Introduction
כלים optogenetic כבר צובר פופולריות, בין השאר משום שהם יכולים לשמש כדי לפענח את החיווט של מסלולי איתות 1-4. הם מבוססים על היכולת של חלבונים photoactivatable לשנות זיקה קונפורמציה ומחייבת שלהם, כאשר מואר באור. פיוזינג חלבונים אלה לאלמנטי איתות מאפשר להסדרה הספציפית של שחקן יחיד בתוך מסלולי איתות תאיים מורכבים 5-12. כתוצאה מכך, מסלול איתות ניתן ללמוד עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה.
רוב המחקרים optogenetic מבוססי תאים לנצל שיטות מיקרוסקופיה מבוססת בשילוב עם culturing בנוכחות אור, ואחריו ניתוח ביוכימיים 11,12. לעומת זאת, cytometer זרימת singularizes תאים לאורך נימים ומודד גודל תא, גרעיניות ו עוצמות קרינה. לשיטה זו יתרונות גדולים על פני שיטות מיקרוסקופיה או ביוכימיות, כולל היכולת לנתח thousands של תאים חיים ברזולוצית תא בודד בתוך זמן קצר מאוד. לפיכך, רצוי לשלב optogenetics עם cytometry הזרימה.
למיטב ידיעתנו, אין פרוטוקול הוקם עבור cytometry זרימת optogenetic. הליך מקובל רחב הוא להאיר תאים ידניים מחוץ צינור התגובה עם התקני פנס. עם זאת, תאורה ידנית את זרימת cytometer מחייבת לאור לעבור דרך צינור התגובה, הדמית תא חייה, גלילית, תא מים מחומם. זה גורם פיזור אור משמעותי ואובדן האור. יתר על כן, את עוצמת האור שמספקת תאורת מדריך אינה לשחזור בין ניסויים (זווית, מרחק וכו ') ויש מגבלה מעשית על מספר אורכי גל בניסוי אחד.
על ידי בניית מכשיר זרימת LED Thermo, הצלחנו להתגבר על המגבלות האלה. בעזרת התקן זה, אפשר להאיר תאים עם אורכי גל ספציפיים עובד זמניerature שבשליטת בצורה במהלך המדידות תזרים cytometric. זה מאפשר כמויות מדויקות לשחזור של אור בתוך ובין ניסויים.
כדי להדגים את התועלת של המכשיר שלנו in vivo, הקלטנו את אותות הקרינה של Dronpa בתאים ראמוס B במהלך photoswitching. תאי ראמוס B נגזרים לימפומה אדם Burkitt. Dronpa הוא חלבון פלואורסצנטי שקיים בתור מונומר, דימר או tetramer. בצורתו monomeric שלה, היא פלורסנט שאינן. תאורה עם 400 ננומטר אור גורם dimerization ו tetramerization והופך את חלבון פלואורסצנטי Dronpa. תהליך זה יכול להיות הפוך על ידי תאורה עם 500 ננומטר אור. חלבון Dronpa נעשה שימוש כדי לשלוט בפונקציית ומיקום של איתות חלבונים 4,13.
כאן, הביע לנו חלבון Dronpa-לינקר-Dronpa בתאי B ראמוס ללמוד photoswitching של Dronpa ב cytometer זרימה. השימוש במכשיר שלנו, הצלחנו ביעילותreproducibly photoswitch Dronpa בעת ההקלטה עוצמת הקרינה שלה בזמן אמת. שיטה זו מספקת יתרונות משמעותיים על פני פרוטוקולי תאורה נוכחיים עם תאורה ידנית באופן משמעותי מרחיבה את רפרטואר ניסיוני כלי optogenetic ותרכובות כלוב. השימוש במכשיר שלנו תפשט בצורה משמעותית להאיץ גילוי ופיתוח של כלים optogenetic הרומן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
תכנון 1. בונה את ההתקנים
- ניסויי פיילוט
הערה: עוצמת האור הנדרשת עבור סוג כלי תאים ספציפי optogenetic עשויה להשתנות באופן משמעותי. ניסויי פיילוט עם טיפוס שימושיים להעריך את עוצמת האור המינימאלית הכרחית. כלי optogenetic המשמש בניסויים הבאים הוא היתוך לבנות Dronpa-לינקר-Dronpa. רצף Dronpa הושג מסחרי (ראה רשימת חומרים). מקשר ארוך שובט בין שני רצפים Dronpa לאפשר לבנות הביע לגבש intramolecular (ו מולקולאריים) הדימרים. השלבים המתוארים להלן ניתן להתאים כלים רבים optogenetic אחרים או חומרים מפוקחים אופטי.- Transduce לימפוציטים ראמוס B עם מבנה המכיל Dronpa-לינקר-Dronpa בעקבות הוראות היצרן עבור התמרה באמצעות supernatant retroviral המכילים מתאי אריזות. קציר ותאי לספור על פי מראשviously שפורסם פרוטוקול 13.
- תאים Resuspend בריכוז של 1 x 10 6 / מ"ל במדיום (RPMI 1640, 10% חום מומת FCS, 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 פניצילין U / mL, 100 סטרפטומיצין U / mL, ו -50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol) ולהעבירם שפופרת זכוכית FACS.
- הכנס את הצינור לתוך cytometer זרימה ולמדוד את עוצמת הקרינה של Dronpa (ערוץ GFP) 14,15.
- יש להרכיב משקפיים מגן לכל צעדים נוספים כדי להגן על העיניים מפני אורכי גל ופעולה זו עלולה לפגום.
- באופן ידני למקם אור LED 500 ננומטר על החלק החיצוני של הצינור ולהמשיך מדידת עוצמת הקרינה של Dronpa.
- יש להעלות את מספר ו / או עוצמת נורות LED עד עוצמת הקרינה Dronpa פוחתת.
- באופן ידני למקם אור LED 400 ננומטר על החלק החיצוני של הצינור ולהמשיך מדידת עוצמת הקרינה של Dronpa.
- יש להעלות את מספר ו / או עוצמת נורות LED עד fluo Dronparescence עליות בעצמה.
- השתמש לפחות כמו רבים נורות LED לבניית המכשיר כפי שחזה להיות הכרחי מן photoswitching בצעדים 1.1.5 ו 1.1.7.
- בונה את המכשיר
הערה: המכשיר נבנה על ידי חנות עיבוד מקצועי, Technik Arbeitsgruppe מאוניברסיטת פרייבורג. רוב החלקים עשויים מותאם אישית ולא זמין מסחרית. את המידות המדויקות של כל חלק מתוארים איורים 1 ו -2. כדי להבהיר את ההרכבה של המכשיר הזה, משלים וידאו 1 מסופק ואת הצעדים החיוניים ביותר מתוארים להלן.- חתיכת מיל מ פוליוויניל כלוריד (PVC) עם המידות המדויקות מוצגות באיור 1 א.
- הכנס נורות LED לתוך חורים שנקדחו של פיסת A ו- לאטום כל חור עם דבק PVC כדי למנוע דליפת מים.
- חבר נוריות שנאי רב (כל אורך גל צריך לתפוס מקום chann נפרדאל) עם כוח תפוקה מתכווננת מ 0-29 mA.
- צרף המעטפת החיצונית (B) עם 3 ברגים ליצירה כמשוואה מתואר להגן על נוריות מפני נזק פיזי.
- כדי שניתן יהיה לחבר את המכשיר משאבת מים, דבק וידאו קליפים צינור (C) לתוך חורים שנקדחו של פיסת A (מתואר באיור 1 א, חתך Y: 9 מ"מ ו 61.5 מ"מ) באמצעות דבק PVC.
- חותכי צינור פרספקס 58.5 מ"מ אורך (D1).
- ייצור חלקים D2 ו- D3 פרספקס כמתואר באיור 2.
- חתיכת דבק D3 לתחתית D1 עם דבק פרספקס.
- צרף O-Ring גומי חתיכת D2 ודבק אותה לחלק העליון של D1 עם דבק פרספקס.
הערה: חתיכות D1, D2 ו- D3 יחדיו פיסת ד - הכנס חתיכת D לתוך חתיכת A עם 3 ברגים.
- בדיקת ההתקן עבור דליפת מים לפני החלת כוח השנאי.
2. מדידת קינטיקה של כלי optogenetic
- התרבות תאים ראמוס B ב RPMI-בינוני (RPMI 1640, 10% חום מומת FCS, 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 פניצילין U / mL, 100 סטרפטומיצין U / mL, ו -50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol) בצפיפות של 3 10 x 10 6 תאים / מ"ל ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- קציר ראמוס B התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 350 ו -4 C ° למשך 5 דקות.
- ספירת תאים באמצעות תא ספירה נויבאואר בעקבות הוראות היצרן ו resuspend 1-5 x 10 6 תאים 600 בינוני μL.
- מעבירים את התאים לצינור FACS זכוכית, לשים אותם על הקרח ולהגן עליהם מפני האור עד המדידה.
- חבר את התקן משאבת מים מחוממת ולהתאים את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס.
- בעת שימוש צינורות זכוכית FACS, להחליף את האטם השחור של זרימת cytometer עם גומי O-Ring ובנוסף להחיל סיליקון גרקַלוּת.
- בזהירות להכניס את שפופרת זכוכית FACS לתוך המכשיר ולחבר אותו cytometer את הזרימה (איור 3).
- התחילו את המדידה ולהקליט Dronpa עוצמת פלורסנט (ערוץ GFP).
- להאיר את המדגם התא עם 400 ננומטר או 500 ננומטר אור בהתאמה ולהקליט את עוצמת הקרינה Dronpa (ערוץ GFP).
- לנתח נתוני ניסוי עם זרימת מתאים cytometer תוכנה. העלילה פיזור קדימה נגד פיזור הצידה ואת השער התאים החיים. מגרש את עוצמת הקרינה Dronpa לאורך זמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות תזרים LED Thermo עם Cytometer זרימה
הליבה התפקודית של המכשיר היא תא גלילי שבו נורה LED מסודרים באופן מעגלי מצביע פנימה. תא זה יכול להיות מחובר לאספקת מים משאבה, המאפשרת שליטה על הטמפרטורה של נוריות, כמו גם מדגם התא. הנוריות מחוברות שנאי ומכאן עוצמת האור עבור כל אורך גל ניתן לשלוט בנפרד. המרכז של המכשיר יכול להכיל צינור FACS בגודל סטנדרטי, אשר יכול להיות מחובר ביותר cytometers הזרימה הסטנדרטית (איורים 4 ו -5). כדי להראות כי התאורה במכשיר שלנו אינו מוביל חימום בלתי רצויה של תאים, מדדנו את הטמפרטורה של PBS מואר לאורך זמן (איור 6) במשך שלושה אורכי גל שונים. תאורה עם 360 ננומטר, 400 ננומטר או 500 ננומטר מובילה רקעלייה בטמפרטורה שולית. בסך הכל, המכשיר המוצג כאן מאפשר תאורה לשחזור של דגימות תאים בקרת טמפרטורה להימדד cytometer זרימה.
Photoswitching של Dronpa
וקטור ביטוי קידוד היתוך לבנות 13,16 Dronpa-לינקר-Dronpa היה משובטים transduced לתאי ראמוס B. כפי שמתואר באיור 7, המטרה הייתה לשלוט קונפורמציה של החלבון היתוך זה עם אור באורכי גל ספציפיים. שימוש במכשיר שלנו, חלבון היתוך Dronpa-לינקר-Dronpa cytosolic היה photoswitched מספר פעמים (איור 8, שמאל). מעבר למצב הכהה מתרחש לאט, ואילו המעבר למדינה הבהירה קורה באופן כמעט מיידי. התאוששות הקרינה הספונטנית של Dronpa בחושך מראה כי photoswitching יעילה בצורה הבהירה דורשת תאורה ספציפיתרק לאט מתרחש באופן ספונטני (איור 8, מימין).
בצענו ניתוח הקינטית של נכסי photoswitching (איור 9). המדרונות עבור קינטיקה המיתוג חושבו עבור תאורה 4 דקות של ראשוניות. השיפוע עבור ההחלמה הספונטנית חושב עבור 4 הדקות הראשוניות בחושך.
הניתוח הקינטית תערוכות, שמהירות photoswitching Dronpa היא בסיכומו מאוד לשחזור. לעומת זאת, החלמה ספונטנית של קרינת Dronpa בחושך היא מאוד לא יעילה. גם לאחר דגירה כבר בחושך, רק כ -10% של קרינת Dronpa הוא התאושש. זה מראה כי אכן התאורה במכשיר שלנו משרת photoswitching.
לפיכך, באמצעות השיטה המתוארת, אנחנו יכולים ליצור בזמן אמת photoswitching נתוני cytometer זרימה, אשר יכוללהיתרגם ערכה הקינטית של כלי optogenetic רבים.
איור 1: תוכנית הבינוי של השכבה החיצונית. כל החתיכות המתוארות הן בהתאמה אישית מ פוליוויניל כלוריד (PVC). A Piece: קטע PVC הגלילי עם חורים שנקדחו להכניס נוריות ואת קטעי הצינור. B Piece: המעטפת החיצונית כדי להגן על נוריות מפני נזק פיזי. Piece C: קליפ הצינור המחבר את החלל הפנימי עם צינורות גומי כדי לאפשר קירור מים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תוכנית הבינוי של השכבה הפנימית. כל החתיכות המתוארות עשויות פרספקס. D Piece: קטע זה מורכב משלושה חלקים D1, D2 ו- D3 ומהווה יחידה התוחמת את צינור FACS. Piece D1: צינור פרספקס גלילי. Piece D2: המכסה התחתון של השכבה הפנימית. Piece D3: המכסה של השכבה הפנימית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: שימוש במכשיר עם cytometer זרימה. A1: כניסת מדגם cytometer זרימה; A2: צינור FACS מחובר כניסת המדגם; B: המכשיר התוחם את צינור FACS; C: כניסה לדוגמא; D: כניסת המדגם עם המכשיר.ove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: Workflow סכמטי של המכשיר. ת: תאים מוארים במכשיר (למטה משמאל) ובמקביל לקחת עד שנותח cytometer את הזרימה (למעלה משמאל). זה מאפשר, למשל, ניתוח של מאפייני הקינטית של כלי optogenetic (בצד שמאל למעלה). B: חתך של המכשיר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: תהליך זרימת תרשים של המכשיר. אחת או מור נורות LED הדואר של אורכי גל מסוימים להאיר את המדגם תא צינור FACS. נוריות מוקפים מים, אשר החליפו כל הזמן על ידי circulator אמבט מחומם כדי לשמור על הטמפרטורה של יציבה מדגם התא. בניסויי תא חיים, הטמפרטורה מותאמת ל -37 מעלות צלזיוס. במהלך תאורה בטמפרטורה מבוקרת זו, תאים נלקחים לתוך cytometer הזרימה לניתוח. התקנה זו מאפשרת, למשל, לנתח את מאפייני הקינטית של כלי optogenetic. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: טמפרטורה של PBS מואר לאורך זמן. 1 מ"ל של PBS בצינור זכוכית FACS הואר לאורך זמן עם אור 360 ננומטר, 400 ננומטר אור או 500 אור ננומטר.להעלות / 54,707 / 54707fig6large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7: מודל photoswitching של החלבון Dronpa-לינקר-Dronpa. תאורה עם אור 400 ננומטר יהיה dimerize (ו tetramerize) Dronpa ו לדקלם את זה ניאון. תאורה עם אור 500 ננומטר תוביל דיסוציאציה של חלבונים Dronpa, שבו monomeric Dronpa הוא לא פלורסנט. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 8: אפיון המאפיינים photoswitching Dronpa באמצעות תזרים LED Thermo בשילוב עם f cytometry נמוכה. התאים היו מוארים כמצוין לעיל ציר ה- X ואת Dronpa אומר עוצמת הקרינה (MFI) מתואר לאורך זמן. חלבון היתוך Dronpa-לינקר-Dronpa ניתן photoswitched מספר פעמים באמצעות המכשיר (משמאל). החלמה ספונטנית של עוצמת קרינת Dronpa מתרחשת רק לאט לא יעיל (מימין). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 9: ניתוח קינטי של Dronpa photoswitching. קינטיקה של photoswitching Dronpa חושבה עבור 4 דקות הראשוניות. תאורה ואת ההתאוששות חושבה עבור 4 דקות הראשוניות. דגירה בחושך כפי שצוין על ידי האזורים הצבעוניים. המדרונות עבור כל חישוב מתוארים במספרים מודגשים.ource.jove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig9large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
The Flow LED Thermo הוא מכשיר חדשני ללמוד כלי optogenetic בתוך cytometer זרימה.
עד כה, דגימות optogenetic כבר מואר רק עם לייזרים מיקרוסקופיה או מכשירים פנס 11,12. בהתאם לזווית והמרחק של הפנס המדגם, לשונות נכרתו את כמות התאורה צפויה בין ניסויים. יתר על כן, קיימת הגבלה על המספר של פנסי אדם אחד יכול לפעול ניסוי. זה מגביל את רפרטואר שחזור ניסיוני. מגבלות אלה טופלו במהלך הפיתוח של המכשיר שלנו, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לאפיין קינטיקה photoswitching בזמן אמת בתאים חיים. למיטב ידיעתנו, אין מכשיר דומה קיים.
בתצורה הנוכחית, עד 30 נוריות יכול להיות מובנה בתוך תא הלבשה זרימה אחד. לכן, תלוי בעוצמות אור הנדרשות עבור כל אורך גל, מכשיר אחד יכול להיות לנואד עבור מגוון רחב של כלי optogenetic. פרוטוקולי photoswitching הוקמו מכן יכולים לעבור אופטימיזציה עבור readouts התפקודית, למשל, מדידות שטף סידן. המכשיר שלנו יכול להיות מתאים חומרים אחרים מבוקרים אופטי, כגון תרכובות בכלוב או fluorophores photoactivatable.
בהתאם את שאלת דגימה המדעית המשמשת, ניתן לקבוע פרוטוקולים אישית במהירות. שימוש צינורות זכוכית במקום צינורות קלקר או פוליפרופילן מומלץ להגביל cytotoxicity אור-induced באורכי גל שבין 400-500 ננומטר. כל שורות התאים שנבדקו שרדו תאורה (360 ננומטר, 400 ננומטר או 500 ננומטר) לתקופה של עד שעה אחת צינורות זכוכית. ניסינו לחקור את סיבת מוות של תאים במהלך תאורת צינורות פלסטיק על ידי ביצוע ניסויי העברה. אנו מוארים תאי PBS או RPMI עם אור באורכי גל שונה ולאחר מכן העברנו את supernatant לתאים שאינם מוארים למדוד מוות של תאים. אף אחד שנאסףsupernatants שנגרם מוות של תאים משמעותיים בתאי הנמען (מידע לא מוצג). כמו כן, הטמפרטורה של PBS מואר קלקר, או צינורות פוליפרופילן היא כמעט זהה לזה של טמפרטורת צינורות זכוכית. לפיכך, אנו יכולים רק לשער על סיבת המוות התא. פלסטיק מואר עשוי לשחרר חומר לא יציב או קרינה באורך גל כי הוא רעיל לתאים.
הבחירה של מדיום המשמשת עבור כל ניסוי חשובה. קיבולת החציצה חייבת להיחשב חומרים כימיים שונים, כמו pH מדדה, לקלוט אורכי גל שונים בדרגות שונות. יתר על כן, הישרדות התא שונה באופן משמעותי, למשל, כאשר משווים FCS-חופשי FCS-המכיל התקשורת.
מטרת טיטרציה האור היא להשתמש בכמות מינימלית של אור הכרחי photoswitching מקסימלית. עבור רוב הניסויים, זה חיובי על מנת למקסם את המהירות של photoswitch ומכאן למקסם את עוצמת האור. אבל, תלוי wavelength וסוג התא, אור יכולים להיות השפעה ישירה על התנהגות האיתות, וזו סיבת תאורה מוגזמת יש להימנע.
אפשר לתכנת לוחות זמני אור עבור המכשיר שלנו לחבר אותו למחשב כפי שמקובל למכשירי אור אחרים. עם זאת, מאז cytometers הזרימה ביותר נמצא במקומות עבודה משותפים מעבדות שונות ומשונות, עדיף לשמור על המכשיר קטן ונייד ככל האפשר. יתר על כן, הטיפול הידני של המכשיר שלנו עבור התקנת שני צבעים כפי שהוצג כאן הוא כל כך פשוט, כי תכנות היה שולי בלבד לשפר את ההליך הניסיון.
יחדיו, אנו מציגים כאן התקן חדשני, המשלב את העוצמה של כלי optogenetic cytometry הזרימה. זה יפשט את האפיון ופיתוח של כלי optogenetic משמעותי in vivo ולהרחיב את הרפרטואר הניסיוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12x75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
- Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T.
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
- Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
- Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898 (2015).
- Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925 (2014).
- Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
- Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
- Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
- Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Givan, A. L.
- Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).
