Abstract
ratinhos repórter têm sido amplamente utilizados para se observar a localização da expressão de genes alvo. Este protocolo centra-se em uma estratégia para estabelecer um novo modelo de rato transgénico repórter. Escolhemos para visualizar a expressão do gene interleucina (IL) 22 porque esta citoquina tem actividades importantes no intestino, onde contribui para a reparação de tecidos danificados por inflamação. Sistemas repórter oferecem vantagens consideráveis sobre outros métodos de identificação de produtos in vivo. No caso de IL-22, outros estudos havia células a partir de tecidos isolado pela primeira vez e, em seguida, re-estimularam as células in vitro. IL-22, que é normalmente secretada, foi aprisionado no interior das células utilizando um medicamento, e coloração intracelular foi usada para visualizar. Este método identifica células capazes de produzir IL-22, mas não determinar se eles estavam fazendo isso in vivo. O design repórter inclui a inserção de um gene para uma proteína fluorescente (tdTomato) para o gene de IL-22 de tal waY que a proteína fluorescente não pode ser segregada e, portanto, permanece preso no interior das células que produzem in vivo. Produtores fluorescentes podem então ser visualizado em secções de tecidos ou por meio de análise ex vivo através de citometria de fluxo. O processo de construção efectiva para o repórter incluídos recombineering um cromossoma artificial bacteriano que continha o gene de IL-22. Este cromossoma manipulado foi então introduzido no genoma do rato. Homeostático de IL-22 de expressão de repórter foi observada em diferentes tecidos de rato, incluindo o baço, timo, nódulos linfáticos, placas de Peyer, e no intestino, por análise de citometria de fluxo. A colite foi induzida por células T (CD4 + CD45RBhigh) de transferência, e expressão repórter foi visualizado. As células T positivas foram pela primeira vez presente nos linfonodos mesentéricos, e então eles acumulada no interior da lâmina própria das distais pequenos tecidos do intestino e cólon. A estratégia utilizando BACs deu expressão repórter boa fidelidade em relação a IL-22 expression, e é mais simples do que os procedimentos knock-in.
Introduction
expressão específica do tipo celular de genes repórter é útil para identificar as células que expressam activamente o alvo em tecidos sob estados homeostáticos e perturbados. Também permite a purificação destas células, que permanecem viáveis, para estudar as suas outras propriedades. Reporter ratinhos foram utilizados para elucidar o mecanismo de acção de citoquinas factores de transcrição específicos, e elementos reguladores. Estratégias anteriores 1, 2, 3, em grande medida invocado batendo o repórter para o locus alvo no cromossoma do rato, um procedimento demorado e dispendioso. Assim, um método mais simples para a geração de ratinhos repórter é desejável.
Citocinas são uma classe ampla de pequenas proteínas excretadas / péptidos que regulam as respostas imunitárias através da sinalização intercelular. A interleucina 22 (IL-22) é uma citoquina com muitos relataram actividades, incluindo fu barreiranction, reparação de tecidos, e inflamação 4. Embora a IL-22 foi inicialmente descoberto como um produto de células T 5, relatórios subsequentes demonstraram a sua expressão em células assassinas naturais (NK) em seres humanos e ratinhos 6 7 e em outras classes de linfócitos inatas 8. Apesar de extensa observação da IL-produzindo-22 células, visualização de IL-22 estimulação exigido anteriormente ex vivo e permeabilização a manchas com anticorpos. Portanto, o romance IL-22 ratos repórter seria uma ferramenta muito útil para investigar a função da IL-22 nos processos homeostáticos e patogênicos.
Aqui, nós desenvolvemos um modelo de ratinho transgénico repórter simplificado para observar as células IL-22 produtoras in vivo e in vitro. Usando um método TAS recombineering 9, que inserida a sequência de ADNc com poli A tdTomato fragmentos do sinal para a IL-22 locnós e substituído exão 1. As outras regiões, exons, e elementos reguladores não traduzidas não foram perturbado, uma vez que gostaria de imitar a regulação natural da IL-22, tanto quanto possível. O local de inserção repórter interrompe a sequência de sinal, resultando na acumulação do repórter no interior das células que produzem, ao contrário de IL-22 em si, que é rapidamente segregada. Este novo método também pode ser aplicado para a geração de ratinhos repórter de outras proteínas secretadas.
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Protocol
Todos os animais receberam a atenção adequada de acordo com os procedimentos experimentais descritos no Guia de 2011 para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório Comité das Frederick National Laboratory for Cancer Research.
1. Geração de IL-22-tdTomato Mice repórter por BAC recombineering
NOTA: Os ratos devem estar inconsciente e não se movem em resposta a um estímulo nocivo. Esterilizar a área cirúrgica com 70% de etanol e esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos usando um esterilizador de esferas de vidro.
- Purifica-se o DNA de BAC (RP23-401E11, comprimento clone 228391 pb), utilizando um método de extracção alcalina 10, 11. Caracterizar o clone BAC por Spel digestão de 5 ug de RP23-401E11 para confirmar o tamanho correcto do gene alvo. NOTA: O DNA BAC foi digerido em 14 fragmentos.
- Inserir o gene repórter TdTomato no sítio Not I / Sal I do shuttle vector PLD53SC-A-GFP-B11 e substituir o gene da GFP no mesmo local. Em seguida, utilizando RP23-401E11 BAC como molde, amplificar as caixas de homologia (A e B) para o primeiro exão traduzido de IL-22 (exão 1) por PCR (95 ° C, 2 min; 30 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 30 seg, e uma extensão final a 72 ° C durante 10 min). Num sistema de reacção de PCR de 50 uL, adicionar 50 ng (1 pi) de DNA de BAC, 0,5 ul de iniciadores (10 uM), 40 ul de PCR Supermix alta fidelidade, e 8 mL de H 2 O.
NOTA: Os iniciadores para as caixas A e B são como se segue: Uma caixa para a frente: 5'-T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG e reverso: 5'-CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; Caixa de B Forward: 5'-G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA e Reverse: 5'-T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. Os locais das enzimas de restrição (Asc I e Pac I) estão sublinhados. - Ligadura 500 ng de Asc I-digerido A e 500 ng de Fragm B Pac I-digeridoentos em 50 ng de PLD53SC-ATB (tdTomato) vector a 16 ° C durante 1 h.
- Transformar o vector PLD53SC-ATB purificada em células competentes BAC-11 e cultura deles em meio Luria-Bertani (LB) placas de agar com cloranfenicol (20? G / ml) e ampicilina (30 ug / ml) a 37 ° C. Escolha dois a três colónias de co-integrar a partir das placas principais CH / Amp.
- Inocular cada colónia em 1 ml de LB suplementado com 20 ug / ml de cloranfenicol e incubar durante 1 hora a 37 ° C e 225 rpm. Espalhe 100 ul de cada mistura sobre uma placa de LB-agar (10 g de peptona 140, 5 g de extracto de levedura, 12 g de ágar e 1 L de água; pH 7,5) suplementado com cloranfenicol e 4-4,5% de sacarose. Incubar a cultura durante a noite a 37 ° C.
- Escolha ambas as colônias grandes e pequenos e replate-los em duas placas LB-ágar com cloranfenicol. Em seguida, expor as placas com ou sem luz UV durante 30 segundos e escolher as colónias sensíveis aos raios UV para uma análise mais aprofundada.
- Identificar o DNA BAC modificado por PCR usando tdTomato / IL-22 iniciador heterozigotos (Forward: 5 'ACT TGT GCG ATC TCT GAT GGT; Reverso: 5' TGT AAT CGG ggA TGT CGG C). As condições de ciclos térmicos são as seguintes: 95 ° C durante 2 min; 30 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 56 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 30 seg; e uma extensão final a 72 ° C durante 10 min.
- Confirmar a sequência da área modificada do BAC por sequenciação BAC direta da grande-prep BAC DNA 12.
- Anestesiar um rato receptor com uma dose de 0,25% tribromoetanol para dentro da cavidade peritoneal, quando da instalação do micro-injectadas em ratinhos zigotos / 6c C57BL pseudo-grávida.
- Linearizar a IL-22-tdTomato BAC construção (10 ug) por digestão com 5 ul de restrição endonucleasePi-Scel em 100 ul do sistema de reacção e microinject o DNA de BAC linearizado em ovos fertilizados de ratinhos C57BL / 6 fêmeas na fase pronuclear 13. screen ratinhos transgénicos por análise de mancha de Southern de DNA isolado a partir de biópsias da cauda usando os procedimentos padrão.
Preparação 2. uma única célula de baços, timo, linfonodos e placas de Peyer
NOTA: ratinhos repórter de IL-22-tdTomato foram mantidas no National Cancer Institute (NCI, Frederick, MD). O método de eutanásia está em conformidade com as orientações AVMA mais recentes sobre a eutanásia. Todos os ratinhos foram sacrificados usando inalação de CO 2 14.
- Euthanize um IL-22-tdTomato do mouse em uma câmara de CO 2 e colocá-lo em uma almofada limpo. Esterilizar a pele do abdômen por pulverização álcool 70% e cortá-la aberta. Remover o baço no flanco esquerdo e o timo por trás do esterno.
- Para colher os nós mesentericlymph (localizada no tecido mesentérica) e placas de Peyer (pequenos lymphoidnodules toda a região do íleo do intestino delgado), pegue a mesentérica branco perolado nodos perto de tele parede do intestino delgado dissecar usando fórceps com pontas finas-ponto serrilhadas primeiro e, em seguida, remover todo o intestino delgado e cólon para fora do corpo. Encontrar as manchas ovais estendidas (placas de Peyer) ao longo do intestino e cortá-los com tesoura. Moer estes tecidos linfóides (gânglios linfáticos e placas de Peyer) individualmente entre duas lâminas foscas em uma suspensão de uma única célula em soro fetal de bovino / 1% de PBS (FBS) a tampão em gelo.
- Picar o baço ou tecidos do timo utilizando o mesmo método que no passo 2.2. Centrifugar a suspensão do baço durante 8 min a 500 xg e 4 ° C. Adicionar 1 ml de tampão de lise ACK por baço para os sedimentos celulares.
- Misture bem e deixe-os repousar durante 1 min. Adicionar 9 ml de tampão de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) a cada amostra. Girar para baixo por centrifugação durante 8 min a 500 xg e 4 ° C para remover os glóbulos vermelhos.
NOTA: Não adicionar tampão de lise ACK para as células do timo. - Ressuspender os leucócitos, resultando em 5 ml de PBS e Pass as células através de um coador de células de 100 um. Recolher os sedimentos celulares por centrifugação a 500 xg durante 8 minutos.
- Ressuspender as células em 5 ml de meio RPMI ou em tampão FACS e contar as células viáveis, utilizando 0,4% de corante azul de tripano solução / PBS.
3. Isolamento de Intraepithelial linfócitos e lâmina própria células dos intestinos
- Abra a pele abdominal como no passo 2.1 cortar o intestino delgado, do duodeno (ao lado do estômago) para íleo (junto ao apêndice), e todo o cólon, bem acima do ânus. Remover o tecido adiposo extra e utilizando fórceps mesentéricos. Colocar os intestinos imediatamente em PBS arrefecido em gelo.
- Procure placas de Peyer (pequenos nódulos ásperas) ao longo da região distal do intestino delgado. Retire as massas usando uma pinça andopen intestino longitudinalmente com uma tesoura. Lave bem o intestino com 10 ml de PBS gelado.
- Incubar os tecidos em 20 ml de tampão de pré-digestão (5 mM de EDTAe ditiotreitol 1 mM em solução salina equilibrada de Hank (HBSS)) durante 30 min a 37 ° C com rotação lenta (50 rpm) num agitador. Depois de cada uma das incubações 2, remover a camada de células epiteliais, contendo os linfócitos intraepiteliais (IELS), por agitação em vórtice intensa (30 segundos a 12000 rpm) e transmitir todos os tecidos através de um filtro de células de 100 um.
- Adicionar 20 ml de solução de EDTA novo para o tecido para segunda incubação durante 30 min a 37 ° C. Passar as fracções IEL através de um filtro de células de 100 um e reuni-los com as fracções anteriores. Manter os fragmentos restantes do intestino em gelo a ser tratada no passo 3.9.
- Centrifugar as fracções IEL reunidas a 800 xg durante 5 min a 4 ° C. Lavam-se as fracções reunidas IEL com 10 ml de HBSS / 5% de FBS e colocá-los para baixo durante 5 min a 800 xg e 4 ° C.
- Ressuspender as células em 8 ml de meio de 44% de sílica coloidal 15, cobrindo-as de forma sílica coloidal 5 ml de 67%. Centrifugar a 44% / 67gradiente de mistura de células 0,5% durante 20 min à temperatura ambiente e 1500 x g.
- Recolher as células IEL da banda na interface. Em primeiro lugar, remover a camada superior do sobrenadante (cerca de 5 ml) com 1 ml da pipeta. Em seguida, IELs colheita na interfase do gradiente médio de sílica coloidal.
- Lavar as IELs por adição de 10 ml de meio RPMI. Rodar as células para baixo durante 5 min a 800 xg e 4 ° C. Ressuspender as IELs em 5 ml de meio RPMI para o passo 3.15.
- Para o isolamento dos linfócitos da lâmina própria (LPLs), mediu os fragmentos de tecido do intestino a partir do passo 3.4 em pequenos pedaços com uma tesoura (1 mm) e digerir os pedaços com 10 ml de tampão de digestão (0,05 g de colagenase, 0,05 g de ADNasel, e 0,3 g de dispase II em RPMI / FBS a 5%) durante 15-20 min a 37 ° C.
- Filtrar a mistura através de um filtro celular de 70 uM. O sobrenadante de escoamento contém o LPL libertado.
- Totalmente digerir os fragmentos do intestino, repetindo os passos 3,9-3,10 (normalmente, eles devem serrepetido 3 vezes). Cada vez, reunir os sobrenadantes contendo o LPLs.
- Recolher as células por centrifugação durante 5 min a 1500 xg e a temperatura ambiente e ressuspender as pastilhas em RPMI / FBS a 5%. Passá-las através de um filtro de células 40 ^ m.
- Ressuspender as células em peletes de 10 ml da fracção de 40% de um gradiente de meio de 40:80 de sílica coloidal e sobrepô-las em 5 ml da fracção de 80% em um tubo de 15 ml.
- Realizar a separação por gradiente de densidade por centrifugação durante 20 min a 1500 xg e 15 temperatura ambiente.
- Recolhe-se o LPLs, tal como descrito na etapa 3.7. Lavá-los uma vez com 10 ml de PBS e ressuspender as pastilhas em 1 ml de / 1% de FBS meio RPMI tampão ou PBS.
- Contar as células viáveis (tanto IELS e LPLs) usando de 0,4% trypan solução corante azul / PBS.
4. Expressão de IL-22-tdTomato na colite
- Preparar suspensões de células de baço de ratinhos individuais de IL-22-TdTomato a uma concentração de 1 x 10 <sup> 7 células / ml em PBS estéril, como descrito nos passos 2,1-2,4.
- Purificar as células T CD4 + usando o mouse CD4 celular método de isolamento de 10 Negativos. Classificá-los com anti-CD4-APC (clone RM4-5, 0,5 ul / 1 x 10 6 células em PBS / 1% de tampão FBS) e anti-CD45RB com FITC (clone 16A, 0,5 mL / 1 x 10 6 células em PBS / 1% de tampão FBS) por incubação a 4 ° C durante 30 min.
- Rodar as células para baixo durante 5 min a 500 xg e 4 ° C. Lavam-se as células com 2 ml de tampão de PBS / 1% de FBS e ressuspender-los em 1 ml de tampão de coloração de FBS / PBS a 1%.
- Executar as células T marcados numa máquina de citometria de fluxo 16. Portão as células em uma população de células T e classificar células duplamente positiva altas CD4 + CD45RB (o comprimento de onda detectado a 488 nm e 633 nm) lasers.
- Colher as células separadas por centrifugação durante 5 minutos a 500 xg e 4 ° C. Ressuspender os sedimentos celulares em tampão PBS estéril a 1 x 10 6 6) para o peritônio ofeach RAG1 - rato destinatário - /.
- Sacrifício dos ratinhos receptores sob CO 2 em vários pontos de tempo. Colher os nódulos linfáticos mesentéricos e os intestinos grosso e delgado, conforme descrito nas etapas 2.1 e 2.2. Coloque cada nó de linfa mesentérica e corte-aberto intestino (papel / intestino / papel sanduíche) em paraformaldeído a 4% (PFA; lidar com sob um exaustor) durante a noite para reparar os tecidos. Substitua o PFA com 18% de sacarose durante 16-24 horas e depois congelar os tecidos para seccionamento.
- Usar a máquina de criostato para cortar o tecido 17, 18, 19. Aquecer as secções de tecido para a temperatura ambiente durante cerca de 60 min e colocá-los em acetona durante 10 min à temperatura ambiente. Seca-se-lhes à temperatura ambiente durante aproximadamente 5 min.
- Adicionar FBS em excesso, removê-lo com uma pipeta e adicionar anti-RFP na proporção de 1: BSA 200 de diluição em 0,1% / 1x PBS. Incubar o anticorpo a 37 ° C durante 60 min.
- Lavar as secções em PBS 1x durante 10 min e aplicar o anticorpo secundário correspondente (de cabra anti-coelho 568) para o tecido, diluído 1: 300 em 1% BSA / PBS 1x, durante 30 min à temperatura ambiente.
- Lavar as lâminas em 1x PBS por 10 min, limpe-os secar e adicione lamelas.
- Visualize todas as amostras com um microscópio fluorescente sob iluminação consistente (RFP: filtro de excitação 540-580 nm) usando a objetiva de 40X.
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Representative Results
Um murino IL-22 do transgene repórter foi criada usando recombineering para modificar um cromossoma artificial bacteriano transportando o locus de IL-22. A Figura 1 mostra um diagrama de vector contendo o gene de pBACe3.6 sacBII, um marcador de selecção positiva, e o gene de resistência ao cloranf enicol antibiótico 11. Após a introdução tdTomato ao exão 1, a sequência do péptido de sinal foi interrompido, tal como mostrado na Figura 2. Assim, o repórter tdTomato foi aprisionado no interior das células de IL-22 que expressam, permitindo a sua detecção e o isolamento por citometria de fluxo. Os murganhos homozigóticos foram criados a partir de linhas fundadoras e rastreados por PCR, e que não necessitam de retrocruzamento, a fim de alcançar a prole com uma identidade genética, como é necessário na estratégia usual de knock-in. Para testar a fidelidade das IL-22 repórteres, os esplenócitos in vitro -generated foram cultivadas sob condições neutras ou Th22.
Figura 1: Mapa do site do vetor pBACe3.6. pBACe3.6 é caracterizado por conter a resistência aos antibióticos cloranfenicol e um gene sacBII como um marcador de selecção positiva. Durante a recombinação, os clones desejados são a sacarose-resistente através da sua que expressa o gene sacBII e são deixadas a crescer em meios contendo sacarose, enquanto as colónias BAC negativos são sensíveis sacarose-.
Figura 2: Representação esquemática do clone RP23-401E11 BAC modificado. Um gene repórter tdTomato foi introduzido dentro do locus de IL-22, que inclui IL-22 e elementos de regulação em um cromossoma bacteriano artificial (BAC RP23-401E11) de murino, utilizando a tecnologia recombineering. Através de recombinação homóloga, a sequência do péptido de sinal da IL-22 no BAC foi interrompido e o exão 1 de IL-22 foi substituído pelo gene repórter tdTomato. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Identificação de IL-22 repórteres em esplenócitos cultivados in vitro. As células T CD4 + foram purificadas a partir de baço e depois estimuladas com anti-CD28; anti-CD3 (condição neutra); ou anti-CD3, anti-CD28, anti-IFNƳ, anti-IL4, IL-6, TGF-β, e 6-Formylindolo (3,2-b) carbazol (FICZ) durante 5 dias. IL-22-tdTomato foi analisada por citometria de fluxo (top dois) e microscopia fluorescente (dois inferiores, barra de escala: 100 mm). Os números nos quadrantes indicam a percentagem de células CD45 +.target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: visualização de células em diferentes tecidos de ratinho IL-22 produtoras. Suspensões de uma única célula foram preparados a partir do baço, timo, nódulos linfáticos, intestinos (IEL e LP), e placas de Peyer. Eles foram, em seguida, a superfície-coradas com FITC-anti-CD3 e analisados para a expressão tdTomato. MLN: nódulo linfático mesentérico, ALN: nódulo linfático axilar, PP: placas de Peyer, IEL: células intraepiteliais isolados a partir do intestino delgado, LP: células da lâmina própria purificado a partir do intestino delgado. Os números nos quadrantes indicam a percentagem de células CD45 +. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Localização da IL-22 repórteres durante o desenvolvimento de colite transferência de células T. CD4CD45RBHigh células T a partir de ratinhos IL-22 foram transferidos para repórter RAG1 - / - ratos, e os sinais tdTomato foram avaliados por imuno-histoquímica em diferentes tecidos, em diferentes pontos de tempo durante o desenvolvimento da colite. As setas apontam para os sinais de IL-22-tdTomato. Barras de escala = 25 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
IL-22 desempenha um papel essencial na inata defesa e tecido hospedeiro remodelação. IL-22 produtoras de células foram identificados ex vivo por coloração intracelular. No entanto, continua a ser difícil de controlar a expressão de IL-22 in situ, quer no seu estado normal ou em condições inflamatórias. Este protocolo descreve um novo método para desenvolver um modelo de ratinho repórter de IL-22, o que nos permite localizar as células que expressam o repórter in vivo. A codificação TdTomato gene repórter foi inserido dentro do locus de IL-22 num local que interrompe a sequência de sinal. Esta estratégia resulta na repórter ser preso na célula produzindo, ao contrário de IL-22, que é rapidamente segregada, permitindo a visualização da célula produtora. A IL-22-repórter engenharia estava contido dentro de um grande BAC, com o objectivo de preservar os elementos reguladores, assim conferindo fidelidade de expressão do repórter correspondente ao da IL-22. Os tecidos intestinais de m transgénicogelo exibido expressão repórter homeostático em células T CD4 e linfócitos inatas na lâmina própria do intestino delgado. Na colite induzida, as células T CD4 expressa o repórter no cólon.
O papel da IL-22 na doença inflamatória do intestino, tem sido pouco clara. Ao participar na defesa da mucosa intestinal e regeneração de tecidos, a IL-22 é capaz de desencadear a produção de ambos protectora 20, 21, 22 e mediadores pró-inflamatórios (por exemplo, IL-8) 23, 24. Dois modelos de colite conduzido de células T mostraram aumentos nos níveis de IL-22 no cólon, incluindo TCR α - / - ratos 25, 26 e o modelo de transferência CD45RB oi 27. Comparando-se modelos de doença inflamatória do intestino, expressão de IL-22 no intestino foi maior em Crmodelthan doença de ohn num modelo de colite ulcerativa 21, 24 .Aqui, transferimos CD4CD45RBhi células T dos ratinhos repórter em RAG1 - / - e receptores imitar o processo patogénica da doença de Crohn. Descobrimos que, precedendo colite, IL-22 repórteres foram visualizados em nódulos linfáticos de drenagem intestinal (MLN). Os sinais de seguida diminuída no MLN e mudou-se para os intestinos, especialmente o intestino delgado distal e dois pontos, com o desenvolvimento de colite. A maioria dos repórteres tdTomato foram localizados no interior da mucosa da lâmina própria do intestino.
Um tipo diferente de repórter para a IL-22 foi previamente descrito, em que as células são marcadas de forma permanente de modo que eles e suas filhas continuam a expressar o repórter, se a transcrição de IL-22, ou não tem continuado 28. Como em nosso estudo, intestino linfócitos inatas foram marcados em condições homeostáticas e na colite, tele repórter foi localizada em células T dos nódulos linfáticos mesentéricos para o tecido intestinal.
Os procedimentos descritos neste protocolo seria aplicável no estabelecimento de outros ratinhos repórter transgene, tais como IL-17, IL-25, e assim por diante. No entanto, é crucial para escolher clones BAC adequados que transportam elementos reguladores distais para assegurar a fidelidade da expressão do gene repórter, desde que os transgenes são integrado aleatoriamente no genoma do rato. O rato repórter permite a identificação de células que expressam in vivo, bem como para a purificação e caracterização de células vivas. Usamos tdTomato, uma proteína fluorescente vermelha excepcionalmente brilhante, como um gene repórter fluorescente para fazer o repórter adequado para estudos de imagem de animais vivos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
References
- Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
- Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
- Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
- Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
- Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
- Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
- Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
- Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
- Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
- Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
- Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
- Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B.
- Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
- Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
- Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R.
- Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
- Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
- Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
- Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, de, R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
- Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
- Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).
