Introduction
Optogenetic verktøy har blitt stadig mer populært, delvis fordi de kan brukes til å dechiffrere kabling av signalveier 1-4. De er basert på evnen til photoactivatable proteiner til å endre sin konformasjon og bindingsaffinitet når belyst med lys. Fusing disse proteinene å signalelementer gjør det mulig for den konkrete reguleringen av en enkelt aktør innen komplekse intracellulære signalveier 5-12. Følgelig kan en signalveien bli studert med høy tidsmessig og romlig oppløsning.
De fleste cellebaserte undersøkelser optogenetic utnytte mikroskopi-baserte metoder kombinert med dyrking i nærvær av lys, etterfulgt av biokjemisk analyse 11,12. I motsetning til dette, et flowcytometer singularizes celler langs en kapillær og måler cellestørrelse, granularitet og fluorescensintensiteter. Denne metoden har store fordeler i forhold til mikroskopi eller biokjemiske metoder, inkludert muligheten til å analysere thousands av levende celler ved enkelt-celle-oppløsning i en meget kort tid. Derfor er det ønskelig å kombinere optogenetics med flowcytometri.
Så vidt vi vet, er det ingen etablert protokoll for optogenetic flowcytometri. En bredt akseptert prosedyre er å belyse celler manuelt fra utsiden reaksjonsrøret med lommelykt enheter. Imidlertid manuell belysning i flowcytometer krever at lyset passerer gjennom reaksjonsrøret, og for levende celle avbildning, en sylindrisk, oppvarmet vannkammer. Dette fører til betydelig lysspredning og tap av lys. Videre er lysintensiteten gitt ved manuell belysning ikke reproduserbare mellom eksperimenter (vinkel, avstand, etc.), og det er en praktisk grense for hvor mange bølgelengder i ett eksperiment.
Ved å konstruere LED Thermo Flow enhet, var vi i stand til å overvinne disse begrensningene. Med denne enheten, kan cellene bli belyst med bestemte bølgelengder i en temperature-kontrollert måte under strømningscytometriske målinger. Dette gjør det mulig for nøyaktige og reproduserbare mengder lys i og mellom eksperimenter.
For å demonstrere nytten av vår enhet in vivo, har vi registrert fluorescenssignalet av Dronpa på Ramos B-celler i løpet av photoswitching. Ramos B-celler er avledet fra et human Burkitt lymfom. Dronpa er et fluorescerende protein som eksisterer som en monomer, dimer eller tetramer. I sin monomere form, er det ikke-fluorescerende. Belysning med 400 nm lys induserer dimerization og tetramerization og gjengir Dronpa protein fluorescerende. Denne prosessen kan bli reversert ved belysning med 500 nm lys. Den Dronpa proteinet har blitt brukt til å styre funksjon og plassering av signaleringsproteiner 4,13.
Her uttrykte vi en Dronpa-linker-Dronpa protein i Ramos B-celler til å studere photoswitching av Dronpa i et strømningscytometer. Ved hjelp av vår enhet, var vi i stand til å effektivt ogreproduserbart photoswitch Dronpa under innspilling sin fluorescens intensitet i sanntid. Denne metoden gir betydelige fordeler i forhold til dagens belysning protokoller med manuell belysning og betydelig utvider eksperimentelle repertoar for optogenetic verktøy og bur forbindelser. Ved hjelp av vår enhet vil vesentlig forenkle og akselerere oppdagelsen og utviklingen av nye optogenetic verktøy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. designe og bygge Enhets
- pilot Eksperimenter
MERK: Den nødvendige lysintensitet for en bestemt optogenetic verktøy og celletype kan variere betydelig. Pilot forsøk med prototyper er nyttige for å estimere den minimale intensitet nødvendige lys. Den optogenetic verktøyet brukes til følgende eksperimenter er en Dronpa-linker-Dronpa fusjonskonstruksjon. Den Dronpa sekvensen ble kommersielt oppnådd (se liste over Materials). En lang linker ble klonet inn mellom to Dronpa sekvenser for å tillate det uttrykte konstruksjonen til å danne intramolekylære (og intermolekylære) dimerer. Trinnene er beskrevet nedenfor kan tilpasses til mange andre optogenetic verktøy eller optisk kontrollerte stoffer.- Transduce Ramos B-lymfocytter med en Dronpa-linker-Dronpa inneholder konstruere følge produsentens instruksjoner for transduksjon med retroviral-holdig supernatant fra emballasje celler. Harvest og telle celler i henhold til et forhåndsfra stillingen publisert protokoll 13.
- Resuspender celler ved en konsentrasjon på 1 x 10 6 / ml i medium (RPMI 1640, 10% varme-inaktivert FCS, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 U / ml streptomycin og 50 pM 2-mercaptoethanol) og overføre dem til et glass FACS tube.
- Før røret inn i et strømningscytometer og måle fluorescensintensiteten av Dronpa (GFP kanal) 14,15.
- Bruk vernebriller for alle ytterligere skritt for å beskytte øynene mot muligens skadelige bølgelengder.
- manuelt legge en 500 nm LED lys på utsiden av røret, og fortsette å måle fluorescensintensiteten av Dronpa.
- Øke antallet og / eller intensitet av LED lys før Dronpa fluorescens intensitet avtar.
- manuelt legge en 400 nm LED lys på utsiden av røret, og fortsette å måle fluorescensintensiteten av Dronpa.
- Øke antallet og / eller intensiteten av LED-lys til Dronpa fluorescence intensiteten øker.
- Bruk minst like mange LED-lys for å bygge enheten som spådd å være nødvendig fra photoswitching i trinn 1.1.5 og 1.1.7.
- Bygge enheten
MERK: Enheten ble bygget av en profesjonell maskinering butikk, Arbeitsgruppe Technik fra Universitetet i Freiburg. De fleste delene er skreddersydde og ikke kommersielt tilgjengelig. De nøyaktige dimensjoner av hver del er vist i figurene 1 og 2. For å klargjøre montering av denne enheten, er Supplerende Video 1 gitt og de mest grunnleggende trinnene er beskrevet nedenfor.- Mølle stykke A fra polyvinylklorid (PVC) med nøyaktige mål som er vist på figur 1A.
- Sett LED-lys inn i hullene av stykket A og forsegle hvert hull med PVC lim for å unngå vannlekkasje.
- Koble LED til en flerkanals transformator (hver bølgelengde bør oppta en egen flael) med en justerbar utgangseffekt 0-29 mA.
- Fest den ytre kappen (B) med 3 skruer til stykket A som avbildet å beskytte lysdioder mot fysisk skade.
- For å være i stand til å koble enheten til en vannpumpe, lim på tube klipp (C) inn i hullene av stykket A (avbildet i Figur 1a, tverrsnitt Y: 9 mm og 61,5 mm) med PVC lim.
- Skjær et 58,5 mm lang Pleksiglass tube (D1).
- Fremstilling stykker D2 og D3 fra pleksiglass som vist i figur 2.
- Lim stykke D3 til bunnen av D1 med pleksiglass lim.
- Fest en gummi O-ring til stykket D2 og lim den til toppen av D1 med plexiglass lim.
MERK: Brikkene D1, D2 og D3 sammen danner stykke D. - Sett stykke D i arb A med 3 skruer.
- Test enheten for vannlekkasje før man søker makt til transformatoren.
2. Måling av Kinetics av en optogenetic Tool
- Kultur Ramos B-celler i RPMI-medium (RPMI 1640, 10% varme-inaktivert FCS, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 U / ml streptomycin og 50 mM 2-merkaptoetanol) i en tetthet på 3- 10 x 10 6 celler / ml ved 37 ° C og 5% CO2.
- Høste Ramos B-celler ved sentrifugering ved 350 xg og 4 ° C i 5 minutter.
- Telle celler ved hjelp av et Neubauer tellekammer etter produsentens anvisninger og resuspender 1-5 x 10 6 celler i 600 mL medium.
- Overfør cellene til et glass FACS tube, sette dem på is og beskytte dem mot lys til målingen.
- Koble enheten til et oppvarmet vannpumpe og justere temperaturen til 37 ° C.
- Ved bruk av glass FACS-rør, bytte ut det sorte O-ring av flowcytometer med en gummi O-ring, og i tillegg gjelder silisium grletthet.
- Sett forsiktig glasset FACS rør inn i enheten og koble den til flowcytometeret (figur 3).
- Start målingen og registrere Dronpa fluorescerende intensitet (GFP kanal).
- Belyse celleprøve med 400 nm eller 500 nm lys henhold og registrere Dronpa fluorescens intensitet (GFP kanal).
- Analyser eksperimentelle data med passende strømningscytometer programvare. Plot frem scatter mot sideveis scatter og gate levende celler. Plott Dronpa fluorescens intensitet over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruke LED Thermo Flow med en Flowcytometer
Funksjonelle kjerne av anordningen er et sylindrisk kammer i hvilket LED-lysene er anordnet på en sirkulær måte som peker innover. Dette kammer kan kobles til en vannforsyning og pumpe, som gir mulighet for regulering av temperaturen av LED-enhetene, samt celleprøve. Lysdiodene er koblet til en transformator og følgelig lysintensiteten for hver bølgelengde kan reguleres individuelt. Midten av enheten har plass til en standard størrelse FACS rør som kan kobles til de fleste vanlige flowcytometere (figurene 4 og 5). For å vise at belysning i vårt anordningen ikke fører til uønsket oppvarming av cellene, målte vi temperaturen belyst PBS over tid (figur 6) for tre forskjellige bølgelengder. Belysning med 360 nm, 400 nm eller 500 nm fører til bare enmarginal temperaturøkning. Alt i alt tillater anordningen presentert her for reproduserbar belysning av temperaturregulert celleprøve som skal måles i et flowcytometer.
Photoswitching av Dronpa
En ekspresjonsvektor som koder for et Dronpa-Linker-Dronpa 13,16 fusjonskonstruksjon som ble klonet og omformet til Ramos B-celler. Som vist i figur 7, var målet å kontrollere konformasjon av dette fusjonsprotein med lys av bestemte bølgelengder. Ved hjelp av vår enhet, ble cytosoliske Dronpa-linker-Dronpa fusjonsprotein photoswitched flere ganger (figur 8, venstre). Bytte til den mørke tilstanden utvikler seg langsomt, mens du bytter til den lyse staten skjer nesten umiddelbart. Den spontane fluorescens utvinning av Dronpa i mørket viser at effektiv photoswitching til den lyse skjemaet krever spesiell belysning ogbare langsomt oppstår spontant (figur 8, høyre).
Vi utførte en kinetisk analyse av photoswitching egenskaper (figur 9). Bakkene for bytte kinetikk ble beregnet for den første 4 min av belysning. Helningen for den spontane gjenvinning ble beregnet for den innledende 4 min i mørket.
Den kinetiske analysen viser at Dronpa photoswitching hastigheten er generelt veldig reproduserbar. I motsetning til dette, spontan utvinning av Dronpa fluorescens i mørket er svært ineffektiv. Selv etter lengre inkubasjon i mørket, er bare omtrent 10% av den fluorescens Dronpa gjenvunnet. Dette viser at faktisk belysning i vår enhet induserer photoswitching.
Derfor, ved å bruke den beskrevne metoden, kan vi generere sanntids photoswitching data i et strømningscytometer som kansettes til en kinetisk vurdering av mange optogenetic verktøy.
Figur 1: Konstruksjon plan av det ytre lag. Alle avbildet brikkene er spesiallaget av polyvinylklorid (PVC). Piece A: Sylindrisk PVC stykke med boret hull for å sette lysdioder og tube klipp. Piece B: Ytre kappen for å beskytte lysdiodene mot fysisk skade. Piece C: Røret klipp som forbinder det indre hulrom med gummi rør for å tillate vannkjøling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Konstruksjon plan av det indre lag. Alle avbildet brikkene er laget av pleksiglass. Stykket D: Dette stykke består av tre stykker D1, D2 og D3 og danner enheten omslutter FACS røret. Piece D1: Sylindrisk Pleksiglass tube. Stykket D2: Bunnen lokk av det indre lag. Stykket D3: Lokk av det indre lag. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Bruke enheten med et flowcytometer. A1: Eksempel innløpet til et strømningscytometer; A2: FACS rør forbundet til prøveinnløpet; B: Enheten som omslutter FACS rør; C: Eksempel innløp; D: Eksempel på innløp med enheten.ove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Arbeidsflyt skjematisk av enheten. A: Cellene er opplyst i enheten (nederst til venstre) og samtidig tatt opp og analysert i strømningscytometeret (øverst til venstre). Dette muliggjør, for eksempel, analyse av de kinetiske egenskapene til et optogenetic verktøy (øverst til høyre). B: tverrsnitt av anordningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Prosessforløp Diagram av enheten. En eller mor e LED lys av bestemte bølgelengder belyse celleprøve i en FACS tube. Lysdiodene er omgitt av vann, som skiftes kontinuerlig ved et oppvarmet bad sirkulator for å holde temperaturen i cellen prøven stabil. For levende celleforsøk, ble temperaturen regulert til 37 ° C. I løpet av denne temperaturkontrollert belysning, blir cellene tatt opp i strømningscytometer for analyse. Dette oppsettet gjør det mulig, for eksempel, for å analysere de kinetiske egenskapene til et optogenetic verktøy. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Temperatur av belyst PBS over tid. 1 ml PBS i et glass FACS rør ble belyst over tid med 360 nm lys, 400 nm lys eller 500 nm lys.laste opp / 54707 / 54707fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Modell for photoswitching av den Dronpa-Linker-Dronpa protein. Belysning med 400 nm lys vil dimerisere (og tetramerize) Dronpa og gjengi det fluorescerende. Belysning med 500 nm lys vil føre til dissosiasjon av Dronpa proteiner, hvor monomere Dronpa er ikke-fluoriserende. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: Karakterisering av Dronpa photoswitching egenskaper ved hjelp av LED-Thermo Flow kombinert med f lav cytometri. Celler ble belyst som angitt ovenfor X-aksen og den Dronpa bety fluorescensintensitet (MFI) er vist over tid. Den Dronpa-linker-Dronpa fusjonsprotein kan photoswitched flere ganger bruker enheten (til venstre). Spontan bedring av Dronpa fluorescens intensitet bare skjer sakte og ineffektivt (til høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: Kinetic analyse av Dronpa photoswitching. Kinetikken til Dronpa photoswitching ble beregnet for den innledende 4 min. for belysning og utvinning ble beregnet for den første 4 min. inkubering i mørket som indikert ved de fargede områder. Bakkene for hver beregning er avbildet i fet tall.ource.jove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig9large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LED Thermo Flow er en innovativ enhet for å studere optogenetic verktøy i et flowcytometer.
Så langt har optogenetic prøvene blitt opplyst bare med mikros laser eller lommelykt enheter 11,12. Avhengig av vinkelen og avstanden til lommelykten til prøven, er betydelig variasjon i mengden av lys forventes mellom eksperimenter. Videre er det en grense for hvor mange lommelykter en enkelt person kan operere i et eksperiment. Dette begrenser den eksperimentelle repertoaret og reproduserbarhet. Disse begrensningene ble tatt opp under utviklingen av vår enhet, som kan anvendes for å karakterisere sanntids photoswitching kinetikk i levende celler. Så vidt vi vet, finnes det ingen tilsvarende enhet.
I den gjeldende konfigurasjonen, kan opptil 30 lysdioder bygges inn i en Thermo Flow kammer. Dermed avhengig av de nødvendige lysintensitet for hver bølgelengde, kan en enkelt enhet være ossed for et bredt spekter av optogenetic verktøy. De etablerte photoswitching protokoller kan da være optimalisert for funksjonell leselig, f.eks kalsium flux målinger. Vår enhet kan være passende for andre optisk kontrollerte substanser, slik som i bur forbindelser eller photoactivatable fluoroforer.
Avhengig av vitenskapelige spørsmål og prøven som brukes, kan individualiserte protokoller etableres raskt. Bruken av glassrør i stedet for polystyren eller polypropylen rør er anbefalt å begrense lys-indusert cytotoksisitet på bølgelengder mellom 400-500 nm. Alle de testede cellelinjer som overlevde lys (360 nm, 400 nm eller 500 nm) i opptil én time i glassrør. Vi har forsøkt å undersøke årsaken til celledød under belysningen i plastrør ved å utføre overføringseksperimenter. Vi belyst celler i PBS eller i RPMI med lys av forskjellige bølgelengder og deretter overføres supernatanten til ikke-belyste celler for å måle celledød. Ingen av de innsamledesupernatanter forårsaket betydelig celledød i mottakercellene (data ikke vist). Dessuten er temperaturen på opplyst PBS i polystyren eller polypropylen-rør nesten identisk med temperaturen i glassrør. Derfor kan vi bare spekulere på årsaken til celledød. Opplyst plast kan frigi en ustabil substans eller stråling med en bølgelengde som er toksisk for cellene.
Valget av mediet som brukes for hvert forsøk er viktig. Bufferkapasitet må vurderes og ulike reagenser, som pH-indikatorer, absorberer forskjellige bølgelengder i forskjellig grad. Videre skiller celleoverlevelse i betydelig grad, for eksempel når man sammenligner FCS-fri til FCS-inneholdende media.
Målet med lys titrering er å anvende den minimale mengden av lys som er nødvendig for maksimal photoswitching. For de fleste eksperimenter, er det fordelaktig å maksimalisere hastigheten til photoswitch og dermed maksimere lysintensitet. Men, avhengig av wavelength og celletype, kan lyset ha direkte effekter på signaliserings oppførsel, og det er derfor overdreven belysningen bør unngås.
Det er mulig å programmere lys tidsplaner for vår enhet og koble den til en datamaskin som er vanlig for andre lette enheter. Men siden de fleste flowcytometere er i vanlige arbeidsplasser som deles av mange forskjellige laboratorier, er det best å holde enheten som små og bærbare som mulig. Videre manuell håndtering av vår enhet for en to-farge oppsett som presenteres her er så enkelt, ville det programmering bare marginalt bedre eksperimentelle prosedyren.
Til sammen presenterer vi her en innovativ enhet, som kombinerer kraften av optogenetic verktøy og flowcytometri. Dette vil vesentlig forenkle den karakteriseringen og utviklingen av optogenetic verktøy in vivo, og ekspandere den eksperimentelle repertoaret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12x75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
- Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T.
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
- Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
- Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898 (2015).
- Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925 (2014).
- Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
- Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
- Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
- Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Givan, A. L.
- Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).
