Summary
A continuación, se presenta un protocolo para cuantificar partículas de alérgenos cargadas por citometría de flujo. partículas ambiente partículas pueden actuar como portadores de alérgenos adsorbidos. Mostramos aquí que la citometría de flujo, un método ampliamente utilizado para caracterizar sólidos suspendidos> 0,5 m de diámetro, se puede utilizar para medir estas partículas de alérgenos-cargado.
Abstract
La citometría de flujo es un método ampliamente utilizado para cuantificar los sólidos en suspensión, tales como células o bacterias en un intervalo de tamaño de 0,5 a varias decenas de micrómetros de diámetro. Además de una caracterización de las propiedades de dispersión frontal y sideward, permite el uso de marcadores fluorescentes etiquetados como anticuerpos para detectar las estructuras respectivas. El uso de la tinción de anticuerpos indirecto, citometría de flujo se emplea aquí para cuantificar alergeno de polen de abedul (Bet v 1, precisamente) RESORTE partículas de 0,5 a 10 micras de diámetro en la materia particulada inhalable (PM10, tamaño de partícula ≤10 m de diámetro). partículas PM10 pueden actuar como portadores de alérgenos adsorbidos posiblemente ellos el transporte de las vías respiratorias inferiores, donde podrían desencadenar reacciones alérgicas.
Hasta ahora, el contenido de alérgenos de PM10 ha sido estudiado por medio de la enzima ligada ensayos de inmunoabsorción (ELISA) y microscopía electrónica de barrido. ELISA mide el disuelta y no la partículaalérgeno -bound. En comparación con microscopía electrónica de barrido, que se puede visualizar partículas de alérgenos-cargado, citometría de flujo, además, pueden cuantificarlas. A medida que el contenido de alérgenos del aire ambiente puede desviarse de concentración de polen de abedul, los síntomas alérgicos podrían tal vez una mejor correlación con la exposición a alérgenos que con la cantidad de polen. En conjunción con los datos clínicos, el método presentado ofrece la oportunidad de probar en futuros experimentos si las reacciones alérgicas al polen abedul antígenos están asociados con el contenido de alérgeno Bet v 1 de partículas PM10> 0,5 micras.
Introduction
La contaminación del aire está siendo considerada como una importante causa ambiental del aumento de la incidencia y la gravedad de las alergias respiratorias observadas en las últimas décadas 1-3. Por otra parte, hay un interés creciente en la distribución de los alérgenos comunes en 4,5 polvo.
Polen de abedul pueden provocar fiebre del heno, pero también puede ser un disparador importante del asma alérgica 6-8. polen de abedul conjunto no es probable que entrar en el tracto respiratorio inferior o que se encuentran en PM10 como resultado de su tamaño (22 m de diámetro). Sin embargo, los alergenos del polen de abedul Bet v 1 como el componente principal alérgeno del polen de abedul, pueden ser puestos en libertad después de la rotura de polen 9 y pueden unirse a partículas en el aire ambiente 10, por lo tanto, posiblemente, entrar en las vías respiratorias inferiores. De hecho, se ha demostrado que PM10 puede contener alérgenos biológicamente activos como se demuestra por la activación in vitro de basófilos de un individuo afectado alérgica polen 11
Bet v 1 contenido de alérgenos en muestras de PM10 se ha estudiado mediante la extracción del alérgeno respectivo y posterior cuantificación con ELISA 12-14. Con la técnica de ELISA, se midió el alergeno disuelto, pero la cantidad de partículas de alérgenos cargado todavía sigue siendo desconocido. Microscopía electrónica de barrido reveló partículas de alérgenos-cargado pero no permitió la cuantificación 10,15.
En este estudio se emplea la citometría de flujo para cuantificar la proporción de partículas PM10 Bet v 1-cargados en muestras de aire ambiental. Debido al límite de detección del citómetro de flujo solamente partículas mayores de 0,5 micras puede ser examinado. El> 0,5 micras fracción de PM10 se denominará en adelante como PM10> 0,5.
Protocol
NOTA: Este protocolo describe la tinción indirecta de partículas PM10 con un anticuerpo monoclonal (anticuerpo IgG1 monoclonal de ratón, clon MA-3B4) contra Bet v 1, el componente antígeno principal del polen de abedul, además de una aloficocianina (APC) marcada con anticuerpo secundario (anti anticuerpo -Ratón IgG1, clon A85-1) y la posterior análisis en un citómetro de flujo. Con otros anticuerpos adecuados disponibles, este método podría extenderse a la detección de otros antígenos unidos a las partículas en el aire ambiente.
1. El muestreo de PM10
- Recoger PM10 del aire ambiente en politetrafluoroetileno (PTFE) filtros usando un muestreador de bajo volumen con un caudal de 2,3 m3 / h (Figura 1). Una caracterización del sistema de muestreo utilizado para los experimentos descritos aquí se encuentra en el 16. Tiempo de funcionamiento depende de la cantidad de PM10 necesario (por lo general entre 1 y 10 días).
- Al final del tiempo de incubación, retirar el filtro de la toma de muestras y congelarlo en-20 ° C hasta su uso.
Figura 1. Bajo muestras de volumen de PM10. Ejemplo de un muestreador de bajo volumen de PM10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La eliminación 2. PM10 y recuento de partículas
- Deje que el deshielo del filtro de PTFE durante unos 5 minutos. Luego, se coloca el filtro en una placa de Petri de poliestireno limpia (Figura 2A). Tome una nueva placa de Petri para cada filtro, si se procesa más de un filtro.
- Posteriormente, superponer el filtro de PTFE con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se establece este protocolo para una concentración de PM10 final del 8x10 6 partículas por ml (véase el paso 3.3). Para obtener al menos esa concentración, utilice el siguiente volumen empírica de PBS para superponer el filtro con: Si el tiempo de recogida de PM10 fue < 2 días, utilizan 2 ml. Para los tiempos de incubación ≥ 2 días, use 4 ml.
NOTA: Con el fin de aumentar la concentración de partículas de la suspensión PM10, suspensiones de diferentes filtros pueden ser agrupados, si es apropiado. - Mantenga el filtro de PTFE con pinzas y cepillo con un cepillo de dientes eléctrico con una sensible cabeza del cepillo durante 1 minuto (Figuras 2B, 2C). Transferir la partícula-PBS-suspensión, suspensión PM10 en adelante denominado, a un tubo de reacción de limpieza.
Figura 2. eliminación PM10 con un cepillo de dientes eléctrico. Un filtro de politetrafluoroetileno con PM10 muestreada se coloca en un plato Petri de poliestireno (A) y se superpone con 4 ml de PBS. Entonces, PM10 se quita con un cepillo de dientes eléctrico (B: antes de cepillar y C: después del cepillado durante 1 min).= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Medir la concentración de partículas PM10, por ejemplo, mediante el uso de un contador de partículas. Diluir un volumen adecuado de PM10 suspensión tales como 50 l en 10 ml de tampón de medición isotónica, medir tres veces y calcular el número total medio de partículas por ml. Asegúrese de utilizar un contador de partículas que puede detectar partículas del tamaño correspondiente.
3. Bet v 1 tinción
- Calcular el número de tubos de reacción requeridos para el análisis de la muestra: Al menos tres son necesarios tubos de reacción: (i) un tubo con única muestra (control nativo) (ii) un tubo con la muestra más el anticuerpo secundario (control negativo), y ( iii) un tubo con la muestra más el anticuerpo primario y secundario (muestra específica). Si se mide por primera vez, preparar al menos dos tubos de reacción de (i) (ii),y (iii) que tiene material suficiente para ajustar adecuadamente citómetro de configuración (véase el paso 4.1).
- Calcular la cantidad de suspensión PM10 necesario para el número de tubos de reacción. Cada tubo de reacción requiere 50 l de suspensión.
- Ajustar la concentración de partícula medido en el paso 2.4 para el volumen de suspensión calculado en la etapa 3.2 a una concentración final de 8x10 6 partículas por ml mediante la adición de una cantidad apropiada de PBS.
NOTA: La suspensión PM10 restante puede congelarse a -20 ° C para futuros experimentos, aunque para este protocolo recién se recomienda suspensión PM10 preparado. - Bloquear la unión inespecífica por que complementa la suspensión PM10 con albúmina de suero bovino (BSA) a una concentración final de 0,02%, utilizando una solución madre tal como 1% de BSA preparado con PBS. Vortex brevemente e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
- Para cada muestra a analizar por citometría de flujo, la transferencia de 50 l de la suspensión de la etapa 3.4 para actubo de reacción magra. Añadir un anticuerpo de ratón monoclonal contra Bet v 1 a una concentración final de 0,02 mg / l a los tubos de reacción designadas para la tinción específica, vórtice brevemente y se incuba durante 60 min a temperatura ambiente.
- Dejar que los tubos de reacción, la suspensión PM10-BSA designado para el control natal y el control negativo también se mantienen durante 60 minutos a temperatura ambiente.
- Lavar todas las muestras mediante la adición de 500 l de PBS suplementado con 0,02% de BSA a cada tubo de reacción, brevemente vortex y centrifugar las muestras a continuación a 4700 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Descartar el sobrenadante con cuidado utilizando una bomba de vacío.
- Repita el paso 3.6.
- Determine la cantidad total de anticuerpo anti-IgG1 de ratón secundario marcado con APC necesario: 1 mg de anticuerpo disuelto en 50 l de PBS suplementado con 0,02% de BSA por tubo de reacción. Diluir la cantidad apropiada de anticuerpo con el volumen respectivo de PBS suplementado con 0,02% de BSA.
- Añadir 50 l de anticuerpo secundario diluido a todos los tubos de reacción, excepto para el tubo de reacción designado para el control natal. Suplemento este último con 50 l de PBS suplementado con 0,02% de BSA. Vortex todas las muestras durante unos segundos.
- Incubar todas las muestras durante 30 min en la oscuridad.
- Repita el paso 3.6 en dos ocasiones.
- Añadir 50 l de PBS a cada reacción tubo, vórtice y analizar las muestras en un citómetro de flujo.
4. Análisis de citometría de flujo
- Uso del control natal, ajuste los siguientes parámetros para optimizar el citómetro de análisis de datos.
- Al utilizar el controlador de umbral de dispersión frontal (FSC) que aparece en el tablero de control del dispositivo, establecer el umbral de FSC en el valor más bajo (200) e iniciar el análisis.
- Al utilizar el controlador de voltaje de dispersión, ajustar el FSC y la dispersión lateral (SSC) de esa manera que todas las partículas PM10 pueden ser detectados y que la población de partículas se encuentra aproximadamente en THe mitad del eje del FSC y en la mitad inferior del eje SSC.
- Al utilizar el controlador de tensión de fluorescencia, ajustar el voltaje de APC y otra tensión de fluorescencia como isotiocianato de fluoresceína (FITC), que no emite en la misma longitud de onda como APC, si es necesario. Asegúrese de que todas las partículas son visibles en la mitad inferior de los dos ejes de fluorescencia.
- Consecutivamente, examinar cada muestra, incluyendo el control natal y almacenar los datos de FSC, SSC, APC, y FITC de al menos 10.000 partículas por muestra.
- Evaluar los datos con el software correspondiente. el contenido de alérgenos adsorbidos en la muestra específica se puede cuantificar de dos maneras:
- Analizar la intensidad de fluorescencia de APC de todas las partículas (valor medio) como una medida de Bet v 1 carga sobre todas las partículas PM10.
NOTA: Si la muestra específica contenida alergeno, la intensidad de fluorescencia de APC debe aumentar en la muestra específica en comparación con el control negativo. En contraste, otros fluorintensidades Escence (por ejemplo., FITC intensidad de fluorescencia) no deben cambiar de manera significativa. - Calcular el porcentaje de partículas PM10 con cota anti-Bet v 1 anticuerpo. De este modo, en el control negativo, establecer una puerta alrededor de las partículas consideradas APC positivo, copiar y pegar esta puerta en la muestra específica y restar el porcentaje de partículas de APC positivos en el control negativo a partir del porcentaje de partículas de APC positivos en la muestra específica.
- Analizar la intensidad de fluorescencia de APC de todas las partículas (valor medio) como una medida de Bet v 1 carga sobre todas las partículas PM10.
Representative Results
Bet v 1 de adsorción alérgeno al PM10> 0,5 partículas se cuantificó por tinción indirecta del anticuerpo y el posterior análisis en un citómetro de flujo. Una muestra de PM10 de alta temporada de polen sirvió como molde. Como se ha indicado en el paso 3.1, el control negativo consistía en partículas PM10 incubadas con APC anticuerpo secundario marcado solamente (Figura 3A). Partículas PM10 teñidas con anti-Bet v 1 anticuerpos más anticuerpo secundario muestran las partículas de alérgenos cargado (Figura 3B). Como se ha descrito en el paso 4.3, se utilizaron dos formas de cuantificar la carga de alérgenos: Por una parte, se analizó el valor de la mediana de la intensidad de fluorescencia de APC de todas las partículas de ser 137 para el control negativo y 904 para la muestra específica. Por otra parte, se determinó el porcentaje de partículas con límite anti-Bet v 1 anticuerpo: Una puerta se fijó alrededor de las partículas de APC positivos en el control negativo y posteriormente covarios colores y pegado en la muestra específica. En el control negativo, 3% de las partículas PM10> 0,5 se consideraron APC positivo. Este porcentaje de partículas positivas falsas se restó del porcentaje de partículas positivas en la muestra específica que resulta en 77.5% PM10 positivo APC> 0.5 partículas en la muestra específica. Para demostrar que la unión del anti-Bet v 1 de anticuerpos observada era específica, capacidad de unión se bloqueó con el antígeno correspondiente antes de la tinción. Esto disminuyó la unión del anticuerpo anti-Bet v 1 en un 69%, si se cuantifica por la intensidad de fluorescencia de APC, y en un 84%, si se cuantifica en función del porcentaje de Bet v 1 PM10 positivo> 0,5 partículas (Figura 3C).
Figura 3. ligados a las partículas Bet v 1 alérgeno puede ser visualizado por citometría de flujo. Intensidad de la fluorescencia de APC de una muestra de PM10 de alta potemporada llen manchado sólo con el APC anticuerpo secundario marcado con (A), teñidas con el anti-Bet v 1 anticuerpo primario y, posteriormente, con el APC anticuerpo secundario marcado (B), y después de bloquear el anticuerpo primario con antígeno de Bet v 1 recombinante (C ). La puerta P + APC se estableció alrededor de las partículas consideradas APC positivo (representada en rojo) y se da respectivos porcentajes. Esta cifra ha sido ligeramente modificado a partir de 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para probar si este método podría ser adoptada para revelar diferencias en la cantidad de adsorción de Bet v 1 contenido de PM10> 0.5 muestras de alta y de baja temporada de polen, se analizaron 13 muestras de PM10 de alto y 6 muestras de PM10 de baja temporada de polen. La figura 4representa diferencias significativas en la intensidad de fluorescencia de APC y en la proporción de Bet v 1 PM10 positivo> 0,5 partículas PM10 de muestras de polen de temporada alta en comparación con las muestras de PM10 de baja temporada de polen. Ambos métodos de cuantificación presente mostraron resultados similares.
Figura 4. Las muestras de PM10 de baja y alta temporada de polen tienen una cantidad diferente de adsorbida Bet v 1. Bajo PM10 estación del polen se tomaron muestras en otoño / invierno 2013 (n = 6), polen de alta temporada de PM10 en mayo de 2012 y 2013 (n = 13). (A) La intensidad de la fluorescencia de APC de PM10> 0,5 partículas de alta temporada de polen fue significativamente mayor que el de la temporada de polen baja (mediana / min / max alta temporada de polen: 796/313/1097; mediana min / max temporada de polen baja /: 197 / 85/277). (B) PM10 de alta temporada de polen contenía significativos llevadostly más Bet v 1-PM10 positivo> 0,5 partículas PM10 que a partir de la temporada de polen baja (mediana / min / max alta temporada de polen: 45,2 / 18,5 / 74,5; mediana / min / max temporada baja polen: 11,8 / 4,4 / 19,8). Los diagramas de caja muestran valores de la mediana (línea interna de la caja), 25. y 75. Los percentiles, respectivamente (bordes inferior y superior de la caja) y los valores mínimo y máximo (filamentos). *** P <0,001 frente baja temporada de polen, U de Mann Whitney. Esta cifra ha sido ligeramente modificado a partir de 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Un paso crítico del protocolo es el uso de un filtro apropiado para la recogida de partículas PM10 de aire ambiente (véase el paso 1.1). El filtro tiene que ser lo suficientemente fuerte como para soportar el cepillado con un cepillo de dientes eléctrico, y no todos los materiales de filtro cumplir este requisito. El protocolo de tinción se estableció con una concentración de partículas PM10 de 8x10 6 partículas por ml. Sin embargo, si el material es limitado y puesta en común de las muestras no es apropiada, el método será probablemente funciona tan bien, pero las concentraciones de anticuerpos (consulte los pasos 3.5 y 3.8) podrían tener que ser ajustada.
Bet v 1 tinción de partículas PM10 no dio lugar a distintas poblaciones de partículas teñidas positivamente y negativamente. Esto podría ser causado por las cantidades variables de Bet v 1 de alérgenos adsorbidos a cada una de las partículas que van desde muy poco hasta una cantidad elevada. Esto podría resultar en la expansión de la señal de APC cambiando así la población haciapositividad APC. Como es difícil separar el positivo de las partículas negativas, se utilizaron dos métodos de cuantificación para determinar las diferencias en el contenido de Bet v 1 de las PM10> 0,5 especímenes: (i) cuantificación relativa mediante la medición de la intensidad mediana de la fluorescencia de APC de todas las partículas y (ii) determinar el porcentaje de partículas de APC positivos. En cuanto a la carga de Bet v 1 de partículas de baja y alta temporada del polen PM10> 0,5, ambos métodos revelaron resultados similares. Sin embargo, se recomienda la cuantificación relativa de la intensidad de fluorescencia mediana de todas las partículas, ya que es independiente de la colocación de la puerta y por lo tanto, probablemente, menos propenso a errores.
Hasta la fecha muchos estudios examinan el contenido de alérgenos en el material particulado del aire ambiente mediante la extracción del alérgeno respectivo y posterior cuantificación por ELISA 5,12-14,17. Hay una diferencia fundamental entre el procedimiento descrito aquí y el quantification con ELISA: ELISA cuantifica el antígeno extraído y disuelto, mientras citometría de flujo analiza el antígeno unido a partículas. Por medio de ELISA el Bet v 1 de carga de las muestras de PM10 analizadas (n = 8) estaba por debajo del límite de detección de 1,2 ng / ml (datos no presentados). Del mismo modo, Buters y otros identificaron ningún Bet v 1 en el PM <2,5 micras fracción y sólo el 7% en el 10 micras> PM> 2,5 micras fracción, pero más del 93% en el PM> 10 micras fracción del aire ambiente 13. Los resultados contrastantes del ELISA, por un lado, y el análisis FACS, por otra parte, pueden ser causadas por diferencias en el método de detección en combinación con sensibilidad divergente. La investigación adicional, sin embargo es necesario para entender completamente esta diferencia.
Un método que permite visualizar unido a partículas de antígeno se microscopía electrónica de barrido 10,14. Por microscopía electrónica de barrido, Ormstad et al. Bet v 1 visualizado en la superficie de partículas en suspensión matepartículas de hollín r muestreados en la temporada alta de polen y en menor medida en las partículas de la muestra en la baja temporada de polen 15. Además, se encontró que los alérgenos de polen, látex y también ß-glucanos a ser adsorbido a partículas de combustión en el aire ambiente 10. Este método, sin embargo, no permite la cuantificación del alergeno aglomerados en partículas.
Mediante el uso de citometría de flujo, unido a partículas de Bet v 1 alérgeno se pudo cuantificar. Por lo tanto, la citometría de flujo puede ofrecer una nueva manera de caracterizar la 10-0,5 micras fracción biológica de PM10 como con otros anticuerpos adecuados en la mano, este método podría extenderse a la detección de otros antígenos en las partículas del aire ambiente, por ejemplo, moho, ácaros del polvo alergenos o LPS. A medida que las partículas PM10 adsorben no sólo material biológico, sino también productos químicos y metales con bastante facilidad, la unión no específica de los anticuerpos podrían, sin embargo, suponer un problema. Si un nuevo anticuerpo se pone a prueba, un paso crítico es demostrar específico del enlaceEn g. Esto se puede hacer mediante, por ejemplo, el bloqueo de la capacidad de unión del anticuerpo específica con el antígeno correspondiente antes de la tinción 11.
Como Bet v 1 contenido del aire ambiente puede diferir de concentración de polen de abedul 12,13,18, síntomas alérgicos podrían tal vez una mejor correlación con el nivel de alérgenos de polen de contar con 14,18. Por lo tanto, el método presentado en conjunción con los datos clínicos permite examinar en futuros experimentos si las reacciones alérgicas a Birch corresponden a la carga alérgeno Bet v 1 de PM10> 0,5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon filter | Pall Life Sciences, USA | R2PL047 | 47 mm, 1.0 µm |
| low volume sampler | Sven Leckel Ingenieur Büro GmbH, Germany | LVS3 | air flow of 2.3 m3/hr |
| Phosphate-buffered saline | Biochrom, Germany | L1825 | without Ca/Mg, low endotoxin |
| electrical toothbrush | Braun, Germany | Oral-B Vitality Sensitive | |
| Casy cell counter | Schärfe System GmbH, Germany | Model TTC | range of detectable particle size: 0.7 µm to 45 µm |
| FACSCanto II | Becton Dickinson, USA | 3-laser, 8-color (4-2-2) | |
| FACS Diva Software v6.1.3 | Becton Dickinson | ||
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | |
| monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1 | Indoor Biotechnologies, UK | MA-3B4 | clone MA-3B4 |
| APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody | Becton Dickinson | 560089 | clone A85-1 |
| SPSSTM software version 18 | PASW Statistics 18, Hongkong, China | ||
| Petri Dish | Gosselin, France | BP50-02 | D 55 mm, H 15 mm |
| FACS Tube | Becton Dickinson, USA | REF 352054 | 5 ml Polystyrene |
| CASYton | Roche Germany |
REF 05651808001 | |
| Matrix Blank Tubes | Thermo Scientific, USA | 4140 | 1.4 ml, PP |
| Centrifuge | Heraeus, Thermo Scientific | Megafuge 40R | |
| Vacuum Pump | INTEGRA Biosciences AG, Switzerland | Model 158 320 | Inetrgra Vacusafe |
| recombinant Bet v 1a antigen | Indoor Biotechnologies, UK | LTR-BV1A-1 | Concentration: 2.0 mg/ml |
References
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