Introduction
Herramientas Optogenética han ido ganando popularidad, en parte debido a que se pueden utilizar para descifrar el cableado de las vías de señalización de 1-4. Se basan en la capacidad de las proteínas fotoactivables para cambiar su conformación y de unión por afinidad cuando se ilumina con la luz. La fusión de estas proteínas a los elementos de señalización permite la regulación específica de un solo jugador dentro de complejas vías de señalización intracelular 5-12. Por consiguiente, una vía de señalización puede ser estudiado con alta resolución temporal y espacial.
La mayoría de los estudios optogenética basados en células utilizan métodos basados en la microscopía combinado con el cultivo en presencia de luz, seguido de análisis bioquímico 11,12. Por el contrario, un flujo singulariza citómetro de células a lo largo de un capilar y mide el tamaño celular, la granularidad y la intensidad de fluorescencia. Este método tiene ventajas importantes sobre microscopía o bioquímicos métodos, incluyendo la capacidad de analizar thousands de células a una resolución de una sola célula de vivir en un tiempo muy corto. Por lo tanto, es deseable combinar optogenética con citometría de flujo.
Hasta donde sabemos, no existe un protocolo establecido para citometría de flujo optogenético. Un procedimiento ampliamente aceptado es iluminar manualmente las células desde el exterior del tubo de reacción con dispositivos de linterna. Sin embargo, la iluminación en el manual de flujo requiere citómetro de que la luz pase a través del tubo de reacción y, por imágenes de células vivas, una forma cilíndrica, cámara de agua caliente. Esto hace que la dispersión de luz y sustancial pérdida de luz. Por otra parte, la intensidad de la luz proporcionada por la iluminación manual no es reproducible entre experimentos (ángulo, distancia, etc.) y hay un límite práctico para el número de longitudes de onda en un experimento.
Mediante la construcción del dispositivo de flujo Thermo LED, hemos sido capaces de superar estas limitaciones. Con este dispositivo, las células pueden ser iluminadas con longitudes de onda específicas en un tempratura controlada de forma durante las mediciones de citometría de flujo. Esto permite que las cantidades precisas y reproducibles de la luz dentro y entre los experimentos.
Para demostrar la utilidad de nuestro dispositivo in vivo, se registró la señal de fluorescencia de Dronpa en las células B Ramos durante photoswitching. células Ramos B se derivan de un linfoma de Burkitt humano. Dronpa es una proteína fluorescente que existe como un monómero, dímero o tetrámero. En su forma monomérica, es no fluorescente. Iluminación con luz de 400 nm induce la dimerización y tetramerización y hace que la proteína fluorescente Dronpa. Este proceso puede ser revertido por iluminación con luz de 500 nm. La proteína Dronpa se ha utilizado para controlar la función y la ubicación de las proteínas de señalización de 4,13.
Aquí, hemos expresado una proteína Dronpa engarce-Dronpa en las células B Ramos para estudiar photoswitching de Dronpa en un citómetro de flujo. El uso de nuestro dispositivo, hemos sido capaces de manera eficiente yreproducible PHOTOSWITCH Dronpa durante la grabación de su intensidad de fluorescencia en tiempo real. Este método ofrece ventajas sustanciales sobre los protocolos actuales de iluminación con la iluminación manual y amplía considerablemente el repertorio experimental para herramientas optogenética y compuestos jaula. El uso de nuestro dispositivo simplificará significativamente y acelerar el descubrimiento y desarrollo de nuevas herramientas optogenética.
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Protocol
1. El diseño y la construcción del artificio
- Los experimentos piloto
NOTA: La intensidad de la luz requerida para un tipo de herramienta y células optogenético específico puede variar significativamente. Los experimentos piloto con prototipos son útiles para estimar la intensidad de luz mínima necesaria. La herramienta optogenético utilizado para los siguientes experimentos es una construcción de fusión Dronpa-Enlazador Dronpa. Se obtuvo la secuencia comercialmente Dronpa (Ver Lista de Materiales). A largo enlazador se clonó en entre dos secuencias Dronpa para permitir que el constructo expresado para formar dímeros intramoleculares (e intermoleculares). Los pasos descritos a continuación se pueden adaptar a muchas otras herramientas optogenética o sustancias ópticamente controladas.- Transducir los linfocitos B Ramos con un constructo que contiene Dronpa-Enlazador Dronpa siguiendo las instrucciones del fabricante para la transducción utilizando el sobrenadante que contiene retroviral de células de empaquetamiento. Cosecha y celdas de conteo de acuerdo con un prepublicada riormente protocolo 13.
- Resuspender las células a una concentración de 1 x 10 6 / ml en medio (RPMI 1640, 10% FCS inactivado por calor, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 U / ml de estreptomicina y 50 mM 2-mercaptoetanol) y transferirlos a un tubo de FACS de vidrio.
- Insertar el tubo en un citómetro de flujo y medir la intensidad de fluorescencia de Dronpa (canal GFP) 14,15.
- Utilice gafas de protección para todas las medidas adicionales para proteger los ojos de longitudes de onda posiblemente perjudiciales.
- colocar manualmente una luz LED 500 nm en el exterior del tubo y continuar midiendo la intensidad de fluorescencia de Dronpa.
- Aumentar el número y / o la intensidad de las luces LED hasta que la intensidad de fluorescencia Dronpa disminuye.
- colocar manualmente una luz LED 400 nm en el exterior del tubo y continuar midiendo la intensidad de fluorescencia de Dronpa.
- Aumentar el número y / o la intensidad de las luces LED hasta que el fluo Dronpacencia aumenta la intensidad.
- Utilice al menos tantas luces LED para la construcción del dispositivo como se prevé que sea necesario desde el photoswitching en los pasos 1.1.5 y 1.1.7.
- La construcción del dispositivo
NOTA: El dispositivo fue construido por un taller de mecanizado profesional, el Arbeitsgruppe Technik de la Universidad de Friburgo. La mayoría de las piezas son hechas a medida y no está disponible comercialmente. Las dimensiones exactas de cada parte se representan en las figuras 1 y 2. Para aclarar el montaje de este dispositivo, complementaria de vídeo 1 se proporciona y los pasos más esenciales se describe a continuación.- Molino pieza A partir de cloruro de polivinilo (PVC) con las medidas exactas que se muestran en la Figura 1A.
- Inserte las luces LED en los agujeros perforados de pieza A y cerrar cada agujero con pegamento para PVC para evitar fugas de agua.
- Conectar los LED a un transformador multicanal (cada longitud de onda debe ocupar un chann separadael) con una potencia de salida ajustable de 0-29 mA.
- Coloque la cubierta exterior (B) con 3 tornillos a la pieza A como se representa para proteger el LED contra daño físico.
- Para poder conectar el dispositivo a una bomba de agua, pegamento en los clips de tubo (C) en los agujeros perforados de pieza A (representada en la figura 1a, la sección transversal Y: 9 mm y 61,5 mm) con pegamento de PVC.
- Cortar un largo tubo de plexiglás 58,5 mm (D1).
- Fabricación piezas D2 y D3 de Plexiglas como se representa en la Figura 2.
- piece pegamento D3 de la parte inferior de D1 con Plexiglas pegamento.
- Adjuntar una junta tórica de caucho a la pieza D2 y péguelo en la parte superior de D1 con plexiglás pegamento.
NOTA: Las piezas D1, D2 y D3 juntos forman pieza D. - Insertar pieza D en la pieza A con 3 tornillos.
- Pruebe el dispositivo para la salida del agua antes de suministrar energía al transformador.
2. Medición de la cinética de una herramienta Optogenética
- Cultura células Ramos B en RPMI-medio (RPMI 1640, 10% FCS inactivado por calor, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 U / ml de estreptomicina y 50 mM 2-mercaptoetanol) a una densidad de 3- 10 x 10 6 células / ml a 37 ° C y 5% de CO2.
- Cosecha Ramos B células por centrifugación a 350 xg y 4 ° C durante 5 min.
- Recuento de células utilizando una cámara de recuento Neubauer siguientes instrucciones del fabricante y resuspender 1-5 x 10 6 células en 600 l de medio.
- Transferir las células a un tubo de vidrio de FACS, ponerlos en hielo y protegerlos de la luz hasta la medición.
- Conectar el dispositivo a una bomba de agua caliente y ajustar la temperatura a 37 ° C.
- Cuando se utilizan tubos de FACS vidrio, intercambiar el negro junta tórica del citómetro de flujo con una junta tórica de caucho y, además, aplicar gr de siliciofacilitar.
- Introduzca con cuidado el tubo de FACS de vidrio en el dispositivo y conectarlo con el citómetro de flujo (Figura 3).
- Iniciar la medición y registrar Dronpa intensidad fluorescente (GFP canal).
- Iluminar la muestra de células con 400 nm o 500 nm de luz, respectivamente, y registrar la intensidad de fluorescencia Dronpa (canal GFP).
- Analizar los datos experimentales con flujo adecuado citómetro de software. Gráfico de dispersión hacia adelante contra la dispersión lateral y la puerta de las células vivas. Trazar la intensidad de fluorescencia Dronpa lo largo del tiempo.
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Representative Results
Utilizando el flujo de Thermo LED con un citómetro de flujo
El núcleo funcional del dispositivo es una cámara cilíndrica en la que las luces LED están dispuestos en una forma circular que apunta hacia el interior. Esta cámara se puede conectar a un suministro de agua y la bomba, lo que permite controlar la temperatura de los LED, así como la muestra de células. Los LED están conectados a un transformador y, por tanto, la intensidad de la luz de cada longitud de onda se pueden controlar individualmente. El centro del dispositivo acomoda un tubo de tamaño FACS estándar, que se puede conectar a la mayoría de los citómetros de flujo estándar (Figuras 4 y 5). Para demostrar que la iluminación en nuestro dispositivo no conduce a un calentamiento no deseado de las células, se midió la temperatura de PBS iluminada con el tiempo (Figura 6) para tres longitudes de onda diferentes. Iluminación con 360 nm, 400 nm o 500 nm conduce a solamente unaaumento de la temperatura marginal. En general, el dispositivo que aquí se presenta permite la iluminación reproducible de muestras de células de temperatura controlada a medir en un citómetro de flujo.
Photoswitching de Dronpa
Un vector de expresión que codifica un constructo de fusión de 13,16 Dronpa-Enlazador Dronpa se clonó y se transduce en células Ramos B. Como se muestra en la Figura 7, el objetivo era controlar la conformación de esta proteína de fusión con la luz de longitudes de onda específicas. El uso de nuestro dispositivo, la proteína de fusión Dronpa engarce-Dronpa citosólica se photoswitched varias veces (Figura 8, izquierda). El cambio al estado oscuro se produce lentamente, mientras que la conmutación al estado brillante ocurre casi instantáneamente. La recuperación de fluorescencia espontánea de Dronpa en la oscuridad demuestra que photoswitching eficiente de la forma brillante requiere una iluminación específica ysólo se produce lentamente de forma espontánea (Figura 8, derecha).
Se realizó un análisis de la cinética de las propiedades photoswitching (Figura 9). Las pistas para la cinética de conmutación se calcularon para los 4 minutos iniciales de la iluminación. La pendiente para la recuperación espontánea se calculó para el 4 min inicial en la oscuridad.
El análisis cinético demuestra, que la velocidad photoswitching Dronpa es en general muy reproducible. En contraste, la recuperación espontánea de fluorescencia Dronpa en la oscuridad es muy ineficiente. Incluso después de incubación más largo en la oscuridad, sólo alrededor del 10% de la fluorescencia Dronpa se recupera. Esto demuestra que, efectivamente, la iluminación en nuestro dispositivo induce photoswitching.
Por lo tanto, utilizando el método descrito, podemos generar en tiempo real photoswitching datos en un citómetro de flujo, que puedetraducirse en una evaluación cinética de las muchas herramientas optogenética.
Figura 1: Plan de la construcción de la capa exterior. Todas las piezas representadas son hechas a medida a partir de cloruro de polivinilo (PVC). Una pieza: pieza cilíndrica de PVC con agujeros para insertar los LED y los tubos. Pieza B: La funda exterior para proteger el LED contra daño físico. Pieza C: El clip de tubo que conecta la cavidad interior con tubos de goma para permitir la refrigeración por agua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Plan de la construcción de la capa interior. Todas las piezas representadas están hechas de plexiglás. Pieza D: Esta pieza se compone de tres piezas D1, D2 y D3 y forma la unidad que encierra el tubo de FACS. Pieza D1: tubo cilíndrico de plexiglás. Pieza D2: Tapa inferior de la capa interna. Pieza D3: Tapa de la capa interior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Uso del dispositivo con un citómetro de flujo. A1: Entrada de la muestra de un citómetro de flujo; A2: tubo de FACS conectado a la entrada de la muestra; B: El dispositivo que encierra el tubo de FACS; C: Entrada de la muestra; D: Entrada de la muestra con el dispositivo.ove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Flujo de trabajo esquemática del dispositivo. A: Las células se iluminan en el dispositivo (parte inferior izquierda) y al mismo tiempo tomado y analizado en el citómetro de flujo (arriba a la izquierda). Esto permite, por ejemplo, el análisis de las propiedades cinéticas de una herramienta optogenético (parte superior derecha). B: la sección transversal del dispositivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Diagrama de flujo del proceso del dispositivo. Uno o mor LED E luces de longitudes de onda específicas iluminan la muestra de células en un tubo de FACS. Los LEDs están rodeadas por el agua, que está en constante intercambió por un circulador baño calentado para mantener la temperatura de la muestra de células estable. Para los experimentos de células vivas, la temperatura se ajusta a 37 ° C. Durante esta iluminación con control de temperatura, las células se recogen en el citómetro de flujo para el análisis. Esta configuración permite, por ejemplo, para analizar las propiedades cinéticas de una herramienta optogenético. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: La temperatura de PBS sistema de iluminación en el tiempo. 1 ml de PBS en un tubo de vidrio de FACS se iluminó en el tiempo con la luz de 360 nm, 400 nm de luz o luz de 500 nm.cargar / 54707 / 54707fig6large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Modelo de photoswitching de la proteína Dronpa engarce-Dronpa. Iluminación con luz de 400 nm se dimerize (y tetramerizarse) Dronpa y hacerla fluorescente. Iluminación con luz de 500 nm dará lugar a la disociación de las proteínas Dronpa, donde monomérica Dronpa es no fluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Caracterización de las propiedades photoswitching Dronpa utilizando el flujo de Thermo LED combinado con f citometría de baja. Las células se iluminan como se indica por encima del eje X y la intensidad de fluorescencia Dronpa media (MFI) se representa en el tiempo. La proteína de fusión Dronpa-Enlazador Dronpa puede photoswitched varias veces usando el dispositivo (izquierda). La recuperación espontánea de la intensidad de fluorescencia Dronpa sólo se produce lentamente y de manera ineficiente (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: El análisis cinético de Dronpa photoswitching. La cinética de Dronpa photoswitching se calcularon para la inicial de 4 min. de la iluminación y la recuperación se calculó para la inicial de 4 min. de incubación en la oscuridad, como se indica por las áreas de color. Las pistas para cada cálculo se representan en cifras en negrita.ource.jove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig9large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El flujo de Thermo LED es un dispositivo innovador para estudiar herramientas optogenética en un citómetro de flujo.
Hasta el momento, las muestras han sido optogenética sólo iluminada con rayos láser o dispositivos de microscopía linterna 11,12. Dependiendo del ángulo y la distancia de la linterna a la muestra, se espera que la variabilidad sustancial en la cantidad de iluminación entre los experimentos. Además, hay un límite en el número de linternas una sola persona puede operar en un experimento. Esto restringe el repertorio experimental y reproducibilidad. Estas limitaciones se trataron durante el desarrollo de nuestro dispositivo, que puede ser utilizado para caracterizar la cinética de photoswitching tiempo real en células vivas. Para nuestro conocimiento, no existe ningún dispositivo comparable.
En la configuración actual, hasta 30 LEDs pueden ser construidos en una cámara de flujo térmico. Por lo tanto, en función de las intensidades de luz requeridas para cada longitud de onda, un solo dispositivo puede ser nosotrosed para una amplia variedad de herramientas optogenética. Los protocolos photoswitching establecidos a continuación, se pueden optimizar para lecturas funcionales, por ejemplo, mediciones de flujo de calcio. Nuestro dispositivo puede ser adecuado para otras sustancias ópticamente controlados, tales como compuestos enjaulados o fluoróforos fotoactivables.
Dependiendo de la pregunta científica y muestra utilizada, protocolos individualizados pueden ponerse en marcha rápidamente. Se recomienda el uso de tubos de vidrio en lugar de tubos de poliestireno o polipropileno para limitar la citotoxicidad inducida por la luz en longitudes de onda entre 400-500 nm. Todas las líneas celulares ensayadas sobrevivieron iluminación (360 nm, 400 nm o 500 nm) para hasta una hora en tubos de vidrio. Tratamos de investigar la causa de la muerte celular durante la iluminación en tubos de plástico mediante la realización de experimentos de transferencia. Iluminamos células en PBS o RPMI con luz de diferentes longitudes de onda y luego se transfiere el sobrenadante de células no-iluminada para medir la muerte celular. Ninguno de los recogidossobrenadantes causaron una muerte celular significativa en las células receptoras (no se muestran datos). Además, la temperatura de PBS iluminado en poliestireno, o tubos de polipropileno es casi idéntica a la temperatura en tubos de vidrio. Por lo tanto, sólo podemos especular sobre la causa de la muerte celular. plástico Iluminado puede liberar una sustancia inestable o la radiación de una longitud de onda que es tóxico para las células.
La elección del medio utilizado para cada experimento es importante. La capacidad de amortiguación debe ser considerado y diferentes reactivos, como indicadores de pH, absorben diferentes longitudes de onda en diferentes grados. Además, la supervivencia celular difiere significativamente, por ejemplo, al comparar FCS libres de FCS que contiene medios de comunicación.
El objetivo de la titulación de la luz es usar la mínima cantidad de luz necesaria para la máxima photoswitching. Para la mayoría de los experimentos, es favorable para maximizar la velocidad de la photoswitch y por lo tanto maximizar la intensidad de la luz. Pero, en función de la wavelength y el tipo de células, la luz puede tener efectos directos sobre el comportamiento de señalización, por lo que la iluminación excesiva se debe evitar.
Es posible programar los horarios de luz para nuestro dispositivo y conectarlo a un ordenador como es común para otros dispositivos de luz. Sin embargo, como la mayoría de los citómetros de flujo están en lugares de trabajo comunes compartidos por numerosos laboratorios diferentes, lo mejor es mantener el dispositivo tan pequeño y portátil como sea posible. Por otra parte, la manipulación manual de nuestro dispositivo para una configuración de dos colores tal como se presenta aquí es tan simple, que la programación sería sólo marginalmente mejorar el procedimiento experimental.
Tomados en conjunto, presentamos aquí un dispositivo innovador, que combina la potencia de las herramientas optogenética y citometría de flujo. Esto simplificará considerablemente la caracterización y desarrollo de herramientas optogenética in vivo y ampliar el repertorio experimental.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12x75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
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