Introduction
Optogenetic उपकरण हिस्से में लोकप्रिय हो रहा है, क्योंकि वे रास्ते 1-4 संकेत के तारों समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वे photoactivatable प्रोटीन की क्षमता है जब प्रकाश के साथ प्रकाशित उनकी रचना और बंधन आत्मीयता बदलने के लिए पर आधारित हैं। संकेत तत्वों को इन प्रोटीनों Fusing जटिल intracellular संकेत दे रास्ते 5-12 के भीतर एक एकल खिलाड़ी के विशिष्ट नियमन के लिए अनुमति देता है। नतीजतन, एक संकेतन मार्ग उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ अध्ययन किया जा सकता है।
अधिकांश सेल आधारित optogenetic पढ़ाई के प्रकाश की उपस्थिति में संवर्धन के साथ संयुक्त माइक्रोस्कोपी आधारित विधियों, जैव रासायनिक विश्लेषण 11,12 के द्वारा पीछा उपयोग। इसके विपरीत, एक प्रवाह कोशिकामापी एक केशिका साथ कोशिकाओं singularizes और सेल आकार, विघटन और प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापता है। इस विधि माइक्रोस्कोपी या जैव रासायनिक तरीकों पर प्रमुख लाभ, हजार विश्लेषण करने की क्षमता भी शामिल हैबहुत ही कम समय में एकल कोशिका संकल्प पर जीवित कोशिकाओं के डी एस। इसलिए, यह प्रवाह cytometry के साथ optogenetics गठबंधन करने के लिए वांछनीय है।
हमारे ज्ञान करने के लिए, वहाँ optogenetic से फ्लो के लिए कोई स्थापित प्रोटोकॉल है। एक मोटे तौर पर स्वीकार कर लिया प्रक्रिया मैन्युअल टॉर्च उपकरणों के साथ प्रतिक्रिया ट्यूब के बाहर से कोशिकाओं को रोशन करने के लिए है। हालांकि, प्रवाह में मैनुअल रोशनी कोशिकामापी लाइव सेल इमेजिंग, एक बेलनाकार, गरम पानी कक्ष के लिए प्रतिक्रिया ट्यूब के माध्यम से पारित करने के लिए और प्रकाश की आवश्यकता है। यह पर्याप्त रोशनी बिखरने और प्रकाश की हानि का कारण बनता है। इसके अलावा, प्रकाश की तीव्रता का मार्गदर्शन रोशनी द्वारा प्रदान प्रयोगों (कोण, दूरी, आदि) के बीच प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं है और एक प्रयोग में तरंग दैर्ध्य की संख्या के लिए एक व्यावहारिक सीमा नहीं है।
एलईडी थर्मो प्रवाह डिवाइस का निर्माण करके, हम इन सीमाओं को पार करने में सक्षम थे। इस उपकरण के साथ, कोशिकाओं को एक अस्थायी में विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के साथ प्रकाशित किया जा सकता हैerature नियंत्रित प्रवाह cytometric माप के दौरान तरीके से। इस के भीतर और प्रयोगों के बीच प्रकाश की सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मात्रा के लिए अनुमति देता है।
विवो में हमारे डिवाइस की उपयोगिता का प्रदर्शन करने के लिए, हम photoswitching दौरान रामोस बी कोशिकाओं में Dronpa के प्रतिदीप्ति संकेत दर्ज की गई। रामोस बी कोशिकाओं एक मानव बुर्कीट लिंफोमा से निकाली गई है। Dronpa एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि एक मोनोमर, डिमर या टेट्रामर के रूप में मौजूद है। इसकी monomeric रूप में, यह गैर फ्लोरोसेंट है। 400 एनएम प्रकाश के साथ रोशनी dimerization और tetramerization लाती है और Dronpa प्रोटीन फ्लोरोसेंट प्रदान करता है। इस प्रक्रिया में 500 एनएम प्रकाश के साथ रोशनी से उलट हो सकता है। Dronpa प्रोटीन समारोह और प्रोटीन 4,13 संकेत के स्थान को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
यहाँ, हम रामोस बी कोशिकाओं में एक Dronpa-लिंकर-Dronpa प्रोटीन कोशिकामापी एक प्रवाह में Dronpa की photoswitching अध्ययन करने के लिए व्यक्त की है। हमारे डिवाइस का उपयोग करना, हम करने में सक्षम थे और कुशलताreproducibly Dronpa photoswitch वास्तविक समय में अपने प्रतिदीप्ति तीव्रता जबकि रिकॉर्डिंग। इस विधि का मार्गदर्शन रोशनी के साथ वर्तमान रोशनी प्रोटोकॉल पर पर्याप्त लाभ प्रदान करता है और काफी optogenetic उपकरण और पिंजरे यौगिकों के लिए प्रयोगात्मक प्रदर्शनों की सूची broadens। हमारे डिवाइस का उपयोग काफी सरल और डिस्कवरी और उपन्यास optogenetic उपकरणों के विकास को गति देगा।
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Protocol
1. डिजाइनिंग और उपकरण का निर्माण
- पायलट प्रयोगों
नोट: एक विशिष्ट optogenetic उपकरण और सेल प्रकार के लिए आवश्यक प्रकाश की तीव्रता काफी भिन्न हो सकते हैं। प्रोटोटाइप के साथ पायलट प्रयोगों कम से कम प्रकाश तीव्रता आवश्यक अनुमान लगाने के लिए उपयोगी होते हैं। optogenetic निम्न प्रयोगों के लिए इस्तेमाल उपकरण एक Dronpa-लिंकर-Dronpa संलयन निर्माण है। Dronpa अनुक्रम व्यावसायिक रूप से प्राप्त हुई थी (सामग्री की सूची देखें)। एक लंबे लिंकर व्यक्त निर्माण इंट्रामोलीक्युलर (और आणविक) dimers फार्म के लिए अनुमति देने के लिए दो Dronpa दृश्यों के बीच में क्लोन किया गया था। नीचे वर्णित चरणों कई अन्य optogenetic उपकरण या ऑप्टिकली नियंत्रित पदार्थों लिए अनुकूलित किया जा सकता है।- एक Dronpa-लिंकर-Dronpa युक्त निर्माण पैकेजिंग कोशिकाओं से रेट्रोवायरल युक्त सतह पर तैरनेवाला का उपयोग कर पारगमन के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन के साथ transduce रामोस बी लिम्फोसाइटों। हार्वेस्ट और गिनती कोशिकाओं के एक पूर्व के अनुसारviously प्रकाशित प्रोटोकॉल 13।
- की एकाग्रता में Resuspend कोशिकाओं 1 एक्स 10 6 / एमएल माध्यम में (RPMI 1640, 10% गर्मी निष्क्रिय एफसीएस, 2 मिमी एल glutamine, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 यू / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 50 माइक्रोन के 2-मर्केप्टोइथेनाल) और उन्हें एक गिलास FACS ट्यूब को हस्तांतरण।
- कोशिकामापी एक प्रवाह में ट्यूब डालने और Dronpa (GFP चैनल) 14,15 के प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने।
- आगे की सभी चरणों के लिए सुरक्षात्मक चश्मे पहनें संभवतः हानिकारक तरंग दैर्ध्य से आंखों की रक्षा के लिए।
- मैन्युअल ट्यूब के बाहर पर एक 500 एनएम एलईडी प्रकाश डाल दिया है और Dronpa के प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए जारी है।
- जब तक Dronpa प्रतिदीप्ति तीव्रता कम हो जाती नंबर और / या एलईडी रोशनी की तीव्रता में वृद्धि।
- मैन्युअल ट्यूब के बाहर पर एक 400 एनएम एलईडी प्रकाश डाल दिया है और Dronpa के प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए जारी है।
- Dronpa Fluo तक नंबर और / या एलईडी रोशनी की तीव्रता में वृद्धितीव्रता बढ़ जाती है rescence।
- के रूप में कदम 1.1.5 और 1.1.7 में photoswitching से आवश्यक होने की भविष्यवाणी डिवाइस के निर्माण के लिए कम से कम के रूप में कई एलईडी रोशनी का प्रयोग करें।
- उपकरण का निर्माण
नोट: इस उपकरण में एक पेशेवर मशीनिंग की दुकान, फ्रीबर्ग विश्वविद्यालय से Arbeitsgruppe टेक्निक द्वारा बनाया गया था। अधिकांश भागों कस्टम बनाया और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। प्रत्येक भाग का सही आयाम आंकड़े 1 और 2 में चित्रित कर रहे हैं। इस डिवाइस की विधानसभा को स्पष्ट करने के लिए, पूरक वीडियो 1 प्रदान की जाती है और सबसे जरूरी कदम नीचे वर्णित हैं।- क्लोराइड (पीवीसी) चित्रा 1 ए में दिखाया सटीक माप के साथ से मिल टुकड़ा एक।
- टुकड़ा एक के छेद में एलईडी रोशनी डालें और पानी के रिसाव को रोकने के लिए पीवीसी गोंद के साथ प्रत्येक छेद सील।
- एक मल्टीचैनल ट्रांसफार्मर के लिए एल ई डी कनेक्ट (प्रत्येक तरंग दैर्ध्य एक अलग Chann पर कब्जा करना चाहिएईएल) 0-29 मा से एक समायोज्य बिजली उत्पादन के साथ।
- के रूप में शारीरिक क्षति से रक्षा करने के लिए एल ई डी दर्शाया टुकड़ा एक करने के लिए 3 शिकंजा के साथ बाहरी म्यान (बी) संलग्न।
- (चित्रा 1 ए में दिखाया गया है, पार अनुभाग Y: 9 मिमी और 61.5 मिमी) टुकड़ा एक के छेद में एक पानी पंप, ट्यूब क्लिप्स (सी) में गोंद के लिए डिवाइस से कनेक्ट करने में सक्षम होना करने के लिए पीवीसी गोंद का उपयोग।
- एक 58.5 मिमी लंबे Plexiglas ट्यूब (डी 1) में कटौती।
- Plexiglas से निर्माण टुकड़े डी 2 और डी 3 के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है।
- गोंद टुकड़ा डी 3 Plexiglas गोंद के साथ डी 1 की तह तक।
- टुकड़ा डी 2 के लिए एक रबर O- अंगूठी देते हैं और Plexiglas गोंद के साथ डी 1 के शीर्ष करने के लिए इसे गोंद।
नोट: टुकड़े डी 1, डी 2 और डी 3 डी एक साथ फार्म टुकड़ा - 3 शिकंजा के साथ टुकड़ा एक टुकड़ा में डी डालें।
- पानी के रिसाव ट्रांसफार्मर के लिए बिजली के लिए आवेदन करने से पहले डिवाइस का परीक्षण करें।
2. एक optogenetic उपकरण के काइनेटिक्स मापने
- RPMI मध्यम में संस्कृति रामोस बी कोशिकाओं (RPMI 1640, 10% गर्मी निष्क्रिय एफसीएस, 2 मिमी एल glutamine, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 यू / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 50 माइक्रोन के 2-मर्केप्टोइथेनाल) 3 के घनत्व पर 10 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल 37 डिग्री सेल्सियस पर और 5% सीओ 2।
- हार्वेस्ट रामोस बी 350 XG और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं।
- निर्माता के निर्देशों के बाद एक Neubauer गिनती कक्ष का उपयोग कोशिकाओं की गणना और 600 μL माध्यम में 1-5 x 10 6 कोशिकाओं resuspend।
- एक गिलास FACS ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण माप जब तक बर्फ पर डाल दिया और हल्के से उन्हें बचाने के लिए।
- एक गर्म पानी पंप करने के लिए डिवाइस से कनेक्ट और 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान को समायोजित।
- कांच FACS ट्यूबों का उपयोग करते हैं, कोशिकामापी एक रबर O- अंगूठी के साथ प्रवाह के काले हे अंगूठी का आदान-प्रदान और इसके अलावा सिलिकॉन जीआर लागूआसानी।
- ध्यान से डिवाइस में कांच FACS ट्यूब डालने और यह (चित्रा 3) प्रवाह से कनेक्ट।
- माप शुरू और Dronpa फ्लोरोसेंट तीव्रता (GFP चैनल) का रिकॉर्ड है।
- क्रमश: 400 एनएम या 500 एनएम प्रकाश के साथ सेल नमूना रोशन और Dronpa प्रतिदीप्ति तीव्रता (GFP चैनल) का रिकॉर्ड है।
- सॉफ्टवेयर कोशिकामापी उपयुक्त प्रवाह के साथ प्रयोगात्मक डेटा का विश्लेषण। प्लॉट बगल की ओर बिखराव और गेट जीवित कोशिकाओं के खिलाफ आगे तितर बितर। समय के साथ Dronpa प्रतिदीप्ति तीव्रता प्लॉट।
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Representative Results
एक प्रवाह cytometer के साथ एलईडी थर्मो प्रवाह का उपयोग
डिवाइस के कार्यात्मक कोर एक बेलनाकार कक्ष जिसमें एलईडी रोशनी एक परिपत्र तरीके से आवक इशारा कर में व्यवस्थित कर रहे है। इस कक्ष में एक पानी की आपूर्ति और पंप, जो एल ई डी के तापमान, साथ ही सेल नमूना नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है से जुड़ा जा सकता है। एल ई डी एक ट्रांसफार्मर से जुड़े हैं और इसलिए प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए प्रकाश की तीव्रता को व्यक्तिगत रूप से नियंत्रित किया जा सकता है। डिवाइस का केंद्र एक मानक आकार FACS ट्यूब, सबसे मानक प्रवाह cytometers से कनेक्ट किया जा सकता है, जो accommodates (आंकड़े 4 और 5)। हमारे डिवाइस कोशिकाओं के अवांछित हीटिंग के लिए नेतृत्व नहीं करता है कि रोशनी दिखाने के लिए, हम तीन अलग अलग तरंग दैर्ध्य के लिए (चित्रा 6) समय के साथ प्रबुद्ध पीबीएस के तापमान मापा। 360 एनएम, 400 एनएम या 500 एनएम के साथ रोशनी केवल एक करने के लिए सुरागसीमांत तापमान में वृद्धि। कुल मिलाकर, यहाँ प्रस्तुत डिवाइस के लिए तापमान नियंत्रित सेल के नमूने की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रोशनी कोशिकामापी एक प्रवाह में मापा जा करने के लिए अनुमति देता है।
Dronpa की photoswitching
एक अभिव्यक्ति वेक्टर एक Dronpa-लिंकर-Dronpa 13,16 संलयन निर्माण एन्कोडिंग क्लोन और रामोस बी कोशिकाओं में transduced किया गया था। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 7, लक्ष्य विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के प्रकाश के साथ इस संलयन प्रोटीन की रचना नियंत्रित करने के लिए किया गया था। हमारे डिवाइस का उपयोग करना, साइटोसोलिक Dronpa-लिंकर-Dronpa संलयन प्रोटीन कई बार photoswitched था (8 चित्रा, बाएं)। अंधेरे राज्य के लिए स्विचिंग, धीरे-धीरे होता है, जबकि उज्ज्वल राज्य के लिए स्विचन लगभग तुरंत होता है। अंधेरे में Dronpa की सहज प्रतिदीप्ति वसूली से पता चलता है कि उज्ज्वल फार्म के लिए कुशल photoswitching विशिष्ट रोशनी और की आवश्यकता हैधीरे धीरे ही अनायास (8 चित्रा, दाएं) होता है।
हम photoswitching संपत्तियों की एक गतिज विश्लेषण (9 चित्रा) का प्रदर्शन किया। स्विचन कैनेटीक्स के लिए ढलानों रोशनी की प्रारंभिक 4 मिनट के लिए गणना की गई। सहज वसूली के लिए ढाल अंधेरे में प्रारंभिक 4 मिनट के लिए गणना की गई।
गतिज विश्लेषण से पता चलता है, उस Dronpa photoswitching गति समग्र बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। इसके विपरीत, अंधेरे में Dronpa प्रतिदीप्ति की सहज वसूली बहुत अक्षम है। यहाँ तक कि अंधेरे में अब ऊष्मायन के बाद, Dronpa प्रतिदीप्ति के बारे में केवल 10% बरामद किया है। इससे पता चलता है कि वास्तव में हमारे डिवाइस में रोशनी photoswitching लाती है।
इसलिए, वर्णित विधि का उपयोग कर, हम वास्तविक समय उत्पन्न कर सकते हैं कोशिकामापी एक प्रवाह में डेटा photoswitching, जो कर सकते हैंकई optogenetic उपकरणों की एक गतिज मूल्यांकन में अनुवाद किया।
चित्रा 1: बाहरी परत के निर्माण की योजना है। सभी दर्शाया टुकड़े कस्टम क्लोराइड (पीवीसी) से बने हैं। टुकड़ा एक: drilled छेद के साथ बेलनाकार पीवीसी टुकड़ा एल ई डी और ट्यूब क्लिप डालने के लिए। टुकड़ा बी: शारीरिक क्षति से एल ई डी की रक्षा के लिए बाहरी म्यान। टुकड़ा सी: ट्यूब क्लिप रबर ट्यूब के साथ भीतरी गुहा जोड़ता है कि पानी ठंडा करने के लिए अनुमति देने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: भीतरी परत के निर्माण की योजना है। सभी दर्शाया टुकड़े Plexiglas से बना रहे हैं। टुकड़ा डी: यह टुकड़ा तीन टुकड़े डी 1, डी 2 और डी 3 के शामिल है और इकाई FACS ट्यूब संलग्न रूपों है। टुकड़ा डी 1: बेलनाकार Plexiglas ट्यूब। टुकड़ा डी 2: भीतरी परत के नीचे ढक्कन। टुकड़ा डी 3: भीतरी परत के ढक्कन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: एक प्रवाह कोशिकामापी के साथ इस उपकरण का उपयोग करना। A1: एक प्रवाह कोशिकामापी का नमूना इनलेट; A2: FACS नमूना इनलेट से जुड़े ट्यूब; बी: डिवाइस FACS ट्यूब संलग्न; सी: नमूना इनलेट; डी: डिवाइस के साथ नमूना इनलेट।ove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: कार्यप्रवाह डिवाइस के योजनाबद्ध। एक: प्रकोष्ठों डिवाइस में प्रकाशित कर रहे हैं (नीचे बाएं) और एक साथ (ऊपर बाएं) को हाथ में लिया और प्रवाह में विश्लेषण किया। यह अनुमति देता है, उदाहरण के लिए, एक optogenetic उपकरण (शीर्ष सही) की गतिज गुणों का विश्लेषण। बी: डिवाइस के पार अनुभाग। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: डिवाइस की प्रक्रिया प्रवाह आरेख। एक या Mor विशिष्ट तरंग दैर्ध्य की ई एलईडी रोशनी एक FACS ट्यूब में सेल नमूना रोशन। एल ई डी पानी है, जो लगातार एक गर्म स्नान फैलानेवाला से विमर्श किया है सेल नमूना स्थिर का तापमान बनाए रखने के लिए से घिरे हैं। जीवित कोशिका प्रयोगों के लिए, तापमान 37 डिग्री सेल्सियस के लिए निकाला जाता है। इस तापमान नियंत्रित रोशनी के दौरान कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए प्रवाह कोशिकामापी में लिया जाता है। इस सेटअप अनुमति देता है, उदाहरण के लिए, एक optogenetic उपकरण की गतिज गुणों का विश्लेषण करने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: समय के साथ प्रबुद्ध पीबीएस के तापमान। एक गिलास FACS ट्यूब में पीबीएस के 1 एमएल 360 एनएम प्रकाश, 400 एनएम प्रकाश या 500 एनएम प्रकाश के साथ समय पर प्रकाशित किया गया था।अपलोड / 54707 / 54707fig6large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 7: Dronpa-लिंकर-Dronpa प्रोटीन की photoswitching के लिए मॉडल। 400 एनएम प्रकाश के साथ रोशनी dimerize (और tetramerize) Dronpa और यह फ्लोरोसेंट प्रस्तुत करना। 500 एनएम प्रकाश के साथ रोशनी Dronpa प्रोटीन, जहां monomeric Dronpa गैर फ्लोरोसेंट है की हदबंदी को बढ़ावा मिलेगा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
8 चित्रा: Dronpa photoswitching एलईडी थर्मो प्रवाह का उपयोग कर गुणों के लक्षण वर्णन च के साथ संयुक्त कम cytometry। के रूप में और एक्स अक्ष ऊपर संकेत Dronpa मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) समय के साथ दिखाया गया है प्रकोष्ठों प्रबुद्ध थे। Dronpa-लिंकर-Dronpa संलयन प्रोटीन डिवाइस (बाएं) का उपयोग करते हुए कई बार photoswitched जा सकता है। Dronpa प्रतिदीप्ति तीव्रता का सहज वसूली केवल धीरे धीरे और निकम्मेपन (दाएं) से होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 9: Dronpa photoswitching की काइनेटिक विश्लेषण। Dronpa photoswitching के कैनेटीक्स प्रारंभिक 4 मिनट के लिए गणना की गई। रोशनी और वसूली की प्रारंभिक 4 मिनट के लिए गणना की गई। अंधेरे में ऊष्मायन रंग क्षेत्रों ने संकेत के रूप में। प्रत्येक गणना के लिए ढलानों बोल्ड संख्या में चित्रित कर रहे हैं।ource.jove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig9large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
एलईडी थर्मो प्रवाह एक प्रवाह कोशिकामापी में optogenetic उपकरणों का अध्ययन करने के लिए एक अभिनव उपकरण है।
अब तक, optogenetic नमूने केवल माइक्रोस्कोपी लेज़रों या टॉर्च उपकरणों 11,12 के साथ प्रकाशित किया गया है। कोण और नमूने के लिए टॉर्च की दूरी पर निर्भर करता है, रोशनी की राशि में पर्याप्त परिवर्तनशीलता प्रयोगों के बीच होने की उम्मीद है। इसके अलावा, वहाँ Flashlights एक भी व्यक्ति को एक प्रयोग में काम कर सकते हैं की संख्या की एक सीमा होती है। इस प्रयोगात्मक प्रदर्शनों की सूची और reproducibility प्रतिबंधित। इन सीमाओं हमारे डिवाइस है, जो जीवित कोशिकाओं में वास्तविक समय photoswitching कैनेटीक्स को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के विकास के दौरान संबोधित कर रहे थे। हमारे ज्ञान करने के लिए, कोई तुलनीय डिवाइस मौजूद है।
वर्तमान विन्यास में, करने के लिए 30 एल ई डी एक थर्मो प्रवाह कक्ष में बनाया जा सकता है। इस प्रकार, प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए आवश्यक प्रकाश तीव्रता पर निर्भर करता है, एक ही उपकरण हमें हो सकता हैoptogenetic उपकरणों की एक विस्तृत विविधता के लिए एड। स्थापित photoswitching प्रोटोकॉल तो कार्यात्मक readouts, जैसे, कैल्शियम प्रवाह माप के लिए अनुकूलित किया जा सकता। हमारे उपकरण ऐसे बंदी यौगिकों या photoactivatable fluorophores के रूप में अन्य ऑप्टिकली नियंत्रित पदार्थों के लिए उपयुक्त हो सकता है।
वैज्ञानिक सवाल और इस्तेमाल नमूना पर निर्भर करता है, व्यक्तिगत प्रोटोकॉल तेजी से स्थापित किया जा सकता है। polystyrene या polypropylene ट्यूबों के बजाय ग्लास ट्यूब का उपयोग 400-500 एनएम के बीच तरंग दैर्ध्य प्रकाश प्रेरित cytotoxicity को सीमित करने की सिफारिश की है। सभी परीक्षण सेल लाइनों रोशनी (360 एनएम, 400 एनएम या 500 एनएम) ग्लास ट्यूब में अप करने के लिए एक घंटे के लिए बच गया। हम हस्तांतरण प्रयोगों प्रदर्शन से प्लास्टिक की नलियों में रोशनी के दौरान कोशिका मृत्यु के कारण की जांच करने की कोशिश की। हम अलग अलग तरंग दैर्ध्य के प्रकाश के साथ पीबीएस या RPMI में कोशिकाओं प्रबुद्ध और फिर गैर-प्रबुद्ध कोशिकाओं को सतह पर तैरनेवाला का तबादला कोशिका मृत्यु को मापने के लिए। एकत्र की कोई नहींsupernatants प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु का कारण (डेटा) नहीं दिखाया। इसके अलावा, polystyrene, या polypropylene ट्यूबों में प्रबुद्ध पीबीएस के तापमान ग्लास ट्यूब में तापमान के लगभग समान है। इसलिए, हम केवल कोशिका मृत्यु के कारणों पर कल्पना कर सकते हैं। प्रबुद्ध प्लास्टिक एक अस्थिर पदार्थ या एक तरंग दैर्ध्य है कि कोशिकाओं के लिए विषाक्त है के विकिरण जारी कर सकते हैं।
एक प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया माध्यम से चुनाव महत्वपूर्ण है। प्रतिरोधक क्षमता पर विचार किया जाना चाहिए और अलग अभिकर्मकों, पीएच-संकेतक की तरह, विभिन्न डिग्री के लिए अलग तरंग दैर्ध्य को अवशोषित। इसके अलावा, सेल अस्तित्व, काफी अलग है, उदाहरण के लिए की तुलना जब मीडिया एफसीएस युक्त करने के लिए एफसीएस से मुक्त हो।
प्रकाश अनुमापन के लक्ष्य को अधिकतम photoswitching के लिए आवश्यक प्रकाश की कम से कम राशि का उपयोग करने के लिए है। सबसे प्रयोगों के लिए, यह photoswitch की गति को अधिकतम और इसलिए प्रकाश की तीव्रता अधिकतम करने के लिए अनुकूल है। लेकिन, wavele पर निर्भर करता हैngth और सेल प्रकार, प्रकाश सिगनल व्यवहार, यही वजह है कि अत्यधिक रोशनी से बचा जाना चाहिए पर प्रत्यक्ष प्रभाव हो सकता है।
यह हमारे डिवाइस के लिए प्रकाश कार्यक्रम के कार्यक्रम के लिए और यह एक कंप्यूटर से कनेक्ट करने के रूप में अन्य प्रकाश उपकरणों के लिए आम बात है संभव है। हालांकि, बाद से सबसे प्रवाह cytometers आम काम के स्थानों में कई अलग अलग प्रयोगशालाओं द्वारा साझा कर रहे हैं, यह सबसे अच्छा है छोटे और संभव के रूप में पोर्टेबल डिवाइस के रूप में बनाए रखना है। इसके अलावा, के रूप में यहाँ प्रस्तुत एक दो रंग स्थापना के लिए हमारे डिवाइस के मैनुअल हैंडलिंग इतना आसान है, कि प्रोग्रामिंग केवल मामूली प्रयोगात्मक प्रक्रिया में सुधार होगा।
साथ में ले ली, हम यहाँ एक अभिनव उपकरण है, जो optogenetic उपकरणों की शक्ति को जोड़ती है और प्रवाह cytometry प्रस्तुत करते हैं। यह काफी हद तक लक्षण और optogenetic उपकरणों के विकास में विवो को आसान बनाने और प्रयोगात्मक प्रदर्शनों की सूची का विस्तार होगा।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12x75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
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