Introduction
それらは経路1-4シグナルの配線を解読するために使用することができるので、光遺伝学ツールは、部分的に、人気を集めています。これらは、光を照射されたとき、それらの立体配座および結合親和性を変更するための光活性化タンパク質の能力に基づいています。シグナリング要素にこれらのタンパク質を融合して、複雑な細胞内シグナル伝達経路5-12内のシングルプレイヤーの特定の調節を可能にします。従って、シグナル伝達経路は、高い時間および空間分解能を用いて研究することができます。
ほとんどの細胞ベースの光遺伝学の研究では、生化学分析11,12に続く光の存在下での培養と組み合わせた顕微鏡ベースの方法を利用します。対照的に、フローサイトメーター、キャピラリーに沿って細胞をsingularizesセルサイズ、粒度と蛍光強度を測定します。この方法は、thousan分析する能力を含む、顕微鏡または生化学的方法を超える大きな利点を有しており、非常に短い時間で単細胞解像度で生細胞のDS。したがって、フローサイトメトリーを用いて光遺伝学を組み合わせることが望ましいです。
我々の知る限りでは、光遺伝学、フローサイトメトリーのための確立されたプロトコルはありません。広く受け入れられた手順は、手動で懐中電灯のデバイスとの反応管の外側から細胞を照射することです。しかし、フローのマニュアル照明は、サイトメーターの反応管を通過する光を必要とし、生細胞イメージング、円筒形、加熱された水室のため。これは、実質的な光散乱および光の損失を引き起こします。また、手動の照明によって提供される光強度は（ 等角度、距離、）実験間の再現性がないと一つの実験の波長の数には限界があります。
LEDサーモフロー装置を構築することによって、我々は、これらの制限を克服することができました。このデバイスでは、細胞は一時中で特定の波長で照射することができますフローサイトメトリー測定中erature制御方法。これは、実験内との間の光の正確で再現性の量を可能にします。
インビボでの我々の装置の有用性を実証するために、我々はphotoswitching中ラモスB細胞におけるドロンパの蛍光シグナルを記録しました。ラモスB細胞は、ヒトバーキットリンパ腫に由来します。ドロンパは、モノマー、ダイマーまたは四量体として存在する蛍光タンパク質です。そのモノマー形態では、非蛍光性です。 400 nmの光で照明は二量体化および四を誘導し、ドロンパタンパク質の蛍光をレンダリングします。このプロセスは、500 nmの光を照射することによって逆転させることができます。ドロンパタンパク質は、タンパク質4,13のシグナリング機能および位置を制御するために使用されています。
ここでは、フローサイトメーターでドロンパのphotoswitchingを研究するためにラモスB細胞にドロンパ - リンカー - ドロンパのタンパク質を発現しました。私たちのデバイスを使用して、我々は効率的にすることができたとリアルタイムでの蛍光強度を記録しながら再現性ドロンパをフォトスイッチ。この方法は、マニュアル照明で現在の照明プロトコルを介して実質的な利点を提供し、大幅に光遺伝学ツールとケージ化合物のための実験的なレパートリーを広げます。大幅に簡素化し、新たな光遺伝学ツールの発見と開発を加速する私たちのデバイスを使用しました。
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Protocol
1.デバイスの設計と構築
- パイロット実験
注：特定の光遺伝学ツールおよび細胞型に必要な光強度が大幅に異なる場合があります。プロトタイプとパイロット実験は必要最小限の光強度を推定するのに有用です。以下の実験のために使用される光遺伝学ツールは、ドロンパ - リンカー - ドロンパ融合構築物です。ドロンパシーケンスは、商業的に（材料のリストを参照してください）を得ました。長いリンカーは、発現構築物は、分子内（分子間）二量体を形成することを可能にするために2つのドロンパ配列の間でクローニングしました。以下に説明する手順は、他の多くの光遺伝学ツールまたは光学的に制御された物質に適合させることができます。- パッケージング細胞からのレトロウイルス含有上清を用いて、形質導入のための製造元の指示に従ってドロンパ - リンカー - ドロンパ含む構築物でラモスBリンパ球を伝達します。事前に応じて細胞を収穫し、カウントviouslyプロトコル13を発表しました 。
- 濃度で再懸濁し、細胞1×10 6培地中/ mLの（RPMI 1640、10％の熱不活性化FCS、2mM L-グルタミン、100U / mLのペニシリン、100 U / mLのストレプトマイシン、および50μMの2-メルカプトエタノール）ガラスFACSチューブに移します。
- フローサイトメーターの中にチューブを挿入し、ドロンパ（GFPチャンネル）14,15の蛍光強度を測定します。
- おそらく有害な波長から目を保護するために、すべてのさらなるステップのための保護メガネを着用してください。
- 手動でチューブの外側に500 nmのLEDライトを配置し、ドロンパの蛍光強度を測定し続けます。
- ドロンパの蛍光強度が減少するまでのLEDライトの数および/または強度を増加させます。
- 手動でチューブの外側に400nmのLEDライトを配置し、ドロンパの蛍光強度を測定し続けます。
- ドロンパのFLUOまでLED照明の数および/または強度を上げます強度が増加するrescence。
- ステップ1.1.5と1.1.7でphotoswitchingから必要であると予測されるようにデバイスを構築するために、少なくともとして多くのLEDライトを使用してください。
- デバイスの構築
注：デバイスはフライブルク大学からプロの加工ショップ、Arbeitsgruppe Technikでによって建てられました。ほとんどの部分はカスタムメイドであり、市販されていません。各部分の正確な寸法は、 図1および図 2に示されています。この装置の組み立てを明確にするために、補足ビデオ1が設けられており、最も重要なステップは、以下に記載されています。- 図1Aに示されている正確な測定値を有するポリ塩化ビニル（PVC）からミル片A。
- ピースAのドリル穴にLEDライトを挿入し、水漏れを防ぐために、塩ビ接着剤で各穴を塞ぎます。
- （各波長が別々のchannを占有しなければならないマルチチャンネル変圧器にLEDを接続します0〜29ミリアンペアから調整可能な出力電力とエル）。
- 物理的な損傷からLEDを保護するために描かれているようにピースAに3本のネジで、外側シース（B）を取り付けます。
- ピースAの開けた穴にチューブクリップ（C）内の水ポンプ、接着剤にデバイスを接続できるようにするには（ 図1aに示された、断面Y：9ミリメートルと61.5ミリメートル）のPVC接着剤を使用しました。
- 58.5ミリメートル長いプレキシグラス管（D1）をカットします。
- 図2に示すようにプレキシグラスから作品D2とD3を製造しています。
- プレキシガラス接着剤でD1の底に接着剤ピースD3。
- ピースD2にゴム製のOリングを取り付け、プレキシグラスの接着剤でD1の一番上に接着。
注：ピースD1、D2、D3が一緒にピースDを形成します - 3本のネジでピースAにピースDを挿入します。
- 変圧器に電源を適用する前に水漏れのためのデバイスをテストします。
2.光遺伝学ツールの速度論を測定
- RPMI培地中で培養ラモスB細胞（RPMI 1640、10％熱不活性化FCS、2mM L-グルタミン、100U / mLのペニシリン、100 U / mLのストレプトマイシン、および50μMの2-メルカプトエタノール）3-密度10×10 6細胞/ mL、37℃で、5％CO 2。
- 5分間350×gで4℃での遠心分離により収穫ラモスB細胞。
- 製造者の指示に従ってノイバウアー計数チャンバーを用いて細胞を計数し、600μL培地に1-5×10 6個の細胞を懸濁します。
- ガラスFACSチューブに細胞を移し、氷の上に置くと、測定まで、光から保護。
- 加熱された水ポンプにデバイスを接続し、37℃に温度を調整します。
- ガラスFACSチューブを使用する場合は、ゴム製のOリングを用いて、フローサイトメーターの黒いOリングを交換し、さらにシリコングラムを適用します楽。
- 慎重にデバイスにガラスFACSチューブを挿入します （ 図3）フローサイトメーターに接続します。
- 測定を開始し、ドロンパ蛍光強度（GFPチャネル）を記録。
- それぞれが400nmまたは500 nmの光で細胞試料を照射し、ドロンパの蛍光強度（GFPチャネル）を記録。
- ソフトウェアサイトメーターの適切な流れに実験データを分析します。側方散乱およびゲート生きた細胞に対してプロット前方散乱。経時ドロンパの蛍光強度をプロットします。
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Representative Results
フローサイトメーターとLEDサーモフローを使用して
装置の機能コアは光が内側に向いて円形に配置されたLEDれた円筒状のチャンバです。このチャンバーは給水ポンプ、LEDの温度を制御することができ、ならびに細胞サンプルに接続することができます。 LEDは、変圧器に接続され、したがって、各波長に対する光強度を個別に制御することができます。デバイスの中心は最も標準的なフローサイトメーター（ 図4、図 5）に接続することができ、標準サイズFACSチューブを収容します。細胞の望ましくない加熱をもたらさない私たちのデバイスでその照明を表示するために、我々は3つの異なる波長のために時間をかけて点灯し、PBSの温度（ 図6）を測定しました。 360nmで、400nm以下500nmの持つ照明のみにつながります限界温度上昇。温度制御された細胞サンプルの再現可能な照明がフローサイトメーターで測定するために全体的に、ここで提示装置が可能になります。
ドロンパのPhotoswitching
ドロンパ-リンカー-ドロンパ13,16融合構築物をコードする発現ベクターをクローニングし、ラモスB細胞に形質導入しました。 図7に示すように、目標は、特定の波長の光でこの融合タンパク質の立体構造を制御することでした。我々の装置を使用して、細胞質ゾルドロンパ-リンカー-ドロンパ融合タンパク質を複数回（ 図8、左）photoswitchedました。明状態への切り替えはほぼ瞬時に起こるのに対し、暗状態への切り替えは、ゆっくりと発生します。暗所でドロンパの自発蛍光回復は明るいフォームへの効率的なphotoswitchingは、特定の照明とが必要であることを示していますゆっくりとしか（ 図8、右）自然に発生します。
我々はphotoswitching特性（ 図9）の動力学的分析を行いました。スイッチング速度のための勾配は、照明の最初の4分について計算しました。自発的な回復のための勾配は、暗所で最初の4分について計算しました。
動力学的分析は、ドロンパのphotoswitching速度は全体的に非常に再現可能であることを示しています。これとは対照的に、暗闇の中でドロンパ蛍光の自然回復は非常に非効率的です。暗い中でより長いインキュベーション後、ドロンパ蛍光のわずか約10％が回収されます。これは確かに私たちのデバイス内の照明がphotoswitchingを誘導することを示しています。
したがって、記載された方法を用いて、我々はリアルタイムに生成することができるが、フローサイトメーターでデータをphotoswitching多くの光遺伝学ツールの運動評価に翻訳します。
図1： 外層の建設計画。全て図示片カスタムポリ塩化ビニル（PVC）から作られます。 ワンピースA：LEDとチューブクリップを挿入するためのドリル穴を持つ円筒PVCピース。 片B：物理的損傷からLEDを保護するために、外部シース。 ワンピースC：水冷却を可能にするためにゴム製のチューブと内側の空洞を接続するチューブクリップ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：内層の建設計画。すべての描写の作品はプレキシグラスから作られています。 ピースD：この作品は、3個のD1、D2及びD3から成り、FACSチューブを囲む部を形成しています。 ワンピースD1：円筒プレキシガラス製チューブ。 ワンピースD2：内層の底蓋。 ワンピースD3：内層のふた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： フローサイトメーターでデバイスを使用します。 A1：フローサイトメーターのサンプル入口; A2：サンプル注入口に接続されたFACSチューブ。 B：FACSチューブを囲む装置。 C：サンプル入口; D：デバイスとサンプル入口。ove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： デバイスのワークフロー概略図。 ：細胞（左下）装置で照明し、同時に取り、フローサイトメーター（左上）で分析されます。これは、例えば、光遺伝学ツール（右上）の力学的特性の解析を可能にします。 B：装置の断面図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：デバイスのプロセスフローダイアグラム。一つまたはMOR eは、特定の波長の光は、FACSチューブに細胞試料を照らすLED。 LEDは常に細胞試料の安定した温度を維持するために加熱された浴の循環によって交換される水に囲まれています。生細胞実験のために、温度を37℃に調整されています。この温度制御された照明の間、細胞を解析するためのフローサイトメーターに取り込まれています。このセットアップは、光遺伝学ツールの力学的特性を分析するために、例えば、可能にします。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：時間の経過照らさPBSの温度。ガラスFACSチューブ中のPBS 1 mLを360 nmの光、400nmの光または500nmの光を経時的に照射しました。/ 54707 / 54707fig6large.jpg "ターゲット=" _空白」をアップロード>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7： ドロンパ-リンカー-ドロンパタンパク質のphotoswitchingのためのモデル。 400 nmの光で照明は二量体化（およびtetramerize）ドロンパと、それは蛍光レンダリングされます。 500 nmの光で照明は、単量体ドロンパが非蛍光性であるドロンパタンパク質の解離につながります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図8：LED サーモフローを使用してドロンパphotoswitching特性の特性をfと組み合わせます低フローサイトメトリー。 X軸及びドロンパ上記に示したように、細胞は、平均蛍光強度（MFI）は経時示されて照射しました。ドロンパ - リンカー - ドロンパ融合タンパク質は、装置（左）を使用して数回photoswitchedできます。ドロンパの蛍光強度の自発的回復はゆっくりとしかし、非効率的に（右）が発生します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図9：ドロンパのphotoswitchingの動態解析。ドロンパのphotoswitchingの動態は、最初の4分について計算しました。照明と回復の初期4分について計算しました。色付きの領域によって示されるように、暗所でインキュベーション。各計算のための斜面は、太字の数字で示されています。ource.jove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig9large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
LEDサーモフローは、フローサイトメーターで光遺伝学ツールを研究するための革新的なデバイスです。
これまでのところ、光遺伝学のサンプルを顕微鏡レーザーや懐中電灯のデバイス11,12のみで照らされてきました。試料に懐中電灯の角度と距離に応じて、照明の量の大幅な変動が実験間で期待されています。また、1人での実験で動作することができる懐中電灯の数には限界があります。これは実験的なレパートリーと再現性を制限します。これらの制限は、生細胞におけるリアルタイムphotoswitching動態を特徴付けるために使用することができる私達の装置の開発中に対処されました。我々の知る限り、全く同等のデバイスが存在しません。
現在の構成では、最大30のLEDは、一サーモフローチャンバ内に組み込むことができます。このように、各波長のために必要とされる光の強度に応じて、単一のデバイスは、私たちすることができます光遺伝学ツールの多種多様な編。確立photoswitchingプロトコルは、その後、カルシウムフラックス測定値、 例えば 、機能的な読み出しのために最適化することができます。私たちのデバイスは、ケージド化合物または光活性化蛍光団などの他の光学的に制御する物質、に適しています。
使用される科学的な問題と、試料に応じて、個別のプロトコルが迅速に確立することができます。ガラス管の代わりに、ポリスチレンまたはポリプロピレン管の使用は、400〜500 nmの波長で光誘発細胞毒性を制限することをお勧めします。すべての試験した細胞株は、照明（360ナノメートル、400ナノメートルまたは500ナノメートル）ガラス管で最大1時間を生き延びました。我々は、転写実験を行うことにより、プラスチックチューブで照明時の細胞死の原因を調査することを試みました。我々は、異なる波長の光をPBSまたはRPMIで細胞を照射した後、細胞死を測定するために、非照射細胞に上清を移しました。収集のなし上清を、レシピエント細胞において有意な細胞死を引き起こした（データは示さず）。また、ポリスチレン、またはポリプロピレンチューブで照らさPBSの温度は、ガラス管の温度とほぼ同じです。したがって、我々は、細胞死の原因を推測することができます。イルミネーションプラスチックは、細胞に対して毒性である波長の不安定な物質や放射線を放出することができます。
各実験に用いた培地の選択が重要です。緩衝能力を考慮し、pH指示薬のような異なる試薬、異なる程度に異なる波長を吸収する必要があります。 FCS含有培地をFCS不含を比較すると、さらに、細胞生存率は、例えば、大きく異なります。
光滴定の目標は、最大photoswitchingために必要な光の最小量を使用することです。ほとんどの実験のためには、フォトスイッチの速度を最大にし、従って、光強度を最大にすることが好ましいです。しかし、waveleに応じてngthおよび細胞型、光が過剰照射を避けるべきである理由であるシグナリング動作に直接的な効果を有することができます。
私たちのデバイスのための光のスケジュールをプログラムすると、他の光デバイスに共通であるとしてコンピュータに接続することが可能です。ほとんどのフローサイトメーターは、多くの異なるラボで共有される共通の作業場所にあるので、それは可能な限り小さく、携帯用などのデバイスを維持するのがベストです。また、ここで提示される2色の設定のための私達の装置の手動操作は非常にシンプルですが、そのプログラミングはわずかに実験手順を改善するであろう。
まとめると、我々はここで光遺伝学ツールのパワーを組み合わせて、フローサイトメトリーの革新的なデバイスを、提示します。これは、実質的に生体内での特性評価および光遺伝学ツールの開発を簡素化し、実験的なレパートリーを拡大していきます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12x75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
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