Introduction
Optogenetic verktyg har allt populärare, delvis på grund av att de kan användas för att dechiffrera ledningsdragningen för signalvägar 1-4. De är baserade på förmågan hos fotoaktiverbara proteiner för att förändra sin konformation och bindningsaffiniteten när belyses med ljus. Fusing dessa proteiner till signaleringselement medger specifika regleringen av en enda aktör inom komplexa intracellulära signalvägar 5-12. Följaktligen kan en signalväg studeras med hög temporal och spatial upplösning.
De flesta cellbaserade optogenetic studier utnyttjar mikroskopi baserade metoder i kombination med odling i närvaro av ljus, följt av biokemisk analys 11,12. I motsats, ett flöde singularizes cytometer celler längs en kapillär och mäter cellstorlek, granularitet och fluorescensintensiteter. Denna metod har stora fördelar jämfört med mikroskopi eller biokemiska metoder, inklusive möjligheten att analysera tusen guldds av levande celler vid encelliga upplösning på mycket kort tid. Följaktligen är det önskvärt att kombinera optogenetik med flödescytometri.
Så vitt vi vet finns det ingen etablerad protokoll för optogenetic flödescytometri. En allmänt accepterade förfarandet är att manuellt belysa celler utanför reaktionsröret med ficklampa enheter. Men manuell belysning i flödet kräver cytometern ljuset att passera genom reaktionsröret och för levande cell imaging, ett cylindriskt, uppvärmt vatten kammaren. Detta orsakar betydande ljusspridning och förlust av ljus. Dessutom är inte reproducerbar mellan experiment (vinkel, avstånd, etc.) ljusstyrkan från manuell belysning och det finns en praktisk gräns för antalet våglängder i ett experiment.
Genom att konstruera LED Thermo Flow-enhet, kunde vi övervinna dessa begränsningar. Med den här enheten, kan celler belysas med specifika våglängder i en tempratur-kontrollerat sätt under flödescytometriska mätningar. Detta möjliggör exakta och reproducerbara mängder av ljus inom och mellan experiment.
För att demonstrera användbarheten av vår enhet in vivo, inspelad vi fluorescenssignalen av Dronpa i Ramos B-celler under photoswitching. Ramos B-celler är härledda från ett humant Burkitts lymfom. Dronpa är ett fluorescerande protein som existerar som en monomer, dimer eller tetramer. I dess monomera form, är det icke-fluorescerande. Belysning med 400 nm ljus inducerar dimerisering och tetramerisation och gör Dronpa protein fluorescerande. Denna process kan vändas genom belysning med 500 nm ljus. Den Dronpa protein har använts för att styra funktion och placering av signalproteiner 4,13.
Här, uttryckte vi en Dronpa-Linker-Dronpa protein i Ramos B-celler för att studera photoswitching av Dronpa i en flödescytometer. Med hjälp av vår enhet, kunde vi effektivt ochreproducerbart photoswitch Dronpa under inspelning dess fluorescensintensitet i realtid. Denna metod ger väsentliga fördelar jämfört med nuvarande belysningsprotokoll med manuell belysning och avsevärt breddar den experimentella repertoaren för optogenetic verktyg och bur föreningar. Med vår enhet kommer att avsevärt förenkla och påskynda upptäckt och utveckling av nya optogenetic verktyg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utforma och bygga enheten
- pilot~~POS=TRUNC
OBS: Den erforderliga ljusintensiteten för en specifik optogenetic verktyget och celltyp kan variera kraftigt. Pilotexperiment med prototyper är användbara för att uppskatta den minimala ljusintensitet som krävs. Den optogenetic verktyg som används för följande experiment är en Dronpa-Linker-Dronpa fusionskonstruktionen. Den Dronpa sekvensen kommersiellt erhållen (Se lista över material). En lång linker klonades in mellan två Dronpa sekvenser för att tillåta den uttryckta konstruktionen för att bilda intramolekylära (och inter) dimerer. De steg som beskrivs nedan kan anpassas till många andra optogenetic verktyg eller optiskt kontrollerade ämnen.- Transducera Ramos B-lymfocyter med en Dronpa-Linker-Dronpa innehållande konstruktet enligt tillverkarens instruktioner för transduktion med användning av retrovirusinnehållande supernatant från förpackningsceller. Harvest och räkna celler enligt en förutgare publicerat protokoll 13.
- Resuspendera cellerna vid en koncentration av 1 x 10 6 / ml i medium (RPMI 1640, 10% värmeinaktiverat FCS, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 U / ml streptomycin och 50 pM 2-merkaptoetanol) och överföra dem till en glas FACS-rör.
- För in röret i en flödescytometer och mäta fluorescensintensiteten för Dronpa (GFP kanal) 14,15.
- Skyddsglasögon för alla ytterligare åtgärder för att skydda ögonen från eventuellt skadliga våglängder.
- Placera manuellt en 500 nm LED-ljus på utsidan av röret och fortsätta att mäta fluorescensintensiteten hos Dronpa.
- Öka antalet och / eller intensiteten av LED-lampor tills Dronpa fluorescensintensiteten minskar.
- Placera manuellt en 400 nm LED-ljus på utsidan av röret och fortsätta att mäta fluorescensintensiteten hos Dronpa.
- Öka antalet och / eller intensiteten av LED-lampor till Dronpa fluorescence intensitet ökar.
- Använd minst lika många LED-lampor för att bygga enheten som förväntas vara nödvändiga från photoswitching i steg 1.1.5 och 1.1.7.
- Att bygga enheten
OBS: Enheten byggdes av en professionell bearbetning butik, Arbeitsgruppe Technik från universitetet i Freiburg. De flesta delarna är specialgjorda och inte är kommersiellt tillgängliga. De exakta dimensionerna hos varje del är avbildade i figurerna 1 och 2. För att tydliggöra monteringen av denna enhet, är Kompletterande Video 1 tillhandahålls och de viktigaste stegen beskrivs nedan.- Mill bit A från polyvinylklorid (PVC) med exakta mått som visas i figur 1A.
- Sätt LED-lampor i de borrade hålen i stycke A och försegla varje hål med PVC lim för att förhindra vattenläckage.
- Anslut lysdioder till en flerkanalig transformator (varje våglängd bör ha en separat kanaliEL) med en justerbar uteffekt 0-29 mA.
- Fäst det yttre höljet (B) med 3 skruvar till stycke A som visas för att skydda LED från fysiska skador.
- För att kunna ansluta enheten till en vattenpump, lim i röret klipp (C) i de borrade hålen i stycke A (som visas i Figur 1a, tvärsnitt Y: 9 mm och 61,5 mm) med PVC lim.
- Skär en 58,5 mm lång plexiglas rör (D1).
- Tillverka bitar D2 och D3 från Plexiglas såsom avbildas i figur 2.
- Lim bit D3 till botten av D1 med plexiglas lim.
- Fäst en O-ring för bit D2 och limma fast den på toppen av D1 med plexiglas lim.
OBS: Bitarna D1, D2 och D3 tillsammans bildar stycke D. - Sätt bit D i stycke A med 3 skruvar.
- Testa enheten för vattenläckage före anslutning av ström till transformatorn.
2. Att mäta kinetiken för en optogenetic Tool
- Kultur Ramos B-celler i RPMI-mediet (RPMI 1640, 10% värmeinaktiverat FCS, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 U / ml streptomycin och 50 pM 2-merkaptoetanol) vid en densitet av 3- 10 x 10 6 celler / ml vid 37 ° C och 5% CO2.
- Harvest Ramos B-celler genom centrifugering vid 350 xg och 4 ° C under 5 min.
- Räkna celler med användning av en Neubauer-räknekammare följande tillverkarens instruktioner och återsuspendera 1-5 x 10 6 celler i 600 mikroliter medium.
- Överföra celler till ett glas FACS rör, lägg dem på is och skydda dem från ljus tills mätningen.
- Ansluta enheten till en uppvärmd vattenpump och justera temperaturen till 37 ° C.
- Vid användning av glas FACS rör, byta den svarta O-ringen i flödescytometern med en O-ring och dessutom gäller kisel grlätthet.
- Försiktigt in glaset FACS röret i enheten och anslut den till flödescytometern (Figur 3).
- Starta mätningen och registrera Dronpa fluorescensintensitet (GFP kanal).
- Belysa cellprovet med 400 nm eller 500 nm ljus respektive och registrera Dronpa fluorescensintensiteten (GFP kanal).
- Analysera experimentella data med lämplig flödescytometer programvara. Plot framåtspridning mot sidled spridning och gate levande celler. Plotta Dronpa fluorescensintensiteten över tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använda LED Thermo Flow med en flödescytometer
Den funktionella kärna enheten är en cylindrisk kammare i vilken LED-lampor är anordnade i en cirkulär sätt pekar inåt. Denna kammare kan anslutas till en vattenförsörjning och pump, vilket gör det möjligt att styra temperaturen hos lysdioderna, såväl som provcellen. Lysdioderna är anslutna till en transformator och därmed ljusintensiteten för varje våglängd kan styras individuellt. Centrum av anordningen inrymmer en standardstorlek FACS-rör, som kan anslutas till de flesta standard flödescytometrar (figurerna 4 och 5). För att visa att belysningen i vår enhet inte leder till oönskad uppvärmning av cellerna, mätte vi temperaturen på belysta PBS över tiden (figur 6) för tre olika våglängder. Belysning med 360 nm, 400 nm eller 500 nm leder till endast enmarginell temperaturökning. Sammantaget anordningen som presenteras här gör det möjligt att reproducerbart belysning av temperaturreglerade cellprover som skall mätas i en flödescytometer.
Photoswitching av Dronpa
En expressionsvektor som kodar för ett Dronpa-Linker-Dronpa 13,16 fusionskonstruktionen klonades och transduceras in i Ramos B-celler. Såsom avbildas i Figur 7, var målet att styra konformationen av detta fusionsprotein med ljus med specifika våglängder. Med hjälp av vår enhet, var den cytosoliska Dronpa-Linker-Dronpa fusionsprotein photoswitched flera gånger (figur 8, vänster). Växla till mörkt tillstånd sker långsamt, medan byta till den ljusa tillståndet händer nästan omedelbart. Den spontana fluorescens återhämtning av Dronpa i mörkret visar att effektiv photoswitching till den ljusa formen kräver särskild belysning ochendast sker långsamt spontant (figur 8, höger).
Vi utförde en kinetisk analys av de photoswitching egenskaper (Figur 9). I backen för omkopplings kinetiken beräknades för den initiala 4 min av belysning. Lutningen för den spontana återhämtningen beräknades för den inledande fyra minuter i mörker.
Den kinetiska analysen visar att Dronpa photoswitching hastigheten är överlag mycket reproducerbar. Däremot är spontan återhämtning av Dronpa fluorescens i mörker mycket ineffektivt. Även efter längre inkubation i mörker, är endast ca 10% av den Dronpa fluorescens återvinns. Detta visar att verkligen belysningen i vår enhet framkallar photoswitching.
Om man använder den beskrivna metoden, kan vi generera realtid photoswitching data i en flödescytometer, vilken kanöversättas till en kinetisk utvärdering av många optogenetic verktyg.
Figur 1: Konstruktion plan för det yttre skiktet. Alla avbildade bitarna är specialtillverkade från polyvinylklorid (PVC). Bit A: Cylindrisk PVC bit med borrade hål för att sätta lysdioder och rörclip. Piece B: Den yttre manteln för att skydda LED från fysiska skador. Bit C: Röret klipp som förbinder den inre håligheten med gummirör för att möjliggöra för vattenkylning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Konstruktion planen för det inre skiktet. Alla avbildade bitar är gjorda av plexiglas. Bit D: Detta stycke består av tre delar D1, D2 och D3 och bildar enheten omsluter FACS röret. Piece D1: Cylindrisk Plexiglas-rör. Bit D2: Bottom lock för det inre skiktet. Bit D3: Lock för det inre skiktet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Använda enheten med en flödescytometer. A1: Prov inloppet till en flödescytometer; A2: FACS rör anslutet till intags; B: Enheten innesluter FACS rör; C: Prov inlopp; D: Prov inlopp med enheten.ove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Workflow schema över anordningen. A: Celler är belysta i anordningen (nederst till vänster) och samtidigt tas upp och analyseras i flödescytometern (uppe till vänster). Detta tillåter, till exempel, analys av de kinetiska egenskaperna för ett optogenetic verktyg (överst till höger). B: tvärsnitt av anordningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Processflödesdiagram av anordningen. En eller mor e LED-lampor av specifika våglängder belysa cellprovet i en FACS rör. Lysdioderna är omgiven av vatten, som ständigt växlas av ett uppvärmt bad cirkulator för att hålla temperaturen av cellprovet stabil. För levande cellförsök, temperaturen justeras till 37 ° C. Under denna temperaturstyrd belysning, celler tas upp i flödescytometern för analys. Denna setup tillåter, till exempel, för att analysera de kinetiska egenskaperna hos ett optogenetic verktyg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: temperatur upplyst PBS över tiden. 1 ml PBS i ett glas FACS-rör var upplyst över tiden med 360 nm ljus, 400 nm ljus eller 500 nm ljus.ladda / 54.707 / 54707fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Modell för photoswitching av Dronpa-Linker-Dronpa protein. Belysning med 400 nm ljus kommer dimerisera (och tetramerize) Dronpa och göra den fluorescerande. Belysning med 500 nm ljus kommer att leda till dissociation av de Dronpa proteiner, där monomer Dronpa är icke-fluorescerande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Karakterisering av Dronpa photoswitching egenskaper med hjälp av LED Thermo Flow kombination med f låg cytometri. Cellerna belyst såsom anges ovanför X-axeln och Dronpa genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) avbildas med tiden. Den Dronpa-Linker-Dronpa fusionsprotein kan photoswitched flera gånger använder enheten (till vänster). Spontan återhämtning av Dronpa fluorescensintensiteten uppträder endast långsamt och ineffektivt (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Kinetisk analys av Dronpa photoswitching. Kinetiken för Dronpa photoswitching beräknades för den initiala 4 min. av belysning och återhämtningen beräknades för den inledande fyra minuter. inkubation i mörker såsom indikeras av de färgade områdena. Backarna för varje beräkning visas i fetstil siffror.ource.jove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig9large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lysdioden Thermo Flow är en innovativ anordning för att studera optogenetic verktyg i en flödescytometer.
Hittills har optogenetic prover belysts endast med mikroskopi laser eller ficklampa anordningar 11,12. Beroende på vinkeln och avståndet av ficklampan till provet, är avsevärd variation i mängden belysning förväntas mellan experiment. Dessutom finns det en gräns för hur många ficklampor en enda person kan fungera i ett experiment. Detta begränsar den experimentella repertoar och reproducerbarhet. Dessa begränsningar togs upp under utvecklingen av vår enhet, som kan användas för att karakterisera realtid photoswitching kinetik i levande celler. Såvitt vi vet, finns ingen jämförbar anordning.
I den aktuella konfigurationen, kan upp till 30 lysdioder byggas in en Thermo Flow kammare. Beroende på den önskade ljusnivåer för varje våglängd, kan en enda enhet vara ossed för en bred variation av optogenetic verktyg. De etablerade photoswitching protokoll kan då optimeras för funktionella avläsning, t.ex. mätningar kalciumflödes. Vår anordning kan vara lämpliga för andra optiskt kontrollerade substanser, såsom caged föreningar eller fotoaktiverbara fluoroforer.
Beroende på den vetenskapliga frågan och provet som används, kan individuella protokoll upprättas snabbt. Användningen av glasrör istället för polystyren eller polypropenrör rekommenderas att begränsa Ijusinducerad cytotoxicitet vid våglängder mellan 400-500 nm. Alla testade cellinjer levde belysning (360 nm, 400 nm eller 500 nm) under upp till en timme i glasrör. Vi försökte utreda orsaken till celldöd under belysning i plaströr genom att utföra överföringsexperiment. Vi belysta cellerna i PBS eller RPMI med ljus av olika våglängder och överförs sedan supernatanten till icke-belysta celler för att mäta celldöd. Inget av det uppsamladesupernatanter orsakade betydande celldöd i mottagarceller (data visas ej). Dessutom är temperaturen på belysta PBS i polystyren eller polypropenrör nästan identisk med temperaturen i glasrör. Därför kan vi bara spekulera om orsaken till celldöd. Upplyst plast kan frigöra en instabil substans eller strålning av en våglängd som är giftigt för celler.
Valet av medium som används för varje experiment är viktig. Buffertkapaciteten måste övervägas och olika reagenser, liksom pH-indikatorer, absorbera olika våglängder i olika grad. Vidare skiljer sig cellöverlevnad signifikant, till exempel, när man jämför FCS-free till FCS-innehållande media.
Målet med ljus titrering är att använda minimal mängd av ljus som krävs för maximal photoswitching. För de flesta experiment, är det fördelaktigt att maximera hastigheten på photoswitch och därmed maximera ljusintensitet. Men, beroende på wavelength och celltyp, kan lätt få direkta effekter på signaleringen beteende, vilket är anledningen till överdriven belysning bör undvikas.
Det är möjligt att programmera ljus scheman för vår enhet och ansluta den till en dator som är gemensam för andra lätta enheter. Men eftersom de flesta flödescytometrar är i vanliga arbetsplatser som delas av ett stort antal olika labs, är det bäst att bibehålla anordningen så liten och bärbar som möjligt. Vidare vid manuell hantering av vår anordning för en setup två-färg som presenteras här är så enkelt, skulle det programmering endast marginellt förbättra den experimentella proceduren.
Sammantaget presenterar vi här en innovativ anordning, som kombinerar kraften av optogenetic verktyg och flödescytometri. Detta kommer att avsevärt förenkla karakterisering och utveckling av optogenetic verktyg in vivo och expandera den experimentella repertoaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12x75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
- Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T.
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
- Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
- Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898 (2015).
- Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925 (2014).
- Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
- Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
- Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
- Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Givan, A. L.
- Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).
