Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Massen Histologie zu Quantifizieren Neurodegenerative Erkrankungen in Published: December 15, 2016 doi: 10.3791/54809
Automatic Translation
1, 1
1Oregon Institute of Occupational Health Sciences, Oregon Health & Sciences University

Summary

Drosophila ist weithin als ein Modellsystem verwendet , Neurodegeneration zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, mit dem Degeneration, wie durch Vakuolenbildung im Gehirn bestimmt wird, kann quantifiziert werden. Es minimiert auch die Auswirkungen aufgrund der Versuchsdurchführung durch die Verarbeitung und sectioning Kontroll- und Versuchs Fliegen wie eine Probe.

Abstract

Progressive neurodegenerative Krankheiten wie Alzheimer-Krankheit (AD) oder Parkinson-Krankheit (PD) sind weltweit eine zunehmende Bedrohung für die menschliche Gesundheit. Obwohl Säugetiermodelle wichtige Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen der Pathogenität zur Verfügung gestellt haben, begrenzen die Komplexität von Säugetiersystemen zusammen mit ihren hohen Kosten ihre Verwendung. Daher stellt die einfache , aber gut etablierte Drosophila - Modell-System eine Alternative für die molekularen Mechanismen zu untersuchen , die bei diesen Erkrankungen betroffen sind. Neben Verhaltensdefizite sind neurodegenerative Erkrankungen, die durch histologische Phänotypen wie neuronaler Tod und Axonopathie charakterisiert. Um neuronale Degeneration zu quantifizieren und zu bestimmen, wie sie durch genetische und Umweltfaktoren beeinflusst wird, verwenden wir einen histologischen Ansatz, der auf die Messung der Vakuolen in erwachsenen Fliege Gehirn basiert. Um die Auswirkungen der systematischen Fehler minimieren und direkt vergleichen Abschnitte von Steuerung und experimental Fliegen in einem Präparat, verwenden wir den 'Kragen' Methode für Paraffinschnitten. Neurodegeneration wird dann durch Messen der Größe und / oder Anzahl der Vakuolen beurteilt, die in der Flug Gehirn entwickelt haben. Dies kann entweder durch die Konzentration auf eine bestimmte Region von Interesse durchgeführt werden oder durch das gesamte Gehirn Analyse von Serienschnitten zu erhalten, die den gesamten Kopf erstrecken. Daher ermöglicht dieses Verfahren nicht nur eine schwere Degeneration zu messen, sondern auch relativ mild Phänotypen, die nur nachweisbar in einigen Abschnitten sind, wie während der normalen Alterung auftritt.

Introduction

Mit der Zunahme der Lebenserwartung haben neurodegenerative Krankheiten wie Alzheimer oder Parkinson eine zunehmende Gesundheitsbedrohung für die allgemeine Bevölkerung geworden. Nach Angaben der National Institutes of Health, 115 Millionen Menschen weltweit sind voraussichtlich von Demenz im Jahr 2050 betroffen sein Obwohl erhebliche Fortschritte für viele von ihnen bei der Identifizierung von Genen und Risikofaktoren beteiligt in zumindest einige dieser Krankheiten gemacht worden, die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch nicht bekannt oder nicht gut verstanden.

Einfache invertebrate Modellorganismen wie Caenorhabditis elegans und Drosophila melanogaster bieten eine Vielzahl von experimentellen Vorteile , die Mechanismen von neurodegenerativen Erkrankungen zu untersuchen, einschließlich eines kurzen Lebenszyklus, eine große Anzahl von Nachkommen, und die Verfügbarkeit von gut etablierten und manchmal einzigartigen genetischen und molekularen Methoden 1 -12. Weiterhin sind diese Organismen zugänglich unvoreingenommeneInteraktion Bildschirme, die Faktoren, die zu diesen Krankheiten, die durch ihre erschwerende oder lindernde Wirkung auf neurodegenerative Phänotypen identifizieren können.

Die Analyse solcher genetischer Interaktionen und Beurteilung Alterungseffekte erfordert quantitative Protokolle Neurodegeneration zu erkennen und deren Schweregrad zu messen. Diese Bewertung kann relativ einfach durchgeführt werden , wenn Verhaltensaspekte in Drosophila, wie olfaktorische Lernen, negativ geotaxis oder schnelle Phototaxis zu messen, die 13-21 einen numerischen Leistungswert. Es ist auch möglich, die Wirkungen auf das neuronale Überleben durch Zählen Neuronen zu bestimmen. Dies ist jedoch nur möglich , wenn auf einer bestimmten Population konzentrieren , die eindeutig identifizierbar sind , wie die dopaminergen Neuronen, die bei Parkinson betroffen sind, und selbst dann waren die Ergebnisse umstritten 22-24.

Das hier beschriebene Protokoll verwendet den Kragen Methode Paraffin Serienschnitte durchzuführen, ein Verfahrendas ursprünglich von Heisen und Böhl entwickelt, der es verwendet , um das Gehirn anatomisch Mutanten von Drosophila 25 isolieren. Die Verwendung des Kragens Methode wurde anschließend angepasst, in Kryoschnitten einschließlich Vibratom Abschnitte und Kunststoffprofile 26-28. Hier wird diese Methode Serienschnitte des gesamten Fliegenkopf zu erhalten , verwendet werden , die dann dazu verwendet werden kann , die Vakuolen zu messen , die 16,21,29-32 in Fliegen mit neurodegenerative Phänotypen zu entwickeln. Diese Messungen können in bestimmten Gehirnbereichen durchgeführt werden oder kann das gesamte Gehirn bedecken; der letztere Ansatz ermöglicht es, selbst schwache degenerative Phänotypen zu identifizieren, da während des Alterns beobachtet. Wenn schließlich der Kragen verwendet wird, kann bis zu 20 Fliegen wie einer Zubereitung verarbeitet werden, die nicht nur weniger zeitaufwendig, sondern ermöglicht auch die Analyse von Kontroll- und experimentellen Fliegen in der gleichen Zubereitung, Artefakte aufgrund von geringen Änderungen minimiert in die Vorbereitung.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Befestigung des Kopfes auf Krägen und Einbettung in Paraffin

Hinweis: Alle Schritte in dem Fixierungsprozess sollte in einem Abzug durchgeführt werden. Methylbenzoat, während kein gesundheitliches Risiko darstellen, hat einen sehr deutlichen Geruch, die überwältigend sein kann, wenn nicht in einem Abzug behandelt.

  1. Bevor die Fliegen anesthetizing, bilden 50 ml Carnoy-Lösung durch Zugabe von 15 ml Chloroform und 5 ml Eisessig auf 30 ml 99% Ethanol (nicht das Chloroform mischen und Essigsäure). Gießen Sie es in einem Glasbehälter mit einem flachen Boden, wie ein Kristallierschale, um sicherzustellen, dass die Kragen flach legen kann und vollständig von der Lösung bedeckt.
  2. Anesthetize die Fliegen mit CO 2 oder Äther.
  3. Thread Fliegen (bis zu 20 bei den meisten Krägen) durch den Hals in die Krägen mit einer Pinzette. Denken Sie daran , alle Köpfe in der gleichen Orientierung auszurichten, wie in 1A zu sehen ist , und sanft sein , um sicherzustellen , dass keine Beschädigung des Kopfes oder der Augen auftritt.
  4. Umfassen sine oculis Fliegen (Pfeile, 1A) an zufälligen Positionen so dass die Reihenfolge der Fliegen können leicht in den Abschnitten identifiziert werden. Darüber hinaus, wenn die experimentellen Fliegen einen hellen oder weißen Augenfarbe haben, Gewinde einige rote Augen Fliegen, wie Wildtyp, zwischen ihnen, dass genügend Pigment, um sicherzustellen, vorhanden ist, um die Folie zu färben. Notieren Sie sich die Reihenfolge der Fliegen auf einem Protokollblatt zusammen mit dem Bund Nummer, wenn mehr als ein Kragen verwendet wird.
  5. Sobald ein Kragen abgeschlossen ist, legen Sie sie in die vorbereitete Carnoy-Lösung für 3,5 - 4 Std.
  6. Dump die Carnoy-Lösung in den entsprechenden Entsorgungsbehälter und die Ethanol wäscht beginnen. Stellen Sie sicher, langsam zu gießen, um nicht die Platzierung der Krägen in dem Behälter zu stören.
  7. Waschen Sie die Kragen für 30 min in 99% Ethanol zweimal.
  8. Waschen Sie die Krägen in 100% Ethanol für 1 h. Achten Sie darauf, die Waschungen auf Zeit zu ändern overdehydration zu verhindern.
  9. Setzen Sie die Kragen in methylbenzoateO / N bei RT. Abdichten des Behälters mit Parafilm die Verdampfung des methylbenzoat zu verhindern.
  10. Gießen Sie die methylbenozate in die richtige Einwegbehälter in der Abzugshaube. Fügen Sie eine zuvor hergestellte Mischung von 1: 1 mit niedrigem Schmelzpunkt (56 - 57 ° C) Paraffinwachs und methylbenzoate. Von diesem Zeitpunkt an müssen die Kragen in einem Inkubator bei 65 ° C gehalten werden, um sicherzustellen, dass das Paraffin nicht aushärtet.
  11. Gießen Sie die methylbenozate und Paraffingemisch in die richtige Einwegbehälter, und gießen geschmolzene reine Paraffinwachs, gehalten bei 65 ° C, auf den Kragen.
  12. Ändern Sie das Paraffin nach 30 Minuten und wiederholen Sie diesen mindestens 5-mal. Mindestens 6 - 8 Waschungen durchgeführt werden sollte.
  13. Sobald die Waschungen abgeschlossen sind, legen Sie die Kragen in einen Gummieiswürfelschale mit Schlitzen in etwa die Größe der Kragen. Gießen geschmolzene Paraffin über sie, bis sie vollständig bedeckt und lassen Sie es O zu härten / N (versuchen Sie Luftblasen zu vermeiden).
  14. Entfernen Sie die Paraffinblöcke containing die Kragen aus dem Eiswürfelschale. Trennen Sie den Paraffinblock vom Kragen mit einer Rasierklinge, sanft den Kragen abbrach. Die Köpfe werden im Paraffinblock, während die Körper im Kragen bleiben. Die Blöcke können bei Raumtemperatur gehalten werden.
  15. Um die Kragen reinigen, genießen sie in einem deparafinization Mittel bei 65 ° C, um das Paraffin, sauber und mit Licht Wäsche zu entfernen und waschen in Ethanol vor der Wiederverwendung.

2. Sectioning und Montage

  1. Aufzuwärmen eine Heizplatte auf 50 ° C. Legen Sie die Objektträger (oder Metallmontageblöcke) und Rasierklingen auf der Platte und lassen Sie sie erwärmen.
  2. Je nach der gewünschten Ausrichtung zum Schneiden, befestigen den Block Paraffin entweder mit den Köpfen in Richtung der Seite (für horizontale Segmente) oder nach oben (zum frontalen Abschnitte) zu einem beheizten Befestigungsblock (kurz den Block an der Kontaktseite Schmelzen). Entfernen Sie den Block von der Heizplatte und lassen Sie es mindestens 10 mi abkühlenn, um sicherzustellen, dass das Paraffin für eine einwandfreie Abdichtung auf den Befestigungsblock genügend ausgehärtet ist. Halten Sie die Reihe der Köpfe parallel ausgerichtet mit der Oberfläche des Blocks so viel wie möglich Unebenheiten zu verhindern.
  3. Nehmen Sie eine Rasierklinge und schneiden Sie das überschüssige Paraffin weg von den Fliegenköpfen, so dass nur eine kleine Reihe mit den eingebetteten Köpfen bleibt (der Rasierklinge bis zum leichteren Trimmen erwärmt werden). Achten Sie darauf, nicht zu viel zu trimmen, so dass das Paraffin nicht während des Schneidens (mehr Trimmen kann während des Schneidens erfolgen) nicht bricht.
  4. Platzieren des Montageblocks in den Objekthalter des Mikrotoms und sicherzustellen, dass die Ausrichtung der Reihe von Köpfe möglichst parallel zu dem Rand der Klinge.
  5. Bereiten Sie Mikroskop-Objektträger, indem sie mit einer dünnen Schicht aus Poly-L-Lysin (PLL) Lösung abdeckt und lassen Sie sie für 5 Minuten trocknen lassen. Decken Sie sie mit Wasser kurz vor dem Gebrauch.
  6. Schneiden 7 um Abschnitte und übertragen das Band der Abschnitte mit dem Schlitten auf dem Wasser schwimmen. <br /> Hinweis: Um das gesamte Gehirn für horizontale Schnitte zu erhalten, sammeln wir das Band von beim Start in das Auge zu schneiden, bis der Kopf vollständig geschnitten wurde (von den Rüssel in das Gehirn schneiden). Mehr als eine Folie kann für den gesamten Kopf benötigt werden.
  7. Legen Sie die Folie auf einer Heizplatte bei 37 ° C und lassen Sie das Band für ca. 1 min zu erweitern.
  8. Entfernen Sie überschüssiges Wasser (Aus- oder mit einem Gewebe Gießen) und trocknen Sie die Dias O / N.
  9. Entfernen Sie das Paraffinwachs aus dem Schlitten durch die Folien in einem hohen, vertikalen Schiebe Färbeküvette mit einem deparafinization Mittel gefüllt platzieren (vollständig die Abschnitte abdeckt). Führen Sie 3 Waschungen von 30 min - 60 min je.
  10. Entfernen Sie die Folie aus der letzten Wäsche. Platz 2 Tropfen Einbettungsmittel auf die Folie und decken Sie es mit einem großen Deckglas.

3. Fotografieren und Analyse der Bereiche

  1. Lassen Sie die vorbereiteten Objektträger 1 zum Trocknen - 2 d. Dann untersuchen sie auf einem Fluoreszenz Microscope unter blauem Licht.
  2. Verwenden Sie eine niedrigere Vergrößerung der Ausrichtung der Fliegen zu bestimmen und die Region von Interesse zu finden, wenn auf eine bestimmte Region konzentrieren.
    HINWEIS: Für die sws Fliegen (siehe Abbildung 2), finden wir den Abschnitt, der die große Kommissur enthält und ein Bild nehmen ( in der Regel bei 40 - facher Vergrößerung). Wenn das gesamte Gehirn Analyse (wie in Abbildung 3), blättern wir durch alle Abschnitte aus einem Kopf und entweder fotografieren Sie den Abschnitt mit den schwersten Phänotyp oder alle Abschnitte , die Vakuolen zeigen.
  3. Für eine Doppelblind-Analyse nehmen und die Anzahl Bilder, ohne den Genotyp zu kennen und den Kragen Nummer und Position des Kopfes in der Reihe aufnehmen um sie später zu identifizieren.
  4. Sobald die Bilder aufgenommen wurden, analysieren sie eine Imaging-Software verwenden.
  5. Zählen Sie die Anzahl der Vakuolen pro Abschnitt oder pro Kopf. Um die Vakuole Größe messen, öffnen Sie die Bilder in einem Software-Programm und wählen Sie die Vakuolen mit einer Auswahl zul. Bestimmen die Anzahl der Pixel in der ausgewählten Vakuolen.
  6. Für die Umstellung auf & mgr; m 2, nehmen Sie ein Foto von einem Stufenmikrometer Kalibrierungsdia an der Vergrößerung für den Erwerb von Fotos verwendet. Bestimmung der Menge von Pixeln in 100 & mgr; m 2 einen Umrechnungsfaktor zu berechnen.
  7. Wandeln die Gesamtpixelzahl in & mgr; m 2 durch die Anzahl der Pixel mit dem Umrechnungsfaktor in dem obigen Schritt berechnet dividiert wird .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mit Hilfe der beschriebenen Methode führt in Serienschnitten durch das Auge Pigment gefärbt 33, die das gesamte Fliegenkopf umfassen. Ein Teil davon ist in 1B gezeigt, wobei die Abschnitte von einem einzelnen Kopf von oben nach unten dargestellt. Die Abschnitte aus verschiedenen Fliegen werden in diesem Beispiel nach rechts gesehen links. Zur Orientierung und Identifizierung der Fliegen zu erleichtern, ein eyeless fly (sine oculis) als Marker an Position 3 (Pfeil, 1B) eingesetzt ist .

Zur Quantifizierung der Neurodegeneration, messen wir die Bildung von Vakuolen, die in diesen Abschnitten erfaßt werden kann. Vakuolen sind als runde definiert, dunkle Flecken , die innerhalb des grün fluoreszierenden neuropil sind (Pfeilspitzen in Abbildung 2 und 3) oder Cortex und dass sind sichtbar in mindestens zwei aufeinanderfolgenden Abschnitten des Fliegengehirns. Quantifizieren von NeurodegenerationMessen Vakuolen kann entweder durch die Konzentration auf eine bestimmte Gehirnregion oder durch die Analyse des gesamten Gehirns durchgeführt werden. Begrenzen der Analyse auf einen bestimmten Bereich des Gehirns ist nützlich in Fällen , wo eine Mutation einer spezifischen Region wirkt sich nur, wie die Geruchskeulen in der futsch 'olk Mutante 34, aber es kann auch verwendet werden , wenn in allen schweren Degeneration ist oder viele Regionen des Gehirns. Ein Beispiel für letzteres ist der Schweizer Käse (sws) Mutante (Abbildung 2), wobei alle Vakuolen Messung wäre zu zeitaufwendig. Wir haben daher nur ein Bild , und um sicherzustellen , dass die Messungen immer auf der gleichen Ebene durchgeführt wurden, haben wir alle Bilder auf der Ebene der großen Kommissur (gc, 2A), die nur in einem oder zwei Abschnitten enthalten ist. Während wir nicht Vakuolenbildung 1 Fliegen 'in 1 Tage alten sws erkannt wurde (Daten nicht gezeigt), ein loss-of-function 35 Allel waren einige Vakuolen detektierbaren in 7 Tage alten sws '1 Fliegen (Pfeilspitzen, 2A). Altern erhöht die Fliegen 14 d (2B) und 21 d (2C) weiterhin diesen Phänotyp, seine progressive Natur zeigt. Zählen der Anzahl der Vakuolen in der deutocerebral Neuropil (dn), um die beschriebenen Verfahren bestätigt eine deutliche Steigerung in der Anzahl der Vakuolen mit dem Alter. Auch die kombinierte Fläche von Vakuolen umgriffen war signifikant mit der Alterung (2D) erhöht.

Allerdings sind nicht alle Mutanten zeigen eine solche schweren Phänotyp als SWS, und in diesen Fällen können Unterschiede in Degeneration sind schwierig zu bestimmen , wann auf eine kleine Fläche konzentriert. In ähnlicher Weise , dass die Degeneration während der Alterung auftritt , ist sehr mild (3A - C) und somit haben wir analysiert , das gesamte Gehirn , wenn diesen Phänotyp zu quantifizieren. Bestimmung der Summe aller Vakuolen im Gehirn ergabein signifikanter Anstieg mit dem Alter, und dies war auch der Fall , wenn die kombinierte Fläche dieser Vakuolen (3D) zu messen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Paraffin Serienschnitte. A) Mit dem Kragen Methode, experimentelle und Kontrollfliegen kann als eine Probe verarbeitet werden , indem sie auf einen Kragen Threading. Eyeless Sinus oculis Fliegen werden zur Orientierung (Pfeile) eingefügt. B) Schematische , die Orientierung der Fliegenköpfen in den Kragen zeigt. C) In diesem Bild Abschnitte aus verschiedenen fly Köpfe nach rechts auf der Folie orientiert gelassen. Von oben nach unten auf der Folie können Serienschnitte aus dem gleichen Fliegenkopf zu sehen. In diesem Fall wurde eine Sinus oculis fly an Position eingefügt drei (Pfeil). Die Abschnitte werden durch das fluoreszierende Auge Pigment gefärbt, die über die wäscht Abschnitte nach dem Schneiden. Maßstabsbalken in A = 5 mm und in C = 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Progressive Neurodegeneration im Schweizer-Käse Mutant. Paraffin Kopfteil aus 7-Tages- (A), 14-Tages- (B) und 21-Tages- (C) alt sws '1 Fliegen. Die Pfeilspitzen zeigen auf Vakuolen, die mit dem Altern entwickelt haben. Die altersbedingte Degeneration wird durch Zählen der Anzahl der Vakuolen quantifiziert und die Messung ihrer kombinierten Bereich (D). Die SEM und die Anzahl der analysierten Linie angezeigt. Der Maßstab = 25 & mgr; m. *** P <0,001.csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Neurodegeneration tritt mit dem Alter. Paraffin Kopfteil aus 10-Tages- (A), 30-Tages- (B) und 60-Tages- (C) alten Wildtyp - Fliegen. Die Pfeilspitzen weisen auf Vakuolen, die im Alter von Fliegen entwickelt haben. Die altersbedingte Degeneration wird durch Zählen der Anzahl der Vakuolen quantifiziert und die Messung ihrer kombinierten Bereich (D). Die SEM und die Anzahl der analysierten Linie angezeigt. Der Maßstab = 25 & mgr; m. *** P <0,001. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. </ A>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Das beschriebene Verfahren stellt ein Mittel Neurodegeneration im Gehirn von Drosophila zu quantifizieren. Während andere Methoden, wie einen spezifischen Zelltyp zu zählen, kann die Neurodegeneration zu identifizieren, verwendet werden, ist der Vorteil dieses Verfahrens, dass es im Allgemeinen angewendet werden kann. Zählen erfordert, dass Zellen können diese Zellen zuverlässig identifiziert werden unter Verwendung entweder eines spezifischen Antikörpers oder die Expression eines zellspezifischen Marker, der nicht immer verfügbar ist. Weiterhin hat es sich, die drastisch unterschiedliche Ergebnisse gezeigt , die Bedingungen für die Markierung verwendet wegen mit dieser Methode 24, vermutlich erhalten werden und für die Erkennung. Eine andere Methode, degenerierenden Zellen nachzuweisen ist die Verwendung von Zelltod Marker, wie anti-aktivierte Caspase 3. Dies ist jedoch nur Zellen identifiziert, aktiv Zelltod unterzogen und nachdem die Zellen abgestorben sind, sind sie nicht mehr nachweisbar. Ein weiterer Vorteil der hier vorgeschlagenen Verfahren ist, dass keine Färbung aufgrund der autoflu erforderlich istFluoreszenz durch das Auge Pigment verursacht wird, was Zeit spart und minimiert die durch Änderungen in den Färbebedingungen verursachten Artefakte. Es ist wichtig zu beachten, dass, wenn Sie diese Methode verwenden, um die Fliegen 'Augen genug Pigment haben die Folie zu färben. Wenn die Augenfarbe zu hell ist, das Hinzufügen einiger Wildtyp fliegt zum Kragen wäre ratsam, die ausreicht, um sicherzustellen, und auch über die Färbesystems. Ein zusätzlicher Vorteil dieses Verfahrens ist, dass mehrere Bereiche untersucht werden können, sogar in dem gleichen Kopf. Obwohl wir nicht die Daten zeigen, haben wir diese Abschnitte verwendet 30,36 Neurodegeneration in der Retina und Glia - Zellverlust in der Lamina Kortex zu untersuchen. Wie hier beschrieben, stellt dieses Verfahren horizontale Abschnitte, aber das Paraffinblock um 90 ° durch Drehen, wenn er auf dem Objektträger schmelzen, kann man auch Frontalschnitte erhalten. Somit ist dieses Verfahren ein vielseitiges Verfahren, das für die rechtzeitige und effiziente Messung von Neurodegeneration in der Flug Gehirn ermöglicht. Da die Bildung von vacuoles hat sich in vielen fly Modelle der menschlichen neurodegenerativen Krankheiten, einschließlich Modelle für AD, PD, Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), und Krankheiten , die durch Polyglutamin-Repeats 16,37-40 dieses Verfahren beobachtet können neurodegenerative Phänotypen zu quantifizieren , verwendet werden , in eine Vielzahl von Krankheitsmodellen.

Insgesamt ist dieses Protokoll einfach und leicht abgeschlossen, sobald die Ersteinrichtung des Gerätes durchgeführt wird. Einige Hinweise im Auge zu behalten sind sorgfältig die Ethanol wäscht zu Zeit über Austrocknung der Köpfe zu vermeiden, sorgfältig die Paraffinblöcke trimmen, um nicht Teile oder Köpfe zu verlieren, und das Band nicht zu overexpand auf dem Wasser, wenn der Schieber auf dem Wärmeblock. Wenn das Band zu weit ausdehnen kann, so kann der Fliegenköpfe Reißen führen und die Reihenfolge der Köpfe in dem Band verloren gehen. Zusätzlich zu dem Genotyp blind zu sein, während die Analysen zu tun ist wichtig, um Verzerrungen zu vermeiden. Dies wird am besten erreicht, indem eine Person mit der sli Vorbereitungdes und die Aufzeichnungen zu halten, während eine andere Person die Bilder nimmt und die Messungen zu tun. Eine der Beschränkungen dieses Verfahrens ist, dass Degeneration von nur wenigen Zellen sehr schwer zu erkennen. In diesem Fall würde ein bestimmter Fleck der betroffenen Zellpopulation informativer sein. Darüber hinaus ist dieses Verfahren nicht erlauben es zwischen verschiedenen Arten von Zelltod zu unterscheiden, die spezifischere Methoden, wie beispielsweise eine TUNEL-Färbung erfordert apoptotischen Zelltod zu bestimmen. Schließlich kann dieses Verfahren nicht zwischen Zelltod und axonale Degeneration unterscheiden, die auch nachweisbar als Vakuolen im Neuropil wäre.

Wie in unseren Ergebnissen gezeigt ist, kann dieses Verfahren verwendet werden Degeneration in spezifischen Gehirnbereichen oder im gesamten Gehirn zu adressieren. Unserer Erfahrung nach ist es sinnvoll, nur einen bestimmten Bereich zu analysieren, wenn der Phänotyp ist ziemlich stark, auch wenn alle Gehirnregionen betroffen sind. Dies reduziert die Arbeitsbelastung und wirkt sich nicht auf dieErgebnis. Wir analysierten ursprünglich mehrere Bereiche in der sws Mutante und beobachtet sehr ähnliche Ergebnisse in dem Fortschreiten des Phänotyps , wenn nur in einem Bereich zu vergleichen , und wenn alle Zonen analysiert (Daten nicht gezeigt). Es sollte jedoch angemerkt werden, dass eine eindeutig identifizierbare Region sollte Artefakte ausgewählt werden, um zu vermeiden, aufgrund der Analyse der verschiedenen Bereiche oder Zonen auf verschiedenen Ebenen.

Im Gegensatz dazu ist in Fällen, bei denen der Phänotyp relativ mild ist, ist es besser, den gesamten Gehirns zu analysieren, da die Wahrscheinlichkeit Vakuolen in einer bestimmten Region des Findens niedrig ist. Beispielsweise ist dies der Fall, wenn altersbedingten Neurodegeneration Bestimmen, wie in 3 gezeigt ist, was dazu führt, nur 4 - 5 Vakuolen im gesamten Gehirn in 60 Tage alte Fliegen. Wenn Vakuolen im gesamten Gehirn zu zählen, muss man berücksichtigen, dass die kleinen Vakuolen wird nur in einem Abschnitt angezeigt, während größere über mehrere Abschnitte erstreckt. Bei letzterem die unmittelbare Nähe von adjacent Abschnitte , wenn dieses Verfahren verwendet (Abbildung 1) bietet einen weiteren Vorteil, weil es relativ leicht ist , zu bestimmen , ob die gleiche Vakuole in mehreren Abschnitten vorhanden ist.

Zusammenfassend kann dieses Protokoll als nützlich erweisen , viele Drosophila Modelle verschiedener neurodegenerativen Krankheiten zu studieren. Die Identifizierung interagierender Proteine, die die degenerative Phänotyp lindern oder verschlimmern kann entscheidende Erkenntnisse über die zugrunde liegenden Mechanismen liefern, die Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson verursachen oder zu modifizieren. In dieser Publikation verwenden wir diese Methode Degeneration zu erkennen, die progressiv ist, wo die Tiere normalerweise entwickeln, sondern zeigen Degeneration Erhöhung während des Alterns. Zusätzlich kann dieses Verfahren auch Degeneration zu bestimmen, angepasst werden, die durch Entwicklungsfehler verursacht wird, die bereits in neu geschlüpften Fliegen vorhanden sein sollte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the Reagent/Equipment Company Catalog Number
Collar Genesee Scientific TS 48-100 We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html 
Rubber ice cube tray for embedding Household store The size can be made-to-fit by glueing in additional walls 
Crystallizing dish Fisher Scientific company 08-762-3
Ether Fisher Scientific Company E138-1
Ethanol Decon Laboratories Inc. 2701
Choloroform Fisher Scientific Company C298-500
Glacial Acetic Acid Fisher Scientific Company A38-212
Methylbenzoate Fisher Scientific Company M205-500 Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax Fisher Scientific Company T565 Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome Leica Biosystems Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide Fisher Scientific Company 12-550D
Microscope Cover Glass Fisher Scientific Company 12-545-M
SafeClear Fisher Scientific Company 314-629 Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover Ted Pella Inc.  432-1
Permount Fisher Scientific Company SP15-500
Poly-L-Lysine Solution (PLL) Sigma Life Science P8290-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Front Genet. 5, 279 (2014).
  2. Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).
  3. Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorder. Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).
  4. Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases. Chemistry Central Journal. 9, 65 (2015).
  5. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems. Hum Genet. 131, 535-563 (2012).
  6. Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila. Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).
  7. Konsolaki, M. Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila. Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).
  8. Kretzschmar, D. Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases. Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).
  9. Kretzschmar, D., et al. Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila. J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).
  10. Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).
  11. Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 8, (2013).
  12. Wentzell, J., Kretzschmar, D. Alzheimer's disease and tauopathy studies in flies and worms. Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).
  13. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. , (2011).
  14. Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. J Vis Exp. , e50339 (2013).
  15. Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. , (2015).
  16. Iijima, K., et al. Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila. PLoS One. 3, e1703 (2008).
  17. Krishnan, N., et al. Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants. Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).
  18. Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).
  19. Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila. Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).
  20. Ping, Y., et al. Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer's model. PLoS Genet. 11, e1005025 (2015).
  21. Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants. PLoS One. 10, e0145356 (2015).
  22. Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease. Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).
  23. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).
  24. Navarro, J. A., et al. Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson's disease in Drosophila. J Neurochem. 131, 369-382 (2014).
  25. Heisenberg, M., Böhl, K. Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means. Zeitschrift für Naturforschung C. 34, 143 (1979).
  26. Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. The Drosophila brain revisited by enhancer detection. J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).
  27. Lin, C. W., et al. Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome. J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).
  28. Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes. Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).
  29. Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3. J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).
  30. Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila. Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).
  31. Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration. PLoS One. 7, e44440 (2012).
  32. Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
  33. Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER. Hereditas. 46, 635-650 (1960).
  34. Bettencourt da Cruz, A., et al. Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila. Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).
  35. Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).
  36. Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).
  37. Davis, M. Y., et al. Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration. PLoS Genet. 12, e1005944 (2016).
  38. Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila. J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).
  39. Kretzschmar, D., et al. Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila. Glia. 49, 59-72 (2005).
  40. Li, Y., et al. A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).

Tags

Neuroscience Ausgabe 118 Neurobiologie degenerativen Erkrankungen Vakuolen Histologie Paraffinschnitte, Adulten Nervensystem
Massen Histologie zu Quantifizieren Neurodegenerative Erkrankungen in<em&gt; Drosophila</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sunderhaus, E. R., Kretzschmar, D.… More

Sunderhaus, E. R., Kretzschmar, D. Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila. J. Vis. Exp. (118), e54809, doi:10.3791/54809 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter