Introduction
Optogenetische Werkzeuge wurden an Popularität gewinnt, zum Teil , weil sie verwendet werden können , die Verdrahtung von Signal 1-4 Wege zu entziffern. Sie basieren auf der Fähigkeit von photoaktivierbaren Proteine anhand ihrer Konformation und Bindungsaffinität zu ändern, wenn sie mit Licht bestrahlt. Fusing diese Proteine Signalelemente ermöglicht die spezielle Regelung eines einzelnen Spielers in komplexen intrazellulären Signalwege 5-12. Folglich kann ein Signalweg mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung untersucht werden.
Die meisten zellbasierten optogenetische Studien verwenden Mikroskopie-basierten Methoden mit Kultivierungs kombiniert in Gegenwart von Licht, 11,12 durch biochemische Analyse verfolgt. Im Gegensatz dazu Zytometer ein Fluss singularizes Zellen entlang einer Kapillare und misst Zellgröße, Granularität und Fluoreszenzintensitäten. Dieses Verfahren hat wesentliche Vorteile gegenüber der Mikroskopie oder biochemische Methoden, einschließlich der Fähigkeit zu analysieren thousands von Zellen bei Single-Cell-Auflösung in einer sehr kurzen Zeit zu leben. Daher ist es wünschenswert Optogenetik mit Durchflusszytometrie zu kombinieren.
Unseres Wissens gibt es kein anerkanntes Protokoll für optogenetische Durchflusszytometrie. Ein breit akzeptiertes Verfahren ist die manuelle Zellen von außerhalb des Reaktionsrohres mit Taschenlampe Geräte beleuchten. Allerdings erfordert eine manuelle Beleuchtung im Durchflusszytometer das Licht durch das Reaktionsrohr zu passieren, und für Live Cell Imaging, eine zylindrische, beheizte Wasserkammer. Dies führt zu einer wesentlichen Lichtstreuung und Lichtverlust. Außerdem ist die Lichtintensität durch manuelle Beleuchtung vorgesehen nicht reproduzierbar zwischen den Experimenten (Winkel, Abstand, etc.) und es gibt eine praktische Grenze für die Anzahl von Wellenlängen in einem Experiment.
die LED-Thermo Flow-Gerät Durch die Konstruktion, wir waren in der Lage, diese Einschränkungen zu überwinden. Mit diesem Gerät können die Zellen mit spezifischen Wellenlängen in einem temporären beleuchtbareratur gesteuert während der Messungen durchflusszytometrischen. Dies ermöglicht eine präzise und reproduzierbare Lichtmengen innerhalb und zwischen den Experimenten.
Um die Nützlichkeit unseres Gerätes in vivo zeigen, nahmen wir das Fluoreszenzsignal von Dronpa in Ramos B - Zellen während der Photoschalten . Ramos-B-Zellen von einem humanen Burkitt-Lymphom abgeleitet. Dronpa ein fluoreszierendes Protein, das als ein Monomer, Dimer oder Tetramer vorliegt. In seiner monomeren Form ist es nicht fluoreszierend. Beleuchtung mit 400 nm-Licht induziert die Dimerisierung und Tetramerisierung und macht das Dronpa Protein fluoreszierend. Dieser Prozess kann durch Beleuchtung mit Licht von 500 nm umgekehrt werden. Das Dronpa Protein verwendet worden ist, die Funktion und Position zu steuern Signalproteinen 4,13.
Hier ausgedrückt wir eine Dronpa-Linker-Dronpa Protein in Ramos-B-Zellen Photoschaltbarkeit von Dronpa in einem Durchflusszytometer zu studieren. Mit unserem Gerät waren wir in der Lage, effizient undreproduzierbar Photoschalter Dronpa während in Echtzeit die Aufnahme seiner Fluoreszenzintensität. Dieses Verfahren bietet wesentliche Vorteile gegenüber aktuellen Beleuchtungs Protokolle mit manueller Beleuchtung und erweitert signifikant das experimentelle Repertoire für optogenetische Werkzeuge und Käfigverbindungen. Mit unserem Gerät die Entdeckung und Entwicklung von neuartigen optogenetische Werkzeuge erheblich vereinfachen und beschleunigen.
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Protocol
1. Planung und Aufbau der Vorrichtung
- Pilotversuche
HINWEIS: Die erforderliche Lichtintensität für eine bestimmte optogenetische Werkzeug und Zelltyp kann erheblich variieren. Pilotversuche mit Prototypen sind nützlich, notwendig, um die minimale Lichtintensität zu schätzen. Die optogenetische Werkzeug für die folgenden Experimente verwendet wird, ist ein Dronpa-Linker-Dronpa Fusionskonstrukt. Die Dronpa Sequenz wurde im Handel erhältlich (siehe Liste der Materialien). Ein langer Linker wurde zwischen zwei Dronpa Sequenzen kloniert in das exprimierte Konstrukt zu ermöglichen intramolekulare (und intermolekular) Dimere zu bilden. Die nachfolgend beschriebenen Schritte können zu vielen anderen optogenetische Werkzeuge oder optisch kontrollierten Substanzen angepasst werden.- Transduzieren Ramos-B-Lymphozyten mit einem Dronpa-Linker-Dronpa enthaltenden Konstrukt nach den Anweisungen des Herstellers für die Transduktion von Verpackungszellen, die retroviral-enthaltende Überstand verwendet wird. Ernte und Zählen von Zellen nach einem vorherviously veröffentlichten Protokoll 13.
- Die Zellen in einer Konzentration von 1 x 10 6 / ml in Medium (RPMI 1640, 10% hitzeinaktiviertem FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 U / ml Streptomycin und 50 uM 2-Mercaptoethanol) und sie auf einem Glas FACS-Röhrchen.
- Legen Sie das Rohr in einem Durchflusszytometer und messen die Fluoreszenzintensität von Dronpa (GFP - Kanal) 14,15.
- Schutzbrille tragen für alle weiteren Schritte von möglicherweise schädlichen Wellenlängen Augen zu schützen.
- Stellen Sie manuell eine 500 nm LED-Licht auf der Außenseite des Rohres und auch weiterhin die Fluoreszenzintensität von Dronpa messen.
- Erhöhen Sie die Anzahl und / oder Intensität der LED-Leuchten bis Dronpa Fluoreszenzintensität abnimmt.
- Stellen Sie manuell eine 400 nm LED-Licht auf der Außenseite des Rohres und auch weiterhin die Fluoreszenzintensität von Dronpa messen.
- Erhöhen Sie die Anzahl und / oder Intensität der LED-Leuchten bis zum Dronpa FluoFluoreszenz Intensität zunimmt.
- Verwenden Sie mindestens so viele LED-Leuchten für den Aufbau der Vorrichtung als vorhergesagt erforderlich sein, von den Photoschalten in den Schritten 1.1.5 und 1.1.7.
- Der Aufbau des Gerätes
HINWEIS: Das Gerät wird von einem professionellen Bearbeitungswerkstatt, der Arbeitsgruppe Technik der Universität Freiburg gebaut wurde. Die meisten Teile sind kundenspezifisch und nicht im Handel erhältlich. Die genauen Abmessungen der einzelnen Teile sind in den 1 und 2 dargestellt. Um die Montage dieser Vorrichtung zu verdeutlichen, wird Ergänzungs Video 1 vorgesehen ist und die wesentlichsten Schritte werden nachfolgend beschrieben.- Mühle Stück A aus Polyvinylchlorid (PVC) mit den genauen Maßen in 1A gezeigt.
- Legen Sie LED-Leuchten in die Bohrungen des Stückes A und versiegeln jedes Loch mit PVC-Kleber Wasseraustritt zu verhindern.
- Schließen Sie LEDs auf einen Mehrkanal-Transformator (jede Wellenlänge sollte eine separate chann besetzenel) mit einer einstellbaren Ausgangsleistung von 0 bis 29 mA.
- Bringen Sie die äußere Hülle (B) mit 3 Schrauben an einem Stück, wie dargestellt, um die LEDs vor Beschädigung zu schützen.
- Um das Gerät mit einer Wasserpumpe, Leim in den Rohrschellen (C) in die Bohrungen des Stückes A (dargestellt in 1a, Querschnitt Y: 9 mm und 61,5 mm) zu verbinden mit PVC - Kleber.
- Schneiden Sie ein 58,5 mm lange Plexiglasröhre (D1).
- Herstellung Stücke D2 und D3 aus Plexiglas , wie in Abbildung 2 dargestellt.
- Klebestück D3 auf den Boden des D1 mit Plexiglas Klebstoff.
- Bringen Sie einen Gummi-O-Ring zu Stück D2 und kleben Sie es an die Spitze der D1 mit Plexiglas Klebstoff.
HINWEIS: Die Stücke D1, D2 und D3 zusammen Stück D. bilden - Einsatzstück D in Stück A mit 3 Schrauben.
- Testen Sie das Gerät für Wasserleck vor der Leistung an den Transformator anzuwenden.
2. Messung der Kinetik eines optogenetische Werkzeug
- Kultur Ramos-B-Zellen in RPMI-Medium (RPMI 1640, 10% hitzeinaktiviertem FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 U / ml Streptomycin und 50 uM 2-Mercaptoethanol) bei einer Dichte von 3- 10 x 10 6 Zellen / ml bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Ernte Ramos-B-Zellen durch Zentrifugation bei 350 xg und 4 ° C für 5 min.
- Zählen von Zellen unter Verwendung einer Neubauer - Zählkammer nach den Anweisungen des Herstellers und resuspendieren 1-5 x 10 6 Zellen in 600 & mgr; l Medium.
- Übertragen Sie die Zellen in ein Glas FACS-Röhrchen, legte sie auf Eis und schützen sie vor Licht, bis die Messung.
- Schließen Sie das Gerät auf eine beheizte Wasserpumpe und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C.
- Wenn Glas FACS-Röhrchen verwenden, tauschen Sie den schwarzen O-Ring des Durchflusszytometer mit einem Gummi-O-Ring und zusätzlich Silizium gr geltenLeichtigkeit.
- Setzen Sie vorsichtig das Glas FACS - Röhrchen in das Gerät und verbinden Sie es mit dem Durchflusszytometer (Abbildung 3).
- Starten Sie die Messung und Aufzeichnung Dronpa Fluoreszenzintensität (GFP-Kanal).
- Illuminate der Zellprobe mit 400 nm oder 500 nm Licht jeweils und notieren Sie die Dronpa Fluoreszenzintensität (GFP-Kanal).
- Analysieren experimentellen Daten mit geeigneten Durchflusszytometer Software. Plot Vorwärtsstreuung gegen Seitwärtsstreuung und Gate die lebenden Zellen. Zeichnen Sie die Dronpa Fluoreszenzintensität über die Zeit.
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Representative Results
Mit der LED-Thermo Fluss mit einem Durchflusszytometer
Die funktionelle Kern der Vorrichtung ist eine zylindrische Kammer, in der LED-Leuchten in einer kreisförmigen Weise angeordnet sind nach innen gerichtet. Diese Kammer kann mit einer Wasserversorgung und der Pumpe verbunden sein, der zur Steuerung der Temperatur der LEDs sowie der Zellprobe ermöglicht. Die LEDs sind an einen Transformator angeschlossen ist und somit die Lichtintensität für jede Wellenlänge kann individuell gesteuert werden. Das Zentrum des Geräts befinden sich eine Standardgröße FACS - Röhrchen, die für die meisten Standard - Durchflusszytometer angeschlossen werden können (Abbildungen 4 und 5). Um diese Beleuchtung in unserem Gerät zeigt nicht zu einer unerwünschten Erwärmung der Zellen führen, maßen wir die Temperatur des beleuchteten PBS über die Zeit (Abbildung 6) für drei verschiedene Wellenlängen. Beleuchtung mit 360 nm, 400 nm oder 500 nm führt nur zu einerRandtemperaturanstieg. Insgesamt präsentiert das Gerät hier ermöglicht die reproduzierbare Beleuchtung von temperaturgesteuerten Zellproben auf im Durchflusszytometer gemessen werden.
Photoschalten von Dronpa
Ein Expressionsvektor eine Dronpa-Linker-Dronpa 13,16 Fusionskonstrukt kodiert , wurde kloniert und transduziert in Ramos B - Zellen. Wie in Figur 7 dargestellt, war das Ziel mit Licht bestimmter Wellenlängen , die Konformation des Fusionsproteins zu steuern. Mit unserem Gerät wurde die cytosolische Dronpa-Linker-Dronpa Fusionsproteins mehrere Male (Abbildung 8, links) photoswitched. Umschalten in den dunklen Zustand tritt langsam, während an den hellen Schaltzustand fast augenblicklich geschieht. Die spontane Fluoreszenz Erholung von Dronpa im Dunkeln zeigt, dass eine effiziente Photoschaltung an die helle Form erfordert spezielle Beleuchtung undnur langsam erfolgt spontan (Abbildung 8, rechts).
Wir führten eine kinetische Analyse der Photoschaltbarkeit Eigenschaften (Abbildung 9). Die Pisten für die Schalt Kinetik wurden für die anfängliche 4 min der Beleuchtung berechnet. Die Steigung für die spontane Erholung wurde für den ersten 4 min im Dunkeln berechnet.
Die kinetische Analyse zeigt, dass die Dronpa Photoschaltbarkeit Geschwindigkeit insgesamt sehr reproduzierbar ist. Im Gegensatz dazu ist die spontane Erholung der Dronpa Fluoreszenz im Dunkeln sehr ineffizient. Auch nach längerer Inkubation im Dunkeln, nur etwa 10% der Dronpa Fluoreszenz gewonnen wird. Dies zeigt, dass in der Tat die Beleuchtung in unserem Gerät induziert Photoschaltung.
Daher ist die beschriebene Methode verwenden, können wir in Echtzeit erzeugen Photoschaltbarkeit Daten im Durchflusszytometer, demwerden in eine kinetische Auswertung vieler optogenetische Werkzeuge übersetzt.
Abbildung 1: Aufbauplan der äußeren Schicht. Alle gezeigten Stücke sind speziell aus Polyvinylchlorid (PVC). Stück A: Zylindrische PVC Stück mit Bohrungen LEDs und die Schlauchschellen einzufügen. Stück B: Der Außenmantel die LEDs vor Beschädigung zu schützen. Stück C: Der Tube - Clip, der den inneren Hohlraum mit Gummischläuchen verbindet für eine Wasserkühlung zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Aufbauplan der inneren Schicht. Alle abgebildeten Stücke sind aus Plexiglas gefertigt. Stück D: Dieses Stück besteht aus drei Teilen D1, D2 und D3 und bildet die Einheit die FACS Rohr umschließt. Stück D1: Zylindrische Plexiglasröhre. Stück D2: Untere Deckel der inneren Schicht. Stück D3: Deckel der inneren Schicht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Verwenden Sie das Gerät mit einem Durchflusszytometer. A1: Probeneinlass eines Durchflusszytometer; A2: FACS Rohr mit dem Probeneinlaß verbunden ist ; B: Die Einrichtung mit dem FACS - Röhrchen umschließt; C: Probeneinlass; D: Probeneinlass mit dem Gerät.ove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Workflow schematische Darstellung der Vorrichtung. A: Die Zellen werden in der Vorrichtung (unten links) beleuchtet und gleichzeitig aufgenommen und im Durchflußzytometer (links oben) analysiert. Dies ermöglicht es, beispielsweise die Analyse der kinetischen Eigenschaften eines optogenetische Werkzeug (oben rechts). B: Querschnitt des Gerätes. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Prozessflussdiagramm des Gerätes. Ein oder mor e LED-Leuchten von spezifischen Wellenlängen beleuchten in einem FACS-Röhrchen die Zellprobe. Die LEDs werden von Wasser umgeben ist, die ständig durch ein erwärmtes Bad Zirkulator ausgetauscht wird, die Temperatur der Zellprobe stabil zu halten. Für lebende Zelle Experimenten wird die Temperatur auf 37 ° C eingestellt. Während dieser temperaturgesteuerten Beleuchtung werden die Zellen in das Durchflusszytometer für die Analyse aufgenommen. Dieser Aufbau ermöglicht es, beispielsweise die kinetischen Eigenschaften eines optogenetische Werkzeug zu analysieren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Die Temperatur des beleuchteten PBS über die Zeit. 1 ml PBS in einem Glasrohr FACS wurde über die Zeit mit 360 nm Licht belichtet, 400 nm-Licht oder Licht von 500 nm.laden / 54707 / 54707fig6large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7: Modell für die Photoisomerisierung des Dronpa-Linker-Dronpa Protein. Beleuchtung mit 400 nm Licht dimerisieren (und tetramerize) Dronpa und machen es fluoreszierend. Beleuchtung mit Licht von 500 nm wird auf die Dissoziation der Dronpa Proteine führen, wo monomeren Dronpa ist nicht fluoreszierend. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8: Charakterisierung der Dronpa Photoschaltbarkeit Eigenschaften der LED - Thermo Flow - Verwendung mit f kombiniert Low-Zytometrie. Zellen wurden über der X-Achse und die Dronpa mittlere Fluoreszenzintensität (MFI), wie angegeben beleuchtet wird über die Zeit dargestellt. Die Dronpa-Linker-Dronpa Fusionsprotein kann mehrmals mit dem Gerät (links) photoswitched werden. Spontane Erholung der Dronpa Fluoreszenzintensität tritt nur langsam und uneffizient (rechts). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 9: Die kinetische Analyse von Dronpa Photoschaltbarkeit. Die Kinetik der Dronpa Photoschaltbarkeit wurden für die anfängliche 4 min berechnet. der Beleuchtung und der Erholung wurde für den ersten 4 min berechnet. Inkubation im Dunkeln, wie durch die farbigen Flächen angegeben. Die Pisten für jede Berechnung sind durch Fettschrift dargestellt.ource.jove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig9large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die LED Thermo Flow ist ein innovatives Gerät optogenetische Werkzeuge in einem Durchflusszytometer zu studieren.
Bisher optogenetische Proben nur 11,12 mit Mikroskopie Laser oder Taschenlampe Geräte beleuchtet worden. Je nach Winkel und Abstand der Lampe zur Probe, erhebliche Variabilität in der Menge des Beleuchtungs zwischen Experimenten erwartet. Darüber hinaus gibt es eine Grenze für die Anzahl von Taschenlampen eine einzelne Person in einem Experiment arbeiten kann. Dies schränkt die experimentelle Repertoire und Reproduzierbarkeit. Diese Einschränkungen wurden während der Entwicklung der Vorrichtung gerichtet, die verwendet werden können Echtzeit-Photoschaltung Kinetik in lebenden Zellen zu charakterisieren. Unseres Wissens gibt es kein vergleichbares Gerät aus.
In der aktuellen Konfiguration, bis zu 30 LEDs können in einem Thermo Flusskammer eingebaut werden. So können je nach den erforderlichen Lichtintensitäten für jede Wellenlänge kann eine einzelne Vorrichtung sein used für eine Vielzahl von optogenetische Werkzeuge. Die etablierten Photoschaltbarkeit Protokolle können dann für die funktionelle Ablesungen optimiert werden, zB Calciumflussmessungen. Unser Gerät kann für andere optisch kontrollierte Substanzen, wie caged Verbindungen oder photoaktivierbaren Fluorophore geeignet sein.
In Abhängigkeit von der wissenschaftlichen Fragestellung und verwendete Probe kann individualisierte Protokolle schnell eingerichtet werden. Die Verwendung von Glasrohren anstelle von Polystyrol oder Polypropylen-Röhrchen wird empfohlen, zwischen 400-500 nm Licht induzierten Cytotoxizität bei Wellenlängen zu begrenzen. Alle getesteten Zelllinien überlebten Beleuchtung (360 nm, 400 nm oder 500 nm) für bis zu einer Stunde in Glasröhrchen. Wir haben versucht, die Ursache für den Zelltod während der Beleuchtung in Plastikröhrchen Experimente durch die Durchführung Transfer zu untersuchen. Wir beleuchteten Zellen in PBS oder RPMI mit Licht unterschiedlicher Wellenlängen, und dann übertragen, um den Überstand zu unbeleuchteten Zellen den Zelltod zu messen. Keine der gesammeltenÜberstände signifikanten Zelltod in den Empfängerzellen verursacht (Daten nicht gezeigt). Auch wird die Temperatur des beleuchteten PBS in Polystyrol oder Polypropylen-Röhrchen nahezu identisch mit der Temperatur in Glasröhren. Daher können wir nur auf die Ursache des Zelltods spekulieren. Beleuchtete Kunststoff kann eine instabile Substanz oder Strahlung einer Wellenlänge freizugeben, die für Zellen toxisch ist.
Die Wahl des Mediums für jedes Experiment verwendet wird, ist wichtig. Die Pufferkapazität muss in Betracht gezogen werden und verschiedene Reagenzien, wie pH-Indikatoren, absorbieren verschiedene Wellenlängen unterschiedlich stark. Darüber hinaus unterscheidet sich das Überleben der Zellen signifikant, beispielsweise bei der FCS-frei zu FCS-haltigem Medium zu vergleichen.
Das Ziel der Licht-Titration ist die minimale Menge an Licht für maximalen Photoschaltung erforderlich zu verwenden. Für die meisten Experimente ist es günstig, um die Geschwindigkeit des Photoschalter und somit maximiert die Lichtintensität zu maximieren. Aber je nach wavelenge und Zelltyp kann Licht direkte Auswirkungen auf die Signalverhalten haben, weshalb eine übermäßige Beleuchtung vermieden werden sollte.
Es ist möglich, Lichtpläne für unser Gerät zu programmieren und es an einen Computer anzuschließen, wie für andere leichte Geräte üblich ist. Da jedoch die meisten Durchflusszytometer gemeinsam Arbeitsplätze geteilt durch zahlreiche verschiedene Labore sind, ist es am besten, das Gerät so klein und handlich wie möglich zu halten. Darüber, wie die manuelle Handhabung unserer Vorrichtung für eine Zweifarben-Setup hier präsentiert ist so einfach wäre, dass die Programmierung nur geringfügig das experimentelle Verfahren zu verbessern.
Zusammengenommen stellen wir hier ein innovatives Gerät, die die Macht der optogenetische Werkzeuge kombiniert und Durchflusszytometrie. Dies wird die Charakterisierung und Entwicklung von optogenetische Werkzeuge in vivo und erweitern die experimentellen Repertoire wesentlich vereinfachen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12x75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
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