts ongeveer 10% van de fluorescentie Dronpa teruggewonnen. Dit toont aan dat inderdaad de verlichting in onze apparaat induceert photoswitching.
Dus, door de beschreven werkwijze, zijn de reële tijd genereren photoswitching gegevens in een stroomcytometer, die kanworden vertaald in een kinetische evaluatie van vele optogenetic gereedschappen.
Figuur 1: plan van de bouw van de buitenste laag. Alle afgebeelde stukken zijn op maat gemaakt van polyvinylchloride (PVC). Stuk A: cilindrische PVC stuk met geboorde gaten om LED's en de buis clips in te voegen. Stuk B: De buitenmantel om de LED's te beschermen tegen fysieke schade. Stuk C: De buis clip die de inwendige holte met rubberen buizen verbindt om voor waterkoeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: plan van de bouw van de binnenste laag. Alle afgebeelde stukken zijn gemaakt van plexiglas. Stuk D: Dit stuk bestaat uit drie delen D1, D2 en D3 en vormt het toestel omsluit de FACS buis. Stuk D1: cilindrische Plexiglas buis. Stuk D2: bodemdeksel van de binnenlaag. Stuk D3: Deksel van de binnenlaag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gebruik van het apparaat met een flowcytometer. A1: Monsterinvoer van een stroom cytometer; A2: FACS buis aangesloten op de monsterinlaat; B: Het apparaat bijvoeging van de FACS buis; C: Monsterinvoer; D: Monsterinvoer met het apparaat.ove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: schematische werkstroom van de inrichting. A: Cellen worden verlicht in de inrichting (linksonder) en gelijktijdig opgenomen en in de flowcytometer geanalyseerd (linksboven). Hierdoor kan bijvoorbeeld de analyse van de kinetische eigenschappen van een optogenetic gereedschap (rechtsboven). B: doorsnede van de inrichting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Process Flow Diagram van het apparaat. Een of mor e LED-verlichting van specifieke golflengten verlichten de cel monster in een FACS buis. De LED's worden omringd door water, die voortdurend wordt uitgewisseld door een verwarmingsbad circulator om de temperatuur van het celmonster stabiel. Voor live cell experimenten wordt de temperatuur ingesteld op 37 ° C. Tijdens deze geconditioneerde belichting worden de cellen opgenomen in de flowcytometer voor analyse. Deze opstelling laat bijvoorbeeld de kinetische eigenschappen van een instrument optogenetic analyseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Temperatuur van verlichte PBS tijd. 1 ml PBS in een glazen FACS buis werd verlicht in de tijd met 360 nm licht, 400 nm licht of 500 nm licht.uploaden / 54707 / 54707fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Model voor photoswitching van de Dronpa-Linker-Dronpa eiwit. Belichting met 400 nm licht zal dimeriseren (en tetrameer) Dronpa en maken het fluorescerend. Belichting met 500 nm licht leidt tot de dissociatie van het Dronpa eiwitten, waarbij monomeer Dronpa niet-fluorescerend. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Karakterisering van de Dronpa photoswitching eigenschappen met behulp van de LED Thermo Flow gecombineerd met f lage cytometrie. Cellen werden belicht vanaf boven de X-as getoond en de Dronpa gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) wordt afgebeeld in de tijd. De Dronpa-Linker-Dronpa fusie-eiwit kan meerdere malen worden photoswitched gebruik van het apparaat (links). Spontaan herstel van de Dronpa fluorescentie-intensiteit komt slechts langzaam en inefficiënt (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Kinetische analyse van Dronpa photoswitching. De kinetiek van Dronpa photoswitching werden berekend voor de eerste 4 min. van verlichting en het herstel werd berekend voor de eerste 4 min. incubatie in het donker als aangegeven door de kleurvlakken. De pistes voor elke berekening zijn weergegeven in vet nummers.ource.jove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig9large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De LED Thermo Flow is een innovatief apparaat om optogenetic gereedschappen studeren in een flowcytometer.
Tot nu toe hebben optogenetic monsters werden alleen verlicht met microscopie lasers of zaklamp apparaten 11,12. Afhankelijk van de hoek en de afstand van de zaklamp om het monster wordt aanzienlijke verschillen in de hoeveelheid belichting verwacht tussen experimenten. Verder is er een limiet aan het aantal zaklampen een persoon kan werken in een experiment. Dit beperkt de experimentele repertoire en reproduceerbaarheid. Deze beperkingen kwamen tijdens de ontwikkeling van de inrichting, die kan worden gebruikt om realtime photoswitching kinetiek karakteriseren levende cellen. Voor zover wij weten, geen vergelijkbare apparaat bestaat.
In de huidige configuratie, kan maximaal 30 LED's worden ingebouwd in een Thermo Flow kamer. Dus afhankelijk van de vereiste lichtintensiteit voor elke golflengte, een enkel apparaat kan onsed voor diverse optogenetic gereedschappen. De gevestigde protocollen photoswitching kan dan worden geoptimaliseerd voor functionele uitlezing, bijvoorbeeld calcium flux metingen. De inrichting kan geschikt zijn voor andere optische gereguleerde stoffen, zoals gekooide verbindingen of activeerbare fluoroforen.
Afhankelijk van de wetenschappelijke vraagstelling en specimen gebruikt, kan geïndividualiseerde protocollen snel worden vastgesteld. Het gebruik van glazen buizen in plaats van polystyreen of polypropyleen buizen aanbevolen door licht geïnduceerde cytotoxiciteit beperken golflengte van 400-500 nm. Alle geteste cellijnen overleefden belichting (360 nm, 400 nm of 500 nm) gedurende één uur in glazen buizen. We hebben geprobeerd om de oorzaak van celdood tijdens de belichting in plastic buizen te onderzoeken door het uitvoeren van de overdracht experimenten. We verlichte cellen in PBS of RPMI met licht van verschillende golflengtes en de supernatant overgebracht naar niet-verlichte cellen om celdood te meten. Geen van de verzameldesupernatanten tot aanzienlijke celdood in de ontvangende cellen (gegevens niet getoond). Ook de temperatuur van verlichte PBS in polystyreen of polypropyleen buizen is vrijwel identiek aan de temperatuur in glazen buizen. Daarom kunnen we slechts speculeren over de oorzaak van celdood. Verlicht kunststof kan een onstabiele stof of straling met een golflengte die toxisch voor cellen geven.
De keuze van de drager gebruikt voor elk experiment is belangrijk. De buffercapaciteit moet worden beschouwd en verschillende reagentia, zoals pH-indicatoren, absorberen verschillende golflengten in verschillende mate. Bovendien celoverleving aanzienlijk afwijkt, bijvoorbeeld bij de vergelijking FCS-vrij FCS-bevattende media.
Het doel van licht titratie is de minimale hoeveelheid licht die nodig is voor maximale photoswitching gebruiken. Voor de meeste experimenten, is het gunstig om de snelheid van de photoswitch maximaliseren en daardoor de maximale lichtintensiteit. Maar afhankelijk van de wavelength en celtype, kan licht directe effecten op de signaalgedrag en daarom buitensporige verlichting moeten worden vermeden zijn.
Het is mogelijk om licht schema's voor ons apparaat te programmeren en te verbinden met een computer zoals gebruikelijk is voor andere op basis van gas. Aangezien de meeste flowcytometers worden algemeen werkplaatsen gedeeld door veel verschillende laboratoria, is het het beste om de inrichting handhaven klein en draagbaar mogelijk. Bovendien, het manueel hanteren van ons apparaat voor een twee-color setup zoals hier wordt gepresenteerd is zo simpel, zou dat de programmering slechts marginaal verbeteren van de experimentele procedure.
Samengenomen, geven we hier een innovatieve inrichting, die de kracht van optogenetic gereedschappen combineert en flowcytometrie. Dit betekent een aanzienlijke vereenvoudiging van de karakterisering en de ontwikkeling van optogenetic instrumenten in vivo en uitbreiden van de experimentele repertoire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12x75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
- Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T.
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
- Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
- Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898 (2015).
- Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925 (2014).
- Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
- Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
- Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
- Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Givan, A. L.
- Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).
