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Biochemistry

एक यूवी विज़ और रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी Immunoassay प्लेटफार्म fabricating

Published: November 10, 2016 doi: 10.3791/54795
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Biological Engineering Department, Utah State University
* These authors contributed equally

Abstract

Immunoassays जुड़े एंटीबॉडी की उपस्थिति के आधार पर प्रोटीन का पता लगाने के लिए किया जाता है। अनुसंधान और नैदानिक ​​सेटिंग में उनकी व्यापक उपयोग के कारण, प्रतिरक्षा उपकरणों और सामग्री की एक बड़ी बुनियादी ढांचा पाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 96 और 384 अच्छी तरह से polystyrene प्लेटें उपलब्ध व्यावसायिक तौर पर कर रहे हैं और विभिन्न निर्माताओं से पराबैंगनी दिखाई (यूवी विज़) स्पेक्ट्रोस्कोपी मशीनों को समायोजित करने के लिए एक मानक डिजाइन किया है। इसके अलावा, इम्युनोग्लोबुलिन, पता लगाने टैग, और इस तरह के एंजाइम से जुड़ी immunosorbent assays (एलिसा) के रूप में अनुकूलित प्रतिरक्षा डिजाइन के लिए अवरुद्ध एजेंटों की एक विस्तृत विविधता में उपलब्ध हैं।

मौजूदा बुनियादी ढांचे के बावजूद, मानक एलिसा किट सभी अनुसंधान की जरूरत को पूरा नहीं करते, व्यक्तिगत प्रतिरक्षा विकास है, जो महंगा है और समय लेने वाली हो सकती है की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, एलिसा किट कम बहुसंकेतन (एक समय में एक से अधिक analyte का पता लगाने के) क्षमता है क्योंकि वे आम तौर प्रतिदीप्ति या कर्नल पर निर्भरपता लगाने के लिए orimetric तरीकों। Colorimetric और फ्लोरोसेंट आधारित विश्लेषण व्यापक वर्णक्रम चोटियों के कारण बहुसंकेतन क्षमताओं को सीमित कर दिया है। इसके विपरीत, रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी आधारित विधियों संकीर्ण उत्सर्जन चोटियों के कारण बहुसंकेतन के लिए एक बहुत बड़ी क्षमता है। रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का एक अन्य लाभ यह है कि रमन ने संवाददाताओं से फ्लोरोसेंट टैग 1 की तुलना में काफी कम photobleaching का अनुभव है। लाभ में फ्लोरोसेंट और वर्णमिति टैग से अधिक है कि रमन ने संवाददाताओं के बावजूद, प्रोटोकॉल के निर्माण के लिए रमन आधारित immunoassays सीमित हैं। इस पत्र का उद्देश्य यूवी विज़ विश्लेषण और रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा analytes की प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए polystyrene प्लेटों के साथ संयोजन के रूप में उपयोग करने के क्रियाशील जांच तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है। इस प्रोटोकॉल जबकि पूर्व स्थापित बुनियादी ढांचे पर capitalizing शोधकर्ताओं भविष्य बहु analyte का पता लगाने के लिए एक है, यह अपने आप दृष्टिकोण लेने की अनुमति होगी।

Introduction

ठेठ सैंडविच immunoassays परोक्ष रूप से एक प्रतिजन दो एंटीबॉडी का उपयोग की उपस्थिति का पता लगाने। कब्जा एंटीबॉडी एक ठोस सतह के लिए बाध्य है और एक उचित प्रतिजन के लिए एक एंटीबॉडी प्रतिजन जटिल निकटता में जब रूपों है। एक का पता लगाने एंटीबॉडी तो शुरू की है और प्रतिजन को बांधता है। धोने के बाद, एंटीबॉडी / प्रतिजन / एंटीबॉडी जटिल बनी हुई है और लेबल का पता लगाने के एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया के रूप में चित्रा 1 ए में प्रदर्शन किया है। ठेठ का पता लगाने के एक फ्लोरोसेंट या वर्णमिति डिटेक्टर द्वारा किया जाता है, 10 व्यापक वर्णक्रम चोटियों 2,3 के कारण analytes को बहुसंकेतन सीमित। इसके विपरीत, रमन आधारित प्रणाली बहुत संकरा उत्सर्जन करने के लिए 100 analytes 2,3 के एक साथ पता लगाने का दावा स्रोतों के साथ बढ़ाया बहुसंकेतन क्षमताओं में जिसके परिणामस्वरूप चोटियों है।

कई साहित्य स्रोतों उपलब्ध है जो Immunoassays से संबंधित महत्वपूर्ण पहलुओं को कवर कर रहे 4 - 6 ऐसे कदम-दर-कदम के रूप मेंजानकारी के व्यक्तिगत एलिसा किट बनाने के लिए। दुर्भाग्य से, इन प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट या वर्णमिति पता लगाने के लिए कर रहे हैं, अनुकूलित immunoassays की बहुसंकेतन क्षमता सीमित है। इस जरूरत को संबोधित करने के लिए, हम यूवी विज़ / रमन प्रतिरक्षा एक सीधा प्रतिरक्षा के लिए पहले से 7 प्रकाशित के रूप में चित्रा 1 बी में सचित्र निर्माण करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं।

इस प्रोटोकॉल क्रियाशील सोने nanoparticle आधारित जांच के निर्माण, चित्रा 2 में सचित्र प्रक्रिया सोने के नैनोकणों की सतह (AuNPs) के लिए रमन ने संवाददाताओं को बंधन से शुरू होता रमन / यूवी विज़ जांच करने के लिए भी शामिल है।। AuNPs तो यह है कि पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) के साथ जुड़े रहे हैं एंटीबॉडी के साथ क्रियाशील रहे हैं। AuNPs पर शेष बाध्यकारी साइटों AuNPs को methoxy पॉलीथीन ग्लाइकोल thiol (एमपीईजी एसएच) बाध्यकारी विश्लेषण के दौरान बाद में गैर विशिष्ट बंधन को रोकने के लिए द्वारा अवरुद्ध कर रहे हैं। तैयार AuNP जांच एंटीजन के बंधन से परीक्षण कर रहे हैंएक polystyrene प्लेट के कुओं के लिए तय रूप में चित्रा 1 बी में सचित्र। प्लेट धोने पर, AuNP जांच यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर पाया जाता है, जबकि जुड़े रमन ने संवाददाताओं से रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ पाया जाता है। यूवी विज़ और रमन वर्णक्रमीय डेटा का मेल है, विश्लेषण के दो तरीके प्रदान करता है इस प्रतिरक्षा की क्षमताओं को बढ़ाना।

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Protocol

1. बफ़र की तैयारी

  1. फॉस्फेट खारा बफर (पीबीएस)
    1. 450 मिलीलीटर एचपीएलसी ग्रेड पानी के साथ 10x पीबीएस के 50 मिलीलीटर पतला एक 1x पीबीएस एकाग्रता बनाने के लिए। बाँझ फिल्टर 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ समाधान।
    2. कमरे के तापमान पर स्टोर समाधान।
  2. Tris खारा बफर + बीच 20 (TBST) की तैयारी
    1. 450 मिलीलीटर एचपीएलसी ग्रेड पानी के साथ 10x Tris बफर खारा (टीबीएस) के 50 मिलीलीटर पतला एक 1x एकाग्रता बनाने के लिए। बीच -20 की एक 0.05% (वी / वी) के लिए बीच -20 के 250 μl जोड़ें। बाँझ फिल्टर 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ समाधान।
    2. कमरे के तापमान पर रखो।
  3. मानव सीरम albumin की तैयारी (एचएसए) अवरुद्ध समाधान
    1. बाँझ फ़िल्टर 1x पीबीएस के 15 मिलीलीटर में एचएसए की 0.45 ग्राम वजन एक 3% w / एचएसए समाधान वी बनाने के लिए। एचएसए जब तक भंवर समाधान पूरी तरह से भंग कर रहा है।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर एचएसए समाधान।
      नोट: गोजातीय सीरम albumin(बीएसए) ने भी एक अवरुद्ध समाधान के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. PEGylated एंटीबॉडी की तैयारी (खूंटी-AB) समाधान
    नोट: एंटीबॉडी समाधान इस तरह के रूप में बीएसए वाहक या स्थिर प्रोटीन है, जो विकार प्रतिक्रियाओं के साथ एन hydroxysulfosuccinimide (एनएचएस) बाध्यकारी साइटों के लिए प्रतिस्पर्धा द्वारा हस्तक्षेप करेगा से मुक्त होना चाहिए। एंटीबॉडी एक Tris या ग्लाइसिन बफर समाधान में आता है, यह एनएचएस विकार प्रतिक्रिया के साथ हस्तक्षेप से amines या अमोनियम लवण को रोकने के लिए एक बफर विनिमय से गुजरना होगा। एंटीबॉडी एक lyophilized रूप में है, तो यह 1-10 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में निर्माता की सिफारिश के अनुसार resuspended जा सकता है।
    1. एक Tris या ग्लाइसिन बफर में एंटीबॉडी के लिए, एक desalting स्तंभ का उपयोग कर 100 मिमी सोडियम बाइकार्बोनेट के लिए एक बफर आदान प्रदान करते हैं। विकार प्रतिक्रिया तेजी लाने के लिए लगभग 8.5 पीएच को बढ़ाने के लिए 100 मिमी बफर का प्रयोग करें।
    2. साथ 100 मिमी रों हाइड्रेट ऑर्थो-pyridyl डाइसल्फ़ाइड खूंटी एनएचएस (OPSS खूंटी एनएचएस)1 मिलीग्राम / मिलीलीटर या अधिक से अधिक की एकाग्रता में 1 मिलीलीटर की एक मात्रा को घृणा बिकारबोनिट।
      नोट: OPSS खूंटी एनएचएस ताजा कर दिया है और लगभग 20 मिनट के भीतर किया जाना चाहिए। OPSS खूंटी एनएचएस एनएचएस पर समूह पीएच 8.5 पर एक जलीय घोल में लगभग 20 मिनट की एक आधा जीवन है।
    3. 1 के अनुपात (खूंटी: एंटीबॉडी) एक 2 पर एंटीबॉडी समाधान करने के लिए OPSS खूंटी एनएचएस जोड़े विकार अनुपात नमूने परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए 1 विकार अनुपात: एक अलग microcentrifuge ट्यूब में, एक 2 पर प्रतिजन समाधान के लिए OPSS खूंटी एनएचएस जोड़ें।
      नोट: 2: 1 के अनुपात में एक 50% विकार दक्षता संभालने है। उद्देश्य एक खूंटी श्रृंखला के साथ प्रत्येक एंटीबॉडी लेबल करने के लिए है। इस चरण में, ओवर-लेबलिंग के तहत लेबलिंग की तुलना में बेहतर है। OPSS खूंटी-एन एच एस और एंटीबॉडी समाधान की उचित मात्रा निर्धारित करने के लिए निम्न समीकरण का उपयोग करें:
      समीकरण
      जहां वी मात्रा है, सी अणुओं या एक में व्यक्त एकाग्रता हैमिलीलीटर प्रति tibodies। Subscripts खूंटी और Ab OPSS खूंटी एनएचएस और एंटीबॉडी, क्रमशः रहे हैं। अंतिम मात्रा लगभग 250 μl होना चाहिए।
    4. 8 घंटे या रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर खूंटी-AB समाधान सेते हैं। -20 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 25 μl की aliquots काम कर फ्रीज पिघलना चक्र सीमा और कम बाध्यकारी नलियों का उपयोग सुनिश्चित बनाने के लिए स्टोर समाधान।

2. तैयार यूवी विज़ / रमन जांच

  1. नंगे AuNP समाधान तैयार
    1. मिलीलीटर प्रति लगभग 1 एक्स 10 11 कणों की एक एकाग्रता के साथ AuNPs की एक 2 मिलीलीटर समाधान तैयार है।
      1. AuNPs केंद्रित करने की आवश्यकता है, तो 20 मिनट के लिए या जब तक सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट है 5000 XG पर शेयर AuNP के 2,000 μl और सेंट्रीफ्यूज के साथ कम से बाध्यकारी अपकेंद्रित्र ट्यूब भरें। pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें, AuNP गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा।
      2. एक ट्यूब में शेष AuNP समाधान गठबंधन और concentra का अनुमानएक यूवी विज़ माप प्राप्त करने और ज्ञात सांद्रता के मूल्यों की तुलना के रूप में यह एक रैखिक संबंध है द्वारा tion।
  2. निर्धारित बनाने के लिए उचित रमन संवाददाता लेबलिंग अनुपात
    1. रमन संवाददाता मेथनॉल में भंग का काम कर रहे एक समाधान तैयार है। यह एकाग्रता का इस्तेमाल किया रिपोर्टर पर निर्भर हो जाएगा। इस काम में, 200 माइक्रोन की काम समाधान पर 3,3'-diethylthiatricarbocyanine आयोडाइड (DTTC) तैयार करें।
    2. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 100 μl के अंतिम मात्रा मानते हुए, एक 96 अच्छी तरह से थाली की पहली पंक्ति के प्रत्येक अच्छी तरह से काम कर रहे एक पत्रकार के समाधान के लिए पर्याप्त जोड़ने ऐसी है कि रमन संवाददाता 0.2 माइक्रोन से 10 माइक्रोन के लिए सांद्रता में लेकर जाएगा। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पर्याप्त HPLC ग्रेड पानी डालें कि मात्रा 80 μl है। प्रत्येक अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 100 μl के अंतिम मात्रा में अच्छी तरह से बनाने के लिए AuNP के 20 μl जोड़ें। एक उदाहरण तालिका 1 में प्रदान की जाती है।
    3. यूवी विज़ स्पेक्ट्रा 400 से करने के लिए उपाय700 एक थाली-पढ़ने यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग एनएम। उचित एकाग्रता यूवी विज़ स्पेक्ट्रा के लिए परिभाषित चोटियों के साथ सर्वोच्च एकाग्रता है। AuNPs के लिए रमन ने संवाददाताओं के सर्वोच्च एकाग्रता अनुपात तक सांद्रता बढ़ाने पर दोहराएँ कदम 2.2.2 पाया जाता है।
      नोट: डाई और AuNP आकार, आकार, और निर्माता उचित एकाग्रता प्रभावित करते हैं। इसलिए, सूचीबद्ध चरणों का मूल्यांकन किया जाना चाहिए और बदल इस्तेमाल किया घटकों पर निर्भर करता है। इस प्रोटोकॉल एक सकारात्मक आरोप लगाया डाई का उपयोग शामिल किया गया। जैसे, AuNP और रिपोर्टर के बीच बाध्यकारी नकारात्मक आरोप लगाया AuNPs का उपयोग करके सुधार किया गया था। इस साइट्रेट छाया हुआ AuNPs का उपयोग करके किया गया था। अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें।
  3. रमन रिपोर्टर और खूंटी-AB बंधन AuNP करने के लिए
    1. रमन संवाददाता कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए AuNPs करने के लिए बाध्य करने के लिए अनुमति पहले से निर्धारित एकाग्रता में AuNP और रमन रिपोर्टर के दो 1.5 मिलीलीटर बैच तैयार।
    2. कणों के लिए एंटीबॉडी का अनुपात 1: PEGylated एंटीबॉडी (खूंटी-AB) AuNP और रमन संवाददाता समाधान के लिए एक 200 बनाने में से एक बैच में जोड़े। यह समाधान नमूने परीक्षण के लिए किया जाएगा। कणों के लिए एंटीबॉडी के 1 के अनुपात नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा: एक अलग microcentrifuge ट्यूब में, एक 200 पर AuNP और रमन संवाददाता समाधान के दूसरे बैच के लिए PEGylated प्रतिजन जोड़ें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए समाधान सेते हैं।
      नोट: कणों के लिए एंटीबॉडी के अनुपात AuNPs के लिए विशिष्ट हो सकता है और इस्तेमाल डाई और प्रत्येक व्यक्ति के मामले के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए होगा। यहाँ उद्देश्य AuNP जांच करते हुए कणों के एकत्रीकरण को रोकने के लिए बाध्य करने के लिए एंटीबॉडी के उच्चतम अनुपात है। एक साथ जोड़ने के लिए उपयुक्त मात्रा में निर्धारित करने के लिए निम्न समीकरण का उपयोग करें:
      समीकरण
      जहां वी मात्रा है, सी कणों या मिलीलीटर प्रति एंटीबॉडी में व्यक्त एकाग्रता है। पंखअल मात्रा लगभग 1.5 मिलीग्राम होना चाहिए।
  4. ब्लॉक शेष एमपीईजी-एसएच साथ AuNP सतह पर साइटों।
    1. पानी का उपयोग कर एक 200 सुक्ष्ममापी एकाग्रता के लिए ठोस methoxy पॉलीथीन ग्लाइकोल thiol भंग द्वारा एमपीईजी-एसएच तैयार करें। समाधान भंवर तक एमपीईजी-एसएच पूरी तरह से भंग कर रहा है।
    2. AuNP खूंटी-AB समाधान 2.3 कदम में बनाया करने के लिए 1 के अनुपात: एमपीईजी एसएच एक 40,000 पर जोड़ें। यह सुनिश्चित करने के लिए सोने nanoparticle पर शेष साइटों को अवरुद्ध कर रहे हैं 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर समाधान सेते हैं। एक साथ जोड़ने के लिए उपयुक्त मात्रा में निर्धारित करने के लिए निम्न समीकरण का उपयोग करें:
      समीकरण
      जहां वी मात्रा है, सी कणों या मिलीलीटर प्रति एंटीबॉडी में व्यक्त एकाग्रता है। अंतिम मात्रा लगभग 1.5 मिलीग्राम होना चाहिए।
  5. क्रियाशील रमन जांच की वसूली।
    1. कम बाँध सी में 20 मिनट के लिए 5000 XG पर अपकेंद्रित्र कणोंentrifuge ट्यूब या जब तक सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट है। pipetting AuNPs परेशान करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा से सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    2. 1x पीबीएस समाधान के 1 मिलीलीटर है कि पहले बनाया गया था के साथ कणों Resuspend। समाधान (3 μl) की एक छोटी मात्रा का एक यूवी विज़ माप लेने के द्वारा AuNP एकाग्रता का अनुमान है और एक ज्ञात AuNP एकाग्रता से माप के परिणामों की तुलना करें। मात्रा समायोजित ऐसी है कि अंतिम समाधान मिलीलीटर प्रति कम से कम 1 एक्स 10 11 कणों है।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर समाधान जब तक यह प्रतिरक्षा थाली के functionalizing के लिए प्रयोग किया जाता है। एक सप्ताह के भीतर समाधान का प्रयोग करें।
वॉल्यूम प्रत्येक घटक की जोड़ने के लिए (एमएल)
DTTC अंतिम एकाग्रता (मिमी) DTTC काम समाधान (200 मिमी) AuNP पानी
0.2 0.1 20 79.9
0.6 0.3 20 79.7
1 0.5 20 79.5
2 1.0 20 79
5 2.5 20 77.5
7 3.5 20 76.5
10 5.0 20 75

तालिका 1 DTTC कमजोर पड़ने उदाहरण है। DTTC के विभिन्न dilutions और शेयर DTTC, सोने nanoparticle समाधान है, और पानी के जुड़े खंडों।

3. Immunoassay प्लेट तैयारी

  1. प्रतिरक्षा थाली करने के लिए वांछित प्रतिजन बाँध।
    1. polystyrene कुओं को भरने के लिए पर्याप्त पतला प्रतिजन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) तैयार करें। समाधान भंवर,और तुरंत प्लेट कुओं का हल जोड़ें। प्रतिजन कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्लेटों के लिए बाध्य करने की अनुमति दें।
  2. अपार एंटीजन से धो लें।
    1. एक निपटान कंटेनर में समाधान डंपिंग और एक कागज तौलिया से ढके टेबलटॉप के खिलाफ प्लेट मार से अतिरिक्त प्रतिजन समाधान निकालें।
    2. कुओं के लिए TBST के रूप में जोड़ें पहले कहा एक ही तरीके से फिर सतह धोने धोने हटा दें। इस कदम दो बार दोहराएँ।
  3. ब्लॉक गैर विशिष्ट बंधन को रोकने के लिए थाली पर बाध्यकारी साइटों शेष।
    1. थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एचएसए अवरुद्ध समाधान के 70 μl जोड़ें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    2. निकालें और 3.2 कदम के रूप में निर्दिष्ट की थाली में एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर कुल्ला। आगे उपयोग के लिए तैयार है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट और सूखे की दुकान को कवर किया।
  4. प्रतिरक्षा प्लेट functionalize।
    1. टी के 70 μl जोड़ेवह एक 96 अच्छी तरह से थाली के पहले स्तंभ के लिए धारा 2 में तैयार नैनोकणों जांच और एक 1 का उपयोग बाद में स्तंभों को कमजोर: 2 धारावाहिक कमजोर पड़ने। थाली में कम से कम 1 घंटे के लिए सेते दें। कैसे प्रतिरक्षा प्लेट तैयार करने का एक उदाहरण चित्रा 3 में दी गई है।
    2. TBST के साथ थाली धो पांच बार के रूप में कदम 3.2 में विस्तृत उचित AuNPs के निपटान के लिए सुनिश्चित कर रही है। अंतिम धोने के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1x पीबीएस के 70 μl जोड़ें और एक थाली मुहर के साथ कवर किया।
      नोट: कंट्रोल नमूने स्पष्ट होना चाहिए। यदि गैर विशिष्ट बंधन हुआ है, नियंत्रण के नमूने परीक्षण के नमूने के रूप में एक समान रंग होगा।
  5. यूवी विज़ और रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा टेस्ट परख संवेदनशीलता।
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से, यूवी विज़ स्पेक्ट्रा एक थाली-पढ़ने यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग 400 से 700 एनएम को लेकर मापने।
    2. एक औंधा रमन माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, अच्छी तरह से जांच AuNP है की सतह पर ध्यान केंद्रित उद्देश्य। ओबीअच्छी तरह से एक रमन स्पेक्ट्रा टाइन। एक स्पेक्ट्रम 1,800 सेमी से 400 सेमी -1 से लेकर ले लीजिए -1। सभी कुओं के लिए इस चरण को दोहराएँ।
    3. एक उचित वर्णक्रम सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, यूवी विज़ स्पेक्ट्रा के लिए रमन स्पेक्ट्रा के लिए एक 11 वें क्रम बहुपद आधारभूत सुधार और एक 3 आरडी आदेश बहुपद प्रदर्शन करते हैं।
    4. एक उचित वर्णक्रम सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, रमन और यूवी विज़ स्पेक्ट्रा मानक के अनुसार। 1 के लिए अधिकतम मूल्य निर्धारित करें और तदनुसार अन्य सभी मूल्यों पैमाने। रमन स्पेक्ट्रा को सामान्य करने के लिए, एक अनूठा polystyrene चोटी का चयन करें और 1 के लिए यह बराबर सेट और तदनुसार अन्य सभी मूल्यों पैमाने।
    5. एक उचित वर्णक्रम सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, प्रत्येक स्पेक्ट्रम के लिए पीक एकीकरण प्रदर्शन करते हैं। रमन स्पेक्ट्रा के लिए, शिखर रमन संवाददाता का प्रतिनिधित्व polystyrene चोटियों के एक क्षेत्र अनुपस्थित में होना चाहिए। चोटी के एकीकरण को करने के लिए वांछित शिखर के लिए अभिन्न सीमाओं निर्दिष्ट और नियंत्रण सहित सभी नमूनों के लिए वांछित शिखर क्षेत्र रिकॉर्ड है।
    6. Plउसके संबंधित मानक विचलन का संकेत प्रत्येक बिंदु के लिए त्रुटि सलाखों के साथ AuNP एकाग्रता का लॉग के एक समारोह के रूप में ब्याज की औसत शिखर क्षेत्र ओ.टी.। एक 4 पैरामीटर रसद वक्र करने के लिए इन अंशांकन अंक फिट बैठते हैं।
    7. एक खाली नमूना के लिए ब्याज की चोटी के क्षेत्र के औसत से खाली का मतलब मूल्य निर्धारित करते हैं। इन क्षेत्रों के मानक विचलन का निर्धारण करते हैं; इस खाली के मानक विचलन है।
    8. एक ही चोटी के पिछले चरण में विश्लेषण के लिए, सबसे कम एकाग्रता के लिए है कि शिखर क्षेत्र के मानक विचलन पाते हैं।
    9. प्रतिनिधि परिणाम खंड में निर्दिष्ट के रूप में पता लगाने की खाली और निचली सीमा की सीमा की गणना। AuNP एकाग्रता के मामले में Llod निर्धारित करने के लिए 4PL अंशांकन घटता के साथ इन मूल्यों का प्रयोग करें।

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Representative Results

इस अध्ययन में, 60 एनएम सोने के कणों यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल किया गया। यूवी विज़ अवशोषण स्पेक्ट्रा प्रत्येक AuNP एकाग्रता के लिए 400 से 700 एनएम एकत्र किए गए थे और चोटी के क्षेत्रों से एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर वर्णक्रम विश्लेषण 8 का उपयोग निर्धारित किया गया है। एकीकरण चोटी करने से पहले, एकत्र स्पेक्ट्रा एक तीन सूत्री बहुपद फिट का उपयोग कर आधारभूत सुधार कराना पड़ा। शिखर क्षेत्रों के रूप में चित्रा 4 में प्रदर्शन एक लघुगणक अंशांकन वक्र उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि आंकड़े 4 और 5 शामिल लघुगणक अंशांकन घटता। गैर रेखीय अंशांकन घटता का उपयोग काफी एक परख के गतिशील रेंज का विस्तार कर सकते हैं और विभिन्न immunoassays कि कम रेंज का पता लगाने क्षमताओं 9,10 की आवश्यकता के लिए एक स्वीकृत अभ्यास हो गया है।

मात्रात्मक परख की संवेदनशीलता, खाली (LOB) की सीमा का आकलन करने के लिए औरइस प्रकार के रूप में पता लगाने की निचली सीमा (Llod) गणना की गई
समीकरण
समीकरण
जहां खाली के मानक विचलन और सबसे कम नमूना एकाग्रता की σ खाली है और σ कम, क्रमशः, जबकि समीकरण खाली 11,12 का मतलब मूल्य है। इन परिभाषाओं, साथ ही उत्पन्न 4 पैरामीटर रसद अंशांकन वक्र, यूवी विज़ के लिए Llod का उपयोग सोने के नैनोकणों के 3.5 प्रधानमंत्री थे।

पहले से विस्तृत 7 रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी सेटअप, का उपयोग करते हुए एक 785 एनएम उल्टे रमन माइक्रोस्कोप क्रियाशील प्रतिरक्षा थाली के साथ जुड़े DTTC रमन रिपोर्टर से स्पेक्ट्रा एकत्र करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। संचालन मानकों शामिल 7 मेगावाट लेजर शक्ति और एक 10 सेकंड एसीquisition समय। स्पेक्ट्रा आधारभूत सुधार (11 वें क्रम बहुपद) और शिखर एकीकरण कराना पड़ा। चित्रा 5 4 पैरामीटर रसद अंशांकन 493 सेमी -1 और 508 सेमी -1 DTTC चोटियों के लिए DTTC शिखर क्षेत्रों के लिए उत्पन्न की अवस्था से पता चलता है। रमन रिपोर्टर की सटीक एकाग्रता AuNP सतह के लिए बाध्य अज्ञात था, अंशांकन वक्र AuNP एकाग्रता पर आधारित था। समीकरणों के ऊपर वर्णित का उपयोग करना, Llod AuNP 1.7 प्रधानमंत्री बनने के लिए निर्धारित किया गया था।

आकृति 1
चित्रा 1. प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष रूप से प्रतिरक्षा विश्लेषण। अप्रत्यक्ष (ए) के चित्रण और प्रत्यक्ष immunoassays के लिए (बी) का पता लगाने योजनाओं का चित्रण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. Nanoparticle जांच निर्माण चित्रण। Immunoassays के लिए रमन / यूवी विज़ जांच functionalizing की प्रक्रिया। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें। यह आंकड़ा का एक बहुत बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. तैयार प्रतिरक्षा थाली। एक तैयार प्रतिरक्षा प्लेट की छवि। ई के माध्यम से पंक्तियाँ एक परीक्षण के नमूने जबकि एच के माध्यम से पंक्तियों एफ नियंत्रण नमूने हैं। कॉलम 1 undiluted नैनोकणों में शामिल है और हर बाद स्तंभ आधा एकाग्रता हैAuNP जांच की। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. यूवी विज़ nanoparticle जांच का उपयोग प्रतिरक्षा के लिए अंशांकन वक्र। Nanoparticle एकाग्रता के लिए यूवी विज़ शिखर क्षेत्रों के लिए लघुगणक अंशांकन वक्र। फिट लाइन एक 4 पैरामीटर रसद (4PL) की अवस्था है। त्रुटि सलाखों शिखर क्षेत्र मानक विचलन का संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। यह आंकड़ा का एक बहुत बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5 प्रतिरक्षा का उपयोग कर nanoparticle जांच के लिए चित्रा 5. रमन अंशांकन वक्र। कैलिब्रेशन वक्र सोने nanoparticle एकाग्रता के लिए रमन संवाददाता शिखर क्षेत्र correlating। फिट लाइन एक 4 पैरामीटर रसद (4PL) की अवस्था है। त्रुटि सलाखों शिखर क्षेत्र मानक विचलन का संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। यह आंकड़ा का एक बहुत बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

विस्तृत प्रोटोकॉल में, वहाँ कई महत्वपूर्ण बिंदुओं को संबोधित करने के लिए कर रहे हैं। एक मुद्दा रमन रिपोर्टर और सोने nanoparticle की पसंद है। हालांकि प्रोटोकॉल व्यक्तिगत उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा करने के लिए लिखा गया था, रमन संवाददाता DTTC एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। DTTC एक सकारात्मक आरोप लगाया पत्रकार है और नकारात्मक आरोप लगाया लिए इस तरह के साइट्रेट छाया हुआ AuNPs के रूप में सतहों बांधता है। इस प्रोटोकॉल एक सकारात्मक सतह प्रभारी के साथ सोने के नैनोकणों का उपयोग करके नकारात्मक आरोप लगाया पत्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, polyethyleneimine (पी) छाया हुआ AuNPs एक सकारात्मक सतह प्रभारी प्रदान करते हैं और बेहतर नकारात्मक आरोप लगाया पत्रकारों के साथ बंधन।

प्रोटीन और नैनोकणों के बीच संतुलन बनाए रखने के लिए इस प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण कदम है। यह संतुलन 200 के सोने nanoparticle अनुपात करने के लिए एक अनुकूलित एंटीबॉडी पर PEGylated एंटीबॉडी जोड़कर हासिल की है: 1। PEGylated एंटीबॉडी थी की तुलना में काफी अधिक अनुपात में सोने nanoparticle समाधान के लिए जोड़ रहे हैंएस, आयन प्रेरित कण एकत्रीकरण हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक अनुपात का बहुत छोटा है, प्रोटीन एकत्रीकरण और जटिलता घटित होता है। यह अनुपात प्रत्येक व्यक्ति के मामले में निर्धारित किया जाना चाहिए।

एक अन्य महत्वपूर्ण कदम प्रोटोकॉल एंटीबॉडी के लिए OPSS खूंटी एनएचएस के विकार है। यह कदम सोडियम बाइकार्बोनेट जहां एनएचएस समूह एंटीबॉडी को बांध में OPSS खूंटी एनएचएस निलंबित से पहले है। जैसा कि पहले 7 विस्तृत यह विकार कदम प्रतिकूल हाइड्रोलिसिस प्रतिक्रिया के साथ प्रतिस्पर्धा। हाइड्रोलिसिस प्रतिक्रिया और अधिक समय के साथ होने की संभावना है, और जैसे, एंटीबॉडी बाध्यकारी OPSS खूंटी एनएचएस तुरंत किया जाना चाहिए।

प्रोटोकॉल के अंत उत्पाद एक प्रतिरक्षा जो यूवी विज़ और रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर एक अंशांकन वक्र के निर्माण के द्वारा संवेदनशीलता के लिए परीक्षण किया जा सकता है। परिणामों से संकेत मिलता है कि प्रतिरक्षा अन्य bioassays 13 के बराबर है - 17 जो पता लगाने सीमा ओ हैF 1 बजे। इतना ही नहीं रमन प्रतिरक्षा संवेदनशीलता अन्य bioassays के साथ प्रतिस्पर्धी है, यह के माध्यम से सुधार हुआ है संवेदनशीलता के लिए क्षमता है सतह बढ़ाया रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी (SERS)। SERS सोने के नैनोकणों या एक roughened सोने की सतह का उपयोग रमन उत्सर्जन बढ़ाने के लिए शामिल किया गया है। इस प्रोटोकॉल पहले से ही सोने-नैनोकणों जांच का उपयोग भी शामिल है, यह अच्छी तरह से एक SERS प्रतिरक्षा में विकास के लिए अनुकूल है। भविष्य में, इस तकनीक के लिए एक प्रकाश बिखरने प्रतिरक्षा है कि एक साथ कई प्रोटीन analytes का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के विकास के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। बायोमार्कर की रूपरेखा निदान और रोगों की एक विस्तृत विविधता के उपचार के लिए तेजी से महत्वपूर्ण हो जाता है, इस तकनीक को गहरा नैदानिक ​​आवेदन कर सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल के साथ जुड़े आम समस्याओं सोने के नैनोकणों के एकत्रीकरण, प्रोटीन अवरुद्ध, गैर विशिष्ट प्रोटीन के बंधन की अपर्याप्त बंधन, और एक कमजोर रमन संकेत शामिल हैं। ये समस्याएं हैंसमस्या और कार्रवाई कदम प्रत्येक समस्या का समाधान करने का संभावित कारण के साथ तालिका 2 में सूचीबद्ध है। अन्य समस्याओं प्रोटोकॉल की सीमाओं के कारण पैदा कर सकते हैं। सबसे पहले, इस प्रोटोकॉल AuNP सांद्रता तक 5 एक्स 10 से 12 कण / मिलीलीटर तक ही सीमित रूप में उच्च सांद्रता एकत्रीकरण का कारण बन जाते हैं। तकनीक nanoparticle सांद्रता के आकलन के लिए स्थिर, कुल योग नही किए नैनोकणों पर निर्भर करता है। अगर वहाँ एकत्रीकरण है, nanoparticle एकाग्रता के आकलन पक्षपातपूर्ण हो जाएगा। प्रोटोकॉल भी काफी मजबूत polystyrene पृष्ठभूमि पर काबू पाने की चोटियों के साथ रमन ने संवाददाताओं को सीमित करने के लिए और polystyrene से अद्वितीय हैं। अन्त में, पारंपरिक 96 अच्छी तरह से प्लेटों के उपयोग की सीमा प्रोटोकॉल प्लेटों की ऊंचाई के कारण एक औंधा रमन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। अन्यथा, एक कम बढ़ाई 96 अच्छी तरह से थाली ऊंचाई को समायोजित करने के लिए रमन खुर्दबीन उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

लक्षण संभावित कारण सुधारात्मक कार्रवाई
सोना नैनोकणों centrifugation और मेजबान के बाद कुल। रमन संवाददाता एकाग्रता बहुत अधिक है। रमन संवाददाता सांद्रता का एक सीमा परीक्षण खंड 2.2 या इस प्रोटोकॉल के रूप में निर्दिष्ट।
AuNP अनुपात करने के लिए एंटीबॉडी बहुत अधिक है। nanoparticle सतह के लिए बाध्य कण स्थिरता को बढ़ाने के PEGylated एंटीबॉडी की संख्या कम करें।
एमपीईजी-एसएच अवरुद्ध एजेंट AuNP सतह के लिए बाध्यकारी नहीं है। एमपीईजी-एसएच समाधान ताजा nanoparticle अवरुद्ध करने से पहले तैयार करें।
गैर विशिष्ट प्रतिरक्षा प्लेट की सतह के लिए बाध्य प्रतिरक्षा प्लेट अपर्याप्त अवरुद्ध है। समाधान ताजा प्रायर अवरुद्ध मज़ा थाली करने के लिए तैयारctionalization।
एमपीईजी-एसएच की आणविक वजन इतना बड़ा नहीं है। सुनिश्चित करें एमपीईजी-एसएच रोकने के लिए इस्तेमाल किया अणु 5000 केडीए या अधिक की एक आणविक भार है।
कमजोर या अनुपस्थित रमन संकेत रमन संवाददाता कण की सतह के लिए बाध्यकारी नहीं है। सुनिश्चित रमन संवाददाता PEGylated एंटीबॉडी के अलावा करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए बाध्य करने की अनुमति दी है।
एमपीईजी-एसएच की आणविक वजन इतना बड़ा नहीं है। सुनिश्चित करें कि nanoparticle कैपिंग एजेंट आयनिक रमन संवाददाता बाइंडिंग के लिए उचित आरोप है।

तालिका 2 आम समस्याओं के लिए समस्या निवारण। आम समस्याओं जुड़े कारणों और सुधारात्मक कार्रवाई की वस्तुओं के साथ प्रोटोकॉल के दौरान सामना की सूची।

इस पांडुलिपि में, हम एपी प्रस्तुत किया हैविश्लेषण के लिए एक nanoparticle जांच आधारित प्रतिरक्षा यूवी विज़ / रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करने का रिवाज निर्माण के लिए rotocol। प्रोटोकॉल रमन पत्रकारों और एक polystyrene प्लेट के लिए बाध्य एंटीजन का प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए इम्युनोग्लोबुलिन के साथ सोने के नैनोकणों के functionalization भी शामिल है। प्रोटोकॉल एक विशेष रमन रिपोर्टर और जुड़े उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के अनुरूप रूपांतरित किया जा सकता है। सोने nanoparticle आकृति और आकार भी बदला जा सकता है। हालांकि, बाध्यकारी nanoparticle आकार, आकृति, और निर्माता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल रमन संवाददाता के अनुसार अलग अलग होंगे उचित समाधान के लिए अनुपात। प्रोटोकॉल जब समाधान के अनुपात में प्रत्येक अनूठी व्यवस्था के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए के शोधकर्ताओं क्यू के लिए लिखा गया है और इस तरह के अनुसंधान की जरूरत के अनुसार कस्टम निर्माण के लिए अनुमति देते हैं। ठेठ फ्लोरोसेंट / वर्णमिति प्रतिरक्षा प्रोटोकॉल के विपरीत, इस प्रोटोकॉल के लिए अधिक से अधिक बहुसंकेतन क्षमताओं जबकि एक पूर्व मौजूदा बुनियादी ढांचे पर capitalizing के लिए क्षमता रखती है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 nm Gold Nanoparticle Ted Pella, Inc. 15708-6 These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter.
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Methanol Pharmco-Aaper 339000000
Tris Buffered Saline (10x) pH 7.5 Scy Tek TBD999
Bottle Top Filtration Unit VWR 97066-202
Tween 20 (polysorbate 20) Scy Tek TWN500 Used as an emulsifying agent for washing steps.
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate, pH 7.4 Scy Tek PBD999
Protein LoBind Tube 2.0 ml Eppendorf Tubes 22431102 LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes.
Protein LoBind Tube 0.5 ml Eppendorf Tubes 22431064 LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes.
Microplate Devices UniSeal GE Healthcare 7704-0001 Used for sealing and storing functionalized plates.
Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom Costar 3370
HPLC grade water Sigma Aldrich 270733-4L
3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) Sigma Aldrich 381306-250MG Raman reporter
mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 gram Laysan Bio, Inc. MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1 gram Laysan Bio, Inc. OPSS-PEG-SVA-5000-1g OPSS-PEG-SVA has an NHS end.
Mouse IgG, Whole Molecule Control Thermo Fisher Scientific 31903 Antigen
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody Thermo Fisher Scientific 31164 Antibody
Human Serum Albumin Blocking Solution Sigma Aldrich A1887-1G Bovine serum albumin can be used instead.
Mini Centrifuge Fisher Schientific 12-006-900
UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 2000c
UV-Vis Spectrophotometer BioTek Synergy 2
Desalting Columns Thermor Scientific 87766
In-house built 785 nm inverted Raman microscope unit N/A N/A An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used.

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References

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जैव रसायन अंक 117 रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रतिरक्षा polystyrene सोने nanoparticle जांच यूवी विज़ बहुसंकेतन
एक यूवी विज़ और रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी Immunoassay प्लेटफार्म fabricating
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Hanson, C., Israelsen, N. D.,… More

Hanson, C., Israelsen, N. D., Sieverts, M., Vargis, E. Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform. J. Vis. Exp. (117), e54795, doi:10.3791/54795 (2016).

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