Summary
고유 한 쥐의 간 문부 클램프 모델은 허혈 - 재관류 손상을 완화의 약물 분자의 영향을 연구하기 위해 개발되었다. 이 모델은 직접 간 전송을 허용, 포털 정맥의 지점을 통해 허혈성 간 세그먼트 포털 공급의 직접 삽관이 포함되어 있습니다.
Abstract
유입 폐색, 간 이식 주요 간 수술, 따뜻한 국소 빈혈의 기간 및 허혈 / 재관류 (I / R) 무수히 많은 부정적인 결과와 부상으로 이어지는 재관류의 기간을 필요로한다. 간 이식 향하는 한계 기관의 잠재적 인 I / R 손상은 감소 장기 가동률에 차 현재 기증자 부족에 기여한다. 중요한 필요가 이식에서 이식 기능에 미치는 영향을 중재하기 위해 간 I / R 부상을 탐험하기 위해 존재한다. 쥐의 간 문부 클램프 모델 간 I / R 손상에 다른 분자의 영향을 조사하기 위해 사용된다. 모델에 따라, 이들 분자는 주변 장간막 정맥 내로 흡입, 경막 외 주입, 복강 내 주사, 정맥 내 투여 또는 주사하여 전달 하였다. 쥐의 간 문부 클램프 모델은 I / R 손상을 완화의 약물 분자의 영향을 연구에 사용하기 위해 개발되었다. describ쥐 간 문부 클램프 용 ED 모델 직접 분절 간 전송을 허용 간문맥의 곁가지를 통해 허혈성 간장 세그먼트 포털 공급 직접 캐 뉼러를 포함한다. 우리의 접근 방식은 연구 대상 물질이 주입되는 시간 동안 60 분 동안 왼쪽 측면과 중앙 로브에 허혈을 유도하는 것입니다. 이 경우, 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 - 페 길화는 (PEG-SOD), 자유 라디칼 스 캐빈 저는, 허혈성 세그먼트에 직접 주입된다. 실험이 시리즈는 PEG-SOD의 주입이 간 I / R 손상에 대한 보호는 것을 보여줍니다. 이 방법의 이점은 전신 부작용의 감소 및 분포의 용적 감소와 그에 허혈성 세그먼트로 분자의 직접적인 주입을 포함한다.
Introduction
유입 폐색, 간 이식 주요 간 수술, 따뜻한 국소 빈혈의 기간 및 허혈 / 재관류 (I / R) 부상 1에 이르는 재관류의 기간을 필요로한다. 간에서 I / R 손상의 결과는 광범위하게 1, 2, 3 설명하고있다. I의 결과는 / 문헌에 상세히 R 부상을 포함한다 : 반응성 산소 종의 생성을, 호중구 활성화, 쿠퍼 세포, 내피 세포, 수신자와 같은 수용체의 헴 옥 시게나 제 시스템의 활성화 및 활성화 포함한 염증성 캐스케이드의 개시 엔도 텔린과 산화 질소, 핵 인자 κB의 활성화 및 전 염증성 사이토 카인 및 부착 분자의 합성 1, 2, 3 사이의 불균형의 촉진. 이 염증성 이벤트 리터 수도세포 사멸, 괴사, 장기 기능 장애 및 궁극적으로 장기 부전 3 EAD.
나는 / 간 이식 향하는 기관의 R 손상은 초기 이식 손실로 이어질과 한계 장기 부상 3에 더 취약으로 현재 기증자 부족에 기여 할 수 있습니다. 2015 5에서 수행 된 미국 4에서 간 이식 대기 목록에 15,226 잠재적 인 수신자 만 5950 간 이식은 현재이 있습니다. 때문에 장기 가용성이 극단적 인 제한으로 연구 간 I / R 손상이 이식 기능과 기관의 활용을 최적화하기 위해 필요한 탐구.
간 I / R 부상을 연구하는 데 사용 동물 모델 쥐 문부 클램프 모델과 쥐의 간 이식 모델을 포함한다. 현재 사용중인 쥐 문부 클램프 다양한 모델이있다. 가장 일반적인 하나 인 문맥, 간동맥 및 담즙 뒤CT 왼쪽 측면 및 중간 엽이 미세 수술 클립 6, 7, 8, 9, 10, 11, 60 분의 재관류 30 다음 최소 6, 7, 10, 13, 14 및 60 동안 12를 이용하여 고정되어 공급 H 7, 9, 10, 13 (24), (14)가 허용된다. 래트 간 왼쪽 측면 및 중간 엽이 간 실질 (9)의 약 70 %를 포함한다. 허혈 양상을 연구하기위한 일부 프로토콜은 문부 혈관의 간헐적 인 클램핑을 포함또는 폐문 용기 (9), (13)를 클램핑에 의해 유도 된 허혈성 장기간에 뒷다리 종래. 문헌에 기술 된 몇 가지 수정이있다. 첫 번째는 좌측 측면 및 중간 엽 공급 문맥과 간동맥 클램프 있지만 담관 (15)를 제외한다. 제 2 변형은 종래 디비전 16, 17, 18, 19, 20 간문맥, 간동맥 및 담관 클램핑하여 총 간 허혈을 유도하는 것이다. 제 3 변형은 30~60 분 8 오른쪽 로브의 폐문 혈관 클램프를 포함한다. 추가의 변형, 21 간 13에 손상을 유도하기 위해 하나 개 뒷다리의 관다발 클램핑 포함 방법이도 1a-D에 도시되어있다.
쥐 간 문부 클램프 모델 간 I / R에 다른 분자 및 화합물의 효과를 연구하기 위해 사용되었다. 주연 장간막 정맥 (8)로 흡입 (11), 경막 외 주입 (12), 복강 내 주사 17, 18, 21, 22, 정맥 내 투여 10, 14, 15, 19, 23, 24 또는 주입을 사용하여 전달 된 이들 분자 모델에 사용 따라 .
이 보고서에 포함하여에 설명 된 쥐의 간 문부 클램프의 모델연구중인 약물 물질의 직접 분절 간 전송을 허용 문맥의 곁가지를 통해 허혈성 세그먼트 포털 공급 (도 2), 직접 삽관을 말이지. 우리의 방법은이 경우의 연구 대상 물질의 주입, 페 길화 슈퍼 옥사이드 디스 뮤타 아제, 자유 라디칼 스 캐빈 저 (25), 허혈성 세그먼트에 직접 주입하는 동안, 60 분 동안 왼쪽 측면 및 중간 엽에서 허혈을 유도하는 . 혈액 샘플은 허혈 유도 전에 및 120 분 후 재관류에서 촬영된다. 이 시점에서, 쥐가 희생되고 샘플은 왼쪽과 중간 엽에서 가져옵니다. 또한, 샘플은 내부 제어 역할을 오른쪽 로브에서 촬영된다.
이 방법에 많은 장점이 있습니다. 무엇보다도, 연구중인 약물 물질 직접 허혈성 부분에 주입 될 수있는 볼륨 OF 분포는 전신 순환에 주입 분배의 부피 또는 복강에 비해 상당히 낮다. 또한,이 방법은 감소, 전신 부작용의 가능성을 배제하지 않는다.
Protocol
모든 절차는 기관 동물 관리 및 동물 애호 실험실 동물의 관리 및 사용 (IACUC)의 국가 연구위원회 설명서의 지침에 따라 수행되었다 오하이오 주립 대학 IACUC위원회의 승인을 겪었다.
1. 초기 셋업
- 셋업 수술 현미경 및 운영 극장 (그림 3, 그림 4). 마취를 유지하고 생체 신호를 모니터링하는 등 모든 장비를 켭니다. 전기 수술 장치와 온난화 패드를 켭니다. 수술대 근처 주입 펌프를 배치합니다.
- 마취 주사기 흡입 (분자량 184.5)에 대해 액체 10 mL의 이소 플루 란을 작성하고, 마취 장치에 배치.
- 셋업 혈액 샘플이 처리 될 원심 근처 200 ㎖의 수술대에 가까운 액체 질소 용기 다른.
- 포스수술기구, 4-0 및 7-0 꼰 실크 봉합사 멸균 면봉, 4 × 4 부직포 스폰지, 5 ㎖ 주사기와 수술대 근처 27 게이지 인슐린 주사기 ition.
- 이소 플루 챔버를 준비 충분한 이소 플루 란 마취를 유도 전달 시스템에 주입되도록한다.
마취 2. 유도
- 다음과 같은 개인 보호 장비 (PPE)에 넣어 쥐를 취급하기 전에 : 수술 용 마스크, 수술 용 장갑, 일회용 가운.
- 쥐 무게와 무게를 기록한다.
참고 : 스프 라그 돌리 쥐가 사용되어야한다. - 마취 챔버에서 쥐를 놓고 이소 플루 란과 산소를 켭니다. 이소 플루 챔버를 사용하여 마취를 유도한다.
- 청소기 노출 (그림 5)를 허용하는 전기 머리 깎기를 사용하여 동물의 복부 머리를 클립.
- additio의 이소 플루 란 챔버에서 동물 다시 배치최종 일분. 마취의 깊이를 확인하기 위해 발가락 핀치를 수행합니다.
3. 지원 절차
- 동물의 코 콘에서 코와 온난화 패드에 구속 또는 테이프로 고정 된 사지를 가진 쥐를 놓습니다.
- 이상 250g 무게 % 동물 200 내지 250g 무게 4의 동물에 대해 3.6 %로 마취로 마취 전달 시스템 노우즈 콘 및 이소 플루 란 마취를 이용하여 계속. 발가락 핀치와 피부 핀치를 수행하여 마취의 깊이를 확인합니다.
- 예리한 가위 (도 6)를 사용하여 피부를 통해 칼 모양하는 치골에서 중심선 복부 절개를.
- 칼 모양의 방광이나 장 손상되지 않도록 복부 돌보는를 입력 치골에서 원격 교육 알바를 따라 복막에 절개를합니다. 간은 또한 전방으로 칼 모양의 과정 가까운 복막에 스틱으로 이전이 아칸소에서 복벽을 절개에 릴리스되도록개.
- 피부를 통해 가로 절개와 간 우엽의 열등한 국경의 수준에서 복막을 확인합니다.
- 이상 250g 무게 동물을위한 200 % 사이 250g 2 무게 동물 1.6 %로 마취를 줄이십시오.
- 곡선 모기 클램프를 사용하여 칼 모양 후퇴 프로세스.
- 중심선으로부터 멀리 떨어져 가능한 리브 당기는 찾는 리브 견인기 (도 7). 횡격막 낫 모양, 그리고 위의 인대를 잘라. 적신 멸균 면봉을 사용하여 간을 올립니다.
- 간이에 접근하기 위해 추가 인대 필요 잘라. 식염수에 적신 거즈 (그림 7)과 내장 회전을 수행합니다.
- 날카 롭거나 무딘 절개를 사용하여 포털 폐문 위에 놓여 느슨한 결합 조직을 제거합니다. 포털 정맥의 길이를 덮는 느슨한 결합 조직을 제거합니다.
- 느슨한 결합 t을 밀어 집게를 사용하여창을 왼쪽 포털 정맥, 동맥 및 담즙 덕트에 문제 후방 및 4-0 포츠 봉합을 배치하지만 (그림 8) 아래 식은 죽 먹기가 없습니다.
- 우측 신장의 약 수준으로 제공 포털 정맥에 후방 분기를 덮는 느슨한 결합 조직을 취소합니다. 이 정맥 삽관에 사용됩니다.
- 인슐린 주사기 (도 9)과 대정맥 (IVC)에서 혈액 0.5ml를 그리기. 12 분 동안 135 XG에 작은 바이알 원심 혈액 0.5 mL로 놓는다. 혈청을 그리는 시도합니다.
- 135 × g으로 3 분 - 뚜렷한 선 적혈구 혈청 사이 알 수없는 경우, 추가로 2 원심 분리하려고. 알라닌 - 아미노 전이 효소 (ALT)에 대한 유리 병에서 혈청과 장소를 그립니다. 스냅 액체 질소에 직접 배치하여이 표본을 동결.
- 정맥에 사용됩니다 7-0 봉합과 정맥에 가까운 장소의 두 조각을 잘라기. 내측까지 가능한이 혈관 주변의 제 7-0 루프를 놓는다. 이 루프를 묶은 곡선 모기 클램프 (도 10)를 사용하여 후퇴 사용. 포털 정맥과의 교차점 근처에 삽관에 사용되는 하나 개의 넥타이를 배치됩니다 정맥에 두 번째 7-0 루프를 놓고, 그러나 아래 식은 죽 먹기가 없습니다.
- 시약 3 ㎖와 함께 5 ㎖ 주사기와 주입 펌프를 준비한다. 프라임 튜브.
- 미세 수술 클램프를 사용하여 말초 포털 정맥을 클램프.
참고 : 정맥이 삽관을 위해 절개 할 때 출혈을 줄일 수 있습니다. - 7-0 체류 봉합 작은 미세 수술 가위를 사용하여 문맥과의 교점 사이의 정맥에 0.5 mm 구멍을 잘라. 왼쪽 포털 정맥 시스템 (그림 11, 그림 12) cannulate에 27-0 카테터를 사용합니다. 왼쪽 및 오른쪽 포털 정맥의 분기점을지나 카테터를 삽입합니다.
- infus에 의해 정맥의 위치를 확인생리 식염수 1 ㎖를 보내고 그리고 희게하는 간 왼쪽 측면 및 중간 엽위한 시계. 수동으로 카테터 오른쪽 포털 정맥의 이륙 과거는 아니지만 중간 엽를 공급 포털 정맥의 이륙을 넘어 확인합니다.
- 포츠 봉합 아래 식은 죽 먹기와 허혈 시간을 시작합니다. 정맥 주위에 7-0 봉합 제자리에 고정 및 말초 문맥에서 클램프를 제거 27-0 카테터를 조입니다.
- 주입 펌프를 사용하여 폴리에틸렌 글리콜 - 슈퍼 옥사이드 디스 뮤타 아제 (SOD-PEG, 0.00067 g / ㎖)의 투여를 시작한다. 허혈 시간의 시작에 가능한 한 가깝게 주입을 시작합니다.
4. 모니터링
- 주입에 걸쳐 동물의 생체 신호를 모니터링하기 위해 계속합니다. 0.9 % 생리 식염수 2 mL를 15 분에 걸쳐 0.9 % 생리 식염수에 용해 된 PEG-SOD 2 ㎖ (0.00067 g / ㎖)를 제공한다.
5. 재관류
- 한 시간의 I의 처음부터 통과 할 수 있도록 허용schemic 시간. 이 따뜻한 허혈 시간의 1 시간이다.
- 포츠 봉합사를 제거합니다. 27-0 카테터를 제거합니다. 정맥 주위에 7-0 봉합을 식은 죽 먹기. 시간을합니다. 이 재관류의 시간을 표시합니다.
6. 계속 샘플링
- 120 분 후 재관류에 IVC에서 혈액 0.5ml를 그리기. 적혈구 용혈 방지하기 위해 천천히 피를 그립니다. 천천히 유리 병에 피를 똑. 하대 정맥에서 출혈하는 것은 각각의 혈액 무승부 제어되어 있는지 확인합니다.
- 출혈이 계속되면 멸균 면봉이나 거즈에서 1cm 섹션 컷에 의해 작은 1cm로 부드러운 압력을 적용합니다.
- 12 분 동안 135 XG 원심 분리기. 135 × g으로 3 분 - 충분한 분리가 달성되지 않는 경우, 추가로 2 시도.
- ALT 뒷부분 처리 바이알에 혈청의 절반을 놓는다. 스냅 이러한 표본을 동결.
7. 안락사
- 쥐가 마취 여전히 동안 IVC와의 컷uperior 베나 카바 (SVC)과 혈액의 흐름, 호흡과 심장 박동을 중지 할 때까지 모니터링 할 수 있습니다.
- 다이어프램 절개 및 원형 조리개를 절개하여 복강에 남아 간 접속 부가 결합 조직을 절개하여 간단한 절제술을 수행한다. 복강으로부터 간을 제거한다.
- 간 우엽에서 간의 왼쪽과 중간 엽에서 4 개 개의 샘플과 4 개 개의 샘플을 가져 가라. 샘플은 가능한 한 커야과 크기 만 사용할 간 조직의 양에 의해 제한된다. 작은 레이블 유리 병에 이들을 배치하고 액체 질소에 동결 스냅. 조직 아데노신 삼인산 (ADP), 말론 디 알데히드 (MDA)과 글루타치온 (GSH) 나중에 처리를 위해 다음을 사용합니다.
8. 포스트 실험 분석
- 진단 키트를 사용하여 글루타치온 (GSH), 말론 디 알데히드 (MDA)와 알라닌 아미노 전이 효소 (ALT) 간 조직의 활동과 혈청 샘플을 확인제조업체의 지침에 따라.
- 용해 완충액으로 간 조직을 균질화하고, 브래드 포드 분석법을 이용하여 정량화. 벽개 capase -3- 액틴에 대한 항체를 사용 도데 실 황산나트륨 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 및 면역 블롯에 의하여 조직 용 해물을 분석한다. 공개 소프트웨어로 수행 웨스턴 블랏을 정량화.
Representative Results
이 실험은 2 개 군의 N = 3 마리씩을 수행 하였다. 세 쥐 간 15 분에 걸쳐 주입 펌프에 생리 식염수 2 ㎖ (NS) 주사 하였다. 세 쥐 간 15 분에 걸쳐 주입 펌프 페 길화 수퍼 옥사이드 디스 뮤타 아제 (SOD-PEG, 0.00067 g / mL)로 혼합 된 생리 식염수 2 ㎖ (NS) 주사 하였다. 상기 프로토콜에 기재된 바와 같이, 혈액 시료는 미리 폐문 클램프 및 120 분 후 재관류로 촬영 하였다. 재관류 네 간 조직 샘플의 120 분의 완료는 좌측 및 중간 엽 네 간 샘플로부터 찍은 후 또한 래트 간 오른쪽 엽에서 촬영 하였다.
혈청 알라닌 아미노 전이 효소 (ALT)의 사전 폐문 클램프 제어 120 분 후 재관류 (NS) 및 실험 (PEG-SOD) 동물에서 측정 하였다. 제어 ALT 수준 사이에는 유의 한 차이가 있었다 (NS)동물 사전 폐문 클램프 및 120 분 후 재관류시. ALT 제어 레벨 (NS) 및 실험 동물 (PEG-SOD) 120 분 (도 13a) 사이에 큰 차이가 있었다. 티슈 말론 알데히드 (MDA)의 제어부 (NS) 및 실험 (PEG-SOD) 간 좌우 돌출부 모두의 동물에 대해 측정 하였다. 제어 주입 (NS) 실험 주사 (PEG-SOD)와 오른쪽 로브 (비 폐문 클램프)에서 MDA 조직에는 큰 차이를 설명하지 않는다. 제어 분사 좌엽 (포스트 폐문 클램프 재관류) 조직 MDA (NS)의 오른쪽 로브 (비 폐문 클램프) p <0.001보다 상당히 다르다. 좌엽 (포스트 폐문 클램프 및 재관류) 실험 주사 (PEG-SOD) p <0.005 (도 13B)에 비해 제어 주입 (NS)와 조직 MDA 상당히 상이한 레벨을 갖는다. 티슈 글루타티온 (GSH)을 측정 및 제어 주입 (NS)을 가진 티슈 글루타티온 오른쪽 로브 (비 폐문 클램프)이었다ND 실험 주입 (PEG-SOD)는 큰 차이를 설명하지 않는다. 제어 분사 좌엽 (포스트 폐문 클램프 재관류) 조직 GSH (NS)는 제어 주입 (NS) p <0.05 오른쪽 로브 (비 폐문 클램프)보다 상당히 다르다. 좌엽 (포스트 폐문 클램프 및 재관류) 실험 주사 (PEG-SOD) p <0.005 (도 13C) 대 제어 주입 (NS)와 티슈 글루타티온 농도의 유의 한 차이가있다. 웨스턴 블롯은 대조군 동물의 우측 및 좌측 엽을 비교 수행 하였다 보여 증가 카스파 제 -3 폐문 클램프 및 재관류 (도 13D) 후 좌측 엽 절단. 두번째 웨스턴 블롯 제어 및 PEG-SOD (도 13E)로 처리 된 동물의 좌측 엽을 비교 하였다. 이 PEG-SOD로 치료 동물의 간 조직에서 쪼개진 카스파 제 -3 감소하는 방법을 보여줍니다. 농도계는 demonstra을 수행 하였다절단 된 카스파 제 -3 간 조직에서의 레벨이 상당히 대조 동물 (도 13F)의 바로 좌측 엽 비해 증가된다 팅. 생리 식염수 주입 페그 SOD 주입 실험 동물의 좌측 엽 간 조직 및 대조 동물의 좌측 엽 간 조직을 비교할 때, 농도계 동물에 비해 PEG-SOD 처리 동물에서 절단 된 카스파 제 -3을 크게 저하 보여 제어부 (도 13G)로 처리 하였다.
그림 1 : 해부학 삽화. 쥐의 간 A. 해부학 그림. 쥐의 간 B. 해부학 그림. 간장의 왼쪽과 중간 엽에 포털 꽃자루가 고정된다. 왼쪽과 중간 엽은 허혈성 있습니다. C. 해부학쥐의 간의 그림입니다. 좌측 엽 포털 척추 경은 클램프된다. 왼쪽 엽은 허혈성입니다. 쥐의 간 D. 해부학 그림. 오른쪽 로브 포털은 척추 경 고정되고 오른쪽 로브 허혈성이다.
그림 2 : 해부학 삽화. 포털 쥐의 간 해부학 그림은 정맥 곁가지를 통해 유관. 간 좌측 및 중간 엽 포털 척추 경을 봉합에 의해 포위되고, 미세 혈관 클램프는 관다발 주위에 체결하기 위해 사용되었다. 왼쪽과 중간 엽은 허혈성 있습니다.
그림 3 : 장비 셋업. 이 그림은 일을 보여줍니다 전자 악기 설정합니다.
그림 4 : 수술실 셋업. 이 그림은 수술실 설정을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 복부 헤어의 트리밍. 이 그림은 복부 머리의 트리밍을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 6 : 고정화 및 피부 절개. 이 그림은 쥐의 피부 절개의 고정을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : 늑골 견인기 배치 및 안구 내용 제거술. 이 그림은 늑골 견인기 배치 및 내장 적출을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 : 장소 봉합의, 표준. 이 그림은 봉합의 위치를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9 : 하대 정맥에서 혈액 그리기. 이 그림은 하대 정맥에서 채혈을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10 : 정맥 지점은 오프 묶여 철회. 분기 묶었 및 수축 된 지정 맥이 그림은 보여줍니다. ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig10large.jpg "target ="_ blank "> 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11 : 캐 뉼러의 프로세스. 이 그림은 삽관의 과정을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 12 : 캐 뉼러. 이 그림은 삽관을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 13 : 대표 결과 : 쥐 폐문 클램프 모델을 사용하여 페 길화 수퍼 옥사이드 디스 뮤 타제의 직접 분절 간내 배달. NS 정상 식염수 =. PEG-SOD = 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 - 페 길화, ALT = 알라닌 아미노기 전이 효소, MDA는 말론 디 알데히드 =. A. 혈청 알라닌 아미노 전이 효소 (ALT 뮤 / mL)로 미리 폐문 클램프 및 120 분 후 재관류를 비교. 제어부 (NS) 전 문부 클램프 제어 120 분 후 재관류시 (NS) (p <0.001) 사이의 유의 한 차이가있다. 120 분 후 재관류 (p <0.05)에서 제어부 (NS)과 실험군 (PEG-SOD) 사이에 상당한 차이가있다. 학생의 T-테스트가 사용되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 제어 주입 (NS)는 오른쪽으로 로브 (비 폐문 클램프)에 B. 티슈 말론 디 알데히드실험 D 주사 (PEG-SOD)는 큰 차이를 설명하지 않는다. 좌엽 (포스트 폐문 클램프 재관류) 제어 주입 (NS)와 티슈 말론 디 알데히드 바로 로브 (비 폐문 클램프) p <0.001보다 상당히 다르다. 좌엽 (포스트 폐문 클램프 및 재관류) 실험 주사 (PEG-SOD) p <0.005 대 제어 주입 (NS)와 티슈 말론 상당히 상이한 레벨을 갖는다. 학생의 T-테스트가 사용되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 제어 주입 (NS) 실험 주사 (PEG-SOD)과 C. 오른쪽 로브 (비 폐문 클램프)의 조직 글루타티온은 유의 한 차이를 설명하지 않는다. 좌엽 (포스트 폐문 클램프 재관류) 제어 주입 (NS)와 티슈 글루타티온 제어 주입 (NS) p <0.05 오른쪽 로브 (비 폐문 클램프)보다 상당히 다르다. 좌엽 (포스트 폐문 클램프 재관류)을 제어 조직 injectio과 글루타티온 상당히 상이한 레벨을 갖는실험 주입 대 N (NS) (PEG-SOD) p <0.005. 학생의 T-테스트가 사용되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. D. 웨스턴 블롯은 대조군 동물의 오른쪽 로브 (비 폐문 클램프) 대 좌측 엽 (포스트 폐문 클램프 재관류) (생리 식염수)의 간 조직에서 절단 된 카스파 제 -3 증가 입증. E. 서양 오점을 보여주는 제어 (생리 식염수)로 처리 동물에 비해 PEG-SOD로 치료 동물의 간 조직에서 쪼개진 카스파 제 -3 감소했다. 절단 된 카스파 제 -3 간 조직에서의 F. 레벨이 크게 후 폐문 클램프 재관류 동물 (p <0.05) 증가된다. 학생의 T-테스트가 사용되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. G.은 (PEG-SOD 주입) 실험 동물의 좌측 엽 간 조직 및 (생리 식염수 주입) 대조군의 좌엽의 간 조직과 비교에서, 쪼개진 카스파 제 -3이 크게 저하제어 (생리 식염수)로 처리 동물에 비해 PEG-SOD로 치료 imals. 학생의 T-테스트가 사용되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다.
Discussion
이러한 일련의 실험이 증명이 대조군에 비해 왼쪽으로 PEG-SOD 및 ALT의 방출에 크게 감소되었다 중간 엽, 세포막의 지질 과산화 (MDA)와 글루타치온의 유지 (GSH)의 주입 (생리 식염수 ). 알라닌 아미노 전이 효소 (ALT)를 포함한 간 조직 트랜스 아미나은 간세포 손상의 마커를 설정됩니다. 좌측 엽 PEG-SOD 주입되는 ALT의 감소는 PEG-SOD의 보호 효과를 시사한다. 증가 된 조직 MDA는 지질 과산화를 증가 나타냅니다 산화 스트레스 및 조직 손상의 마커 간주됩니다. 활성 산소의 과잉 생산은 MDA (26)의 생산의 증가를 야기한다. PEG-SOD 주입 한 동물의 좌측 및 중간 엽 조직에서 MDA의 현저한 감소는 PEG-SOD의 보호 효과를 보여준다. 이 PEG-SOD는 손상으로부터 세포를 보호하는 현재의 이해와 일치부분적으로 감소 된 반응성 산소 종 (27)에 의해 발생. 또한, 활성 산소 종의 존재 하에서, 글루타치온 디설파이드 글루타티온 (GSH) (28)로 감소된다. 상기 PEG-SOD 주사 간 좌측 및 중간 엽에서 GSH에서 유지 PEG-SOD의 보호 효과를 강화한다. 또한 허혈 재관류 손상에 노출 된 조직에서, 절단 된 카스파 제 3, 아폽토시스의 생성물이 증가한다는 증명된다. PEG-SOD 처리 좌측 엽 절단 된 카스파 제 -3의 감소는 PEG-SOD는 세포 자멸의 감소에 이르게 것을 시사한다.
과산화물 디스 뮤타 아제 (SOD)의 활성 산소 종의 중독에서 중요한 효소이다. 효소는 과산화수소와 물로 두 수퍼 옥사이드 음이온의 전환을 촉매한다. 효소 카탈라제는 프로세스 (25)를 완성 물 및 산소를 과산화수소로 변환한다. 의 반감기네이티브 SOD 공액 폴리에틸렌 글리콜 - 슈퍼 옥사이드 디스 뮤타 아제 (SOD-PEG)의 개발까지 실험 모델에서의 사용을 제한했다. 폴리에틸렌 글리콜에 컨쥬 게이션 SOD의 14 시간을 6 분에서의 반감기를 증가시킨다. 구엔은 등. 전신 배달 (29)를 사용하여 쥐 모델에서 간 허혈에서 지질 과산화를 완화 할 수있는 능력을 보여 주었다.
기술 여기에 설명 된 일부는 이전에 문헌에 기술 된 잠재적 인 수정의 다양한있다. 모델에 사용 된 분자에 따라 흡입 (11), 경막 외 주입 (12), 복강 내 주사 17, 18, 21, 22, 정맥 내 투여 10, 14, 15을 사용하여 전달 된
이 프로토콜에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 가장 중요한 것은 문맥의 삽관입니다. 치료는 정맥을 잘라 구멍이 너무 크지 않도록주의해야합니다. 조직은 매우 탄력적 및 정공은 자체적으로 확대된다. 우리는 미세 수술 가위로 0.5 mm 인 구멍을 절단하여 시작하는 것이 좋습니다. 캐 뉼러는 손 절차의 일부를 수행하려는 경우보다 민첩성 허용하는기구를 사용하여 구멍을 통해 공급 될 수있다. 처음에 캐 뉼러를 공급하면서 또한, 정맥의 뒤쪽 벽에 구멍을 파고 않도록 좌우 포털 정맥의 분기점을 향해 직접 겨냥한다. 캐뉼라 팁 분기점에 도달하면, 그 다음 특정 왼쪽 정맥 내로 공급 될 수있다동맹국. 정맥은 왼쪽과 중간 엽을 모두 공급하는 왼쪽 포털 정맥에 공급되면, 그 위치는 정맥 내부를 느낌에 의해 수동으로 확인할 수 있습니다. 그 위치는 간장의 공급 세그먼트의 창백 효과를 차가운 생리 식염수를 소량 주입으로보고 확인할 수있다.
쥐의 간 문부 클램프 모델 간 허혈 - 재관류 손상을 입증하기위한 재현하고 안정적인 플랫폼을 제공합니다. 가변 폐문 클램프 모델은 산화 방지제 및 다른 작은 분자가 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14의 보호 효과를 연구하는 연구자들이 사용되어왔다. 변화 점은 혈관 클램프를 포함 할 수 있습니다 담관이 포함되어 있는지의 여부 허혈성 만들어진 세그먼트 ED, 재관류 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18의 기간의 길이, 19, 20, 21. 이 모델은 분자 투여 경로 투여의 영향을 연구하기 위해 사용되는 경우 또한 이기종 8, 10, 11,"> 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24. 상술 한 방법에 몇 가지 장점이있다이. 우선, 허혈성 세그먼트 포털 공급 직접 캐 뉼러에 직접 분절 간 전송을 허용 연구중인 약물 물질. 이것은 내부 제어로서 간 다른 돌출부의 이용을 허용한다. 둘째, 분절 간 삽관이 검토되고 분자에 대한 분포의 감소 된 용적을 허용한다. 이러한 접근하여 같은 전신 부작용의 위험을 줄일 물질이. 관심 간 세그먼트에 직접 주입 간 세그먼트의 직접 삽관 전 허혈을 제공하는 물질을 가능하게한다, 내 허혈 후 허혈. 이는 허혈 - 재관류 손상 사이클의 어느 지점에서 분자의 효과를 연구 할 수 있습니다. 허혈성 시간의 증가 길이 가능한 것 간 재생을 연구하는 부상 추가적인 기회의 증가 수준.
이 방법의 몇 가지 제한이있다. 첫 번째는 창업 비용이다. 수술 현미경의 구입은 이미 하나를 가지고 있지 않는 실험실의 중요한 시작 비용이 될 수 있습니다. 이 기술은 현미경없이 어렵거나 불가능할 수있다. 두 번째는 곡선 시간을 배우고있다. 이 절차는 비교적 간단하지만 그것은 연습이 필요하며 만약 초보자가 전문가가되기 위해 절차의 상당수를 필요로 할 것 같다.
요약하면,이 모델은 간 허혈 - 재관류 손상을 연구하기 위해, 재현 간단하고 비용 효율적인 플랫폼을 수 있습니다. 프로토콜에 폴리에틸렌 GL 여기 설명되었지만ycol - 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제, 자유 라디칼 스 캐빈 저 (25), 주입 된이 모델은 간에서 I / R 손상에 미치는 영향을 평가하기 위해 다른 약물 물질의 다양한 주입하는 데 사용할 수 있습니다.
Disclosures
모든 저자들이 더 공개가 없습니다보고합니다.
Acknowledgments
우리는 그의 설명 작업 데니스 마티아스을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 NIH T32AI 106704-01A1와 오하이오 주립 대학의 장기 이식, 관류, 엔지니어링 및 재생을위한 T 플레쉬 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 200- 250 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane Molecular Weight 184.5 | Piramal Healthcare | ||
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| 27-0 Micro-Cannula | Braintree Scientific | MC-28 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| Polyethylene Glycol - Superoxide Dismutase (PEG-SOD) | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| GenieTouch | Kent Scientific | ||
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4 x 4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5 mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps - Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps - Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors - non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps - Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Other Instruments | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Mosquito Clamps | Generic | ||
| Analysis | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alannine aminotransferase (ALT) assay | Biovision | K752-100 | |
| Malondialdehye (MDA) assay | Abcam | ab118970 | |
| Glutathione (GSH) assay | Cayman Chemical | 7030002 | |
| Antibodies - Cleaved Caspase-3 and Actin | Cell Signaling Tecnology | Antibody 9661 | |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Millipore | 10-188 |
References
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