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Immunology and Infection

विकास और मानव न्युट्रोफिल व्युत्पन्न विशालकाय phagocytes के एक उपन्यास उप-जनसंख्या की पहचान Published: January 25, 2017 doi: 10.3791/54826
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1The Lloyd Rigler Sleep Apnea Research Laboratory, Unit of Anatomy and Cell Biology, The Ruth and Bruce Rappaport Faculty of Medicine, Technion-Israel Insitute of Technology

Summary

हम यहाँ प्राप्त करने और न्यूट्रोफिल व्युत्पन्न विशाल फ़ैगोसाइट की एक नव विशेषता उप-जनसंख्या की पहचान करने के लिए एक विधि का वर्णन है। इन कोशिकाओं को नए सिरे से मानव रक्त न्यूट्रोफिल से संस्कृति में विकसित करने, और phagocytosis, भोजी, बेहद बड़े आकार, और विस्तारित उम्र की विशेषता है। इस विधि के आगे इस अनूठी न्यूट्रोफिल व्युत्पन्न उप-जनसंख्या की जांच करने के लिए आवश्यक है।

Abstract

न्यूट्रोफिल (PMN) सबसे अच्छा रोगजनकों और सूक्ष्मजीवों पर हमले के खिलाफ उनकी phagocytic कार्यों के लिए जाना जाता है। वे ल्यूकोसाइट्स के बीच और उनके गैर सक्रिय राज्य में अनिवार्यता से apoptosis के लिए प्रतिबद्ध हैं कम से कम आधा जीवन है। जब सूजन को हल करने के लिए भड़काऊ साइटों के लिए भर्ती किया, वे शक्तिशाली रोगाणुरोधी हत्या के साथ साइटोटोक्सिक अणुओं की एक सरणी का उत्पादन। फिर भी, जब इन शक्तिशाली साइटोटोक्सिक अणुओं एक अनियंत्रित ढंग से जारी कर रहे हैं वे आसपास के ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकते हैं। हालांकि हाल के वर्षों में, न्यूट्रोफिल बहुमुखी प्रतिभा तेजी से plasticity और immunoregulatory कार्यों का प्रदर्शन इसका सबूत है। हमने हाल ही में एक नया न्यूट्रोफिल व्युत्पन्न उप-जनसंख्या है, जो इस तरह के granulocyte कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) के रूप में साइटोकिन्स / विकास कारकों के अलावा बिना मानक संस्कृति की स्थिति में अनायास विकसित / इंटरल्यूकिन (IL) -4 की पहचान की है। न्यूट्रोफिल अवशेष की उनकी क्षमताओं phagocytic काफी हद तक उनकी वृद्धि करने के लिए योगदानबेहद आकार; इसलिए वे करार दिया गया था विशाल फ़ैगोसाइट (Gφ)। न्यूट्रोफिल के विपरीत, Gφ लंबे संस्कृति में रहते हैं। वे भेदभाव (सीडी) न्युट्रोफिल मार्कर CD66b / CD63 / CD15 / CD11b / myeloperoxidase (एमपीओ) / न्युट्रोफिल इलास्टेज (पूर्वोत्तर) के क्लस्टर एक्सप्रेस, और / CD16 / CD163 और वृक्ष के समान CD1c / CD141 मार्कर monocytic वंश मार्कर CD14 से रहित हैं । उन्होंने यह भी ले अप लेटेक्स और zymosan, और opsonized-zymosan और पीएमए के साथ उत्तेजना को ऑक्सीडेटिव फट से जवाब। Gφ भी अभिव्यक्त मेहतर रिसेप्टर्स CD68 / CD36, और न्यूट्रोफिल के विपरीत, भली ऑक्सीकरण-कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (oxLDL)। इसके अलावा, ताजा न्यूट्रोफिल, या सुसंस्कृत monocytes के विपरीत, वे oxLDL तेज करने के लिए बढ़ प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के उत्पादन से जवाब। इसके अतिरिक्त, इन फ़ैगोसाइट, microtubule जुड़े प्रोटीन -1 प्रकाश श्रृंखला 3 बी (LC3B) लेपित रिक्तिकाएं शामिल भोजी की सक्रियता के संकेत मिलते हैं। विशिष्ट अवरोधकों का उपयोग करते हुए यह स्पष्ट है कि दोनों phagocytosis और भोजी prerequisi हैंउनके विकास और संभावना NADPH निर्भर आरओएस oxidase के लिए टीईएस। हम यहाँ संस्कृति में लंबे समय रहते, न्यूट्रोफिल व्युत्पन्न phagocytic कोशिकाओं, उनकी पहचान और उनके वर्तमान में जाना जाता विशेषताओं के इस नए उप-जनसंख्या की तैयारी के लिए एक विधि का वर्णन। इस प्रोटोकॉल प्राप्त करने और Gφ निस्र्पक क्रम में आगे उनके महत्व और कार्यों की जांच करने के लिए आवश्यक है।

Introduction

Polymorphonuclear न्यूट्रोफिल (PMN) रक्त में ल्यूकोसाइट्स की सबसे बड़ी आबादी का गठन, साइटोटोक्सिक अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला का निर्माण करके रोगजनकों पर हमले के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में सेवारत। परंपरागत दृष्टिकोण लंबे रक्त घूम, कम रहता है, पेशेवर फ़ैगोसाइट है, जो पहले रोगज़नक़ों और हानिकारक कणों की निकासी में संक्रमण और सहायता मुकाबला करने के लिए तीव्र भड़काऊ साइट्स के लिए आने के लिए कर रहे हैं की है कि कर दिया गया है। 1 उनके गैर सक्रिय राज्य में, न्यूट्रोफिल अनिवार्यता से apoptosis के लिए प्रतिबद्ध हैं। जब भड़काऊ साइटों को रक्त से पलायन, न्यूट्रोफिल सूजन को हल करने के लिए सक्रियण गुज़रना पड़ता है। वे phagocytose और सूक्ष्मजीवों हमलावर को मारने, ऐसे न्युट्रोफिल इलास्टेज (पूर्वोत्तर) और शक्तिशाली microbicidal गतिविधि के साथ cathepsins के रूप में साइटोटोक्सिक अणुओं के रूप में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस), अपघट्य एंजाइमों की एक सरणी का निर्माण करके। जाल रोगजनकों के लिए आदेश में, न्यूट्रोफिल भी कोशिकी जाल (जाल रिलीज) जो परमाणु क्रोमेटिन धागे जीवाणुरोधी पेप्टाइड्स और विभिन्न अपघट्य एंजाइमों युक्त से मिलकर बनता है। हालांकि, न्यूट्रोफिल से इन साइटोटोक्सिक अणुओं के अनियंत्रित रिलीज भी भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को बनाए रखने और आसपास के ऊतकों को नुकसान उत्पन्न हो सकता है। 2 इसलिए, मैक्रोफेज द्वारा एक प्रभावी apoptotic न्यूट्रोफिल की निकासी (Mφ) और वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) सूजन को हल करने के लिए महत्वपूर्ण है। 3, 4, 5, 6

हालांकि हाल के वर्षों में, यह तेजी से स्पष्ट है कि न्यूट्रोफिल अत्यधिक बहुमुखी कोशिकाओं, जिसका कार्य अब तक phagocytosis और रोगज़नक़ हत्या से परे जा रहे हैं बन गया है। 6, 7 भड़काना या सक्रियण के दौर से गुजर करके, न्यूट्रोफिल प्लास्टिसिटी धीरे-धीरे ध्यान प्राप्त कर रहा है। उदाहरण के लिए, बैक्टीरिया और माइक्रोबैक्टीरिया चुनौती दी न्यूट्रोफिल को दिखाया गयाइंटरल्यूकिन (IL) -10 छिपाना और भड़काऊ प्रतिक्रिया को नियंत्रित, इम्युनो-विनियामक प्रतिक्रियाओं की उपस्थिति का सुझाव दे। 8 बाद mitotic न्यूट्रोफिल को दिखाया गया Mφ कोशिकाओं की तरह, या पचाने और प्रतिजन टुकड़े पेश जब साइटोकिन्स और वृद्धि कारकों, 9, 10, इस प्रकार के साथ इलाज किया, सहज और अनुकूली को एकीकृत करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका की सेवा करके डीसी की तरह कोशिकाओं में ट्रांस-अलग पहचान हिमायती हैं। 3, 6 एक्टिवेशन विकास कारकों से apoptotic न्यूट्रोफिल या सेल मलबे, जिससे की घिराव पदोन्नत, भड़काऊ स्थलों पर मलबे की निकासी और सूजन का संकल्प, 3, 9, खासकर जब Mφ / डीसी निकासी की व्यवस्था, अपर्याप्त या अभिभूत है 11, 12 की सुविधा सुझाव संभावित 'आत्म नियमन' फिर से मदद करने के लिएभड़काऊ प्रतिक्रिया का समाधान। यह apoptosis के बाद से विनियमित आत्म-मृत्यु जो साइटोटोक्सिक यौगिकों के बाह्य रिहाई रोकना है और इस तरह आसपास के ऊतकों को चोट रोका जा सकता का एक रूप है। 6

लंबे समय तक जीवित रहने के न्युट्रोफिल सक्रियण की एक और विशेषता है और इस तरह granulocyte कॉलोनी उत्तेजक कारक (जी-सीएसएफ), granulocyte बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ), ऐसे इंटरफेरॉन के रूप में भड़काऊ साइटोकिन्स (के रूप में विभिन्न मेजबान ली गई कारकों के साथ इलाज के द्वारा प्रदर्शन किया गया IFN) -γ, ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (TNF) -α और / या रोगज़नक़ व्युत्पन्न उत्पादों, इस प्रकार, न्यूट्रोफिल अपने अस्तित्व प्रतिक्रिया मिलाना करने की इजाजत दी। 6 वास्तव में, न्युट्रोफिल अस्तित्व इसके plasticity के लिए एक शर्त है और phagocytosis प्रदर्शन करने की क्षमता के साथ जुड़े थे। 6, 13 तदनुसार, यह भी प्ररूपी और कार्यात्मक परिवर्तन जो निर्भरता के साथ संबद्ध करने के लिए दिखाया गया थानई न्यूट्रोफिल उम्र विस्तार में शामिल प्रोटीन के संश्लेषण उत्प्रेरण द्वारा upregulated जीन अभिव्यक्ति, और कम apoptosis पर देद। 10

न्यूट्रोफिल जो अल्पकालिक होते हैं और अनिवार्यता से संस्कृति में apoptosis से गुजरना है, या साइटोकिन्स / वृद्धि कारक सक्रिय न्यूट्रोफिल, ऊपर वर्णित है, जो जीवन काल बढ़ाया है के विपरीत, हम हाल ही में न्यूट्रोफिल का एक नया, छोटे उप-जनसंख्या है कि लंबे समय तक मानक संस्कृति में अनायास विकसित की पहचान की है बाह्य साइटोकिन्स या विकास के कारकों को जोड़ने के बिना हौसले से पृथक मानव रक्त न्यूट्रोफिल से की स्थिति। 14 ये न्यूट्रोफिल व्युत्पन्न कोशिकाओं है, जो साहित्य में वर्णित से पहले नहीं थे करार दिया गया था विशाल फ़ैगोसाइट (Gφ)। Gφ संस्कृति में उम्र बढ़ा दिया है, वे पूरी तरह से 5-7 दिनों के भीतर विकसित कर रहे हैं, और अद्वितीय रूपात्मक सुविधाओं, प्ररूपी अभिव्यक्ति और कार्यों की विशेषता है। वे बेहद autophago के कारण बढ़ा रहे हैंमृत न्यूट्रोफिल अवशेष, vacuolated की cytosis, और उसमें phagolysosomes। Gφ विशिष्ट न्यूट्रोफिल कणिकाओं मार्कर व्यक्त - भेदभाव (सीडी) 66B के क्लस्टर, azurophilic कणिकाओं मार्कर - CD63 और myeloperoxidase (एमपीओ) और ऐसे CD11b, पूर्वोत्तर, CD15, के रूप में अतिरिक्त न्यूट्रोफिल मार्कर NADPH oxidase सब यूनिटों gp91- phox और p22- phox, और भोजी मार्कर -LC3BII। 14, 15 कार्यात्मक, वे सक्रिय रूप से ले अप लेटेक्स माला और zymosan कणों, और zymosan और phorbol 12 myristate 13-एसीटेट (पीएमए) उत्तेजना के जवाब में आरओएस उत्पन्न करते हैं। दिलचस्प है, ताजा न्यूट्रोफिल के विपरीत, Gφ भी अधिकता मेहतर रिसेप्टर्स CD68 और CD36 एक्सप्रेस, ले अप कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (oxLDL) ऑक्सीकरण, और oxLDL साथ उत्तेजना के जवाब में आरओएस उत्पन्न करते हैं। इसके अतिरिक्त, Gφ monocytic वंश मार्कर CD14, CD16 और CD163 या वृक्ष के समान मार्कर CD1c और CD141 से रहित हैं। इसके अलावा, पीएचएgocytosis और भोजी की संभावना है और कार्यात्मक NADPH oxidase उनके विकास के लिए आवश्यक शर्तें हैं। इस के बाद से, phagocytosis-अवरोध cytochalsin बी, भोजी अवरोधकों 3-methyladenine (3-एमए) और bafilomycin (BafA1) और NADPH oxidase अवरोध - diphenylene iodonium (डीपीआई) - उनके विकास को रोका। इसके अतिरिक्त, monocytes / न्यूट्रोफिल सह संस्कृतियों के साथ ही उनके विकास में बाधा उत्पन्न रुक-रुक कर हाइपोक्सिया के लिए जोखिम है, जबकि निरंतर हाइपोक्सिया के लिए न्युट्रोफिल अनुकूलन स्पष्ट हो गया था। 14,15 संस्कृति में अपने सुझाव विकास वर्तमान पत्र में चित्रा 1 व्याप्ति प्रोटोकॉल में सचित्र है कदम से कदम से Gφ की तैयारी का वर्णन हौसले मानव रक्त न्यूट्रोफिल, उनके विकास, पहचान और कुछ बुनियादी विशेषताओं घूम अलग। इस प्रोटोकॉल के लिए और आगे की जांच और व्यापक स्पेक्ट्रम प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की भूमिकाओं इन नव वर्णित और पेचीदा न्यूट्रोफिल व्युत्पन्न क्रम में Gφ characteriz करने के लिएउनके महत्व और उनके संभावित कार्यों ई।

आकृति 1
चित्रा 1: 7 दिवस न्युट्रोफिल संस्कृति में विशाल कोशिकाओं के विकास की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। यह सुझाव दिया है कि भड़काऊ स्थलों पर (1) न्यूट्रोफिल apoptotic कोशिका मृत्यु से गुजरना है, और (2) रिहाई झिल्ली घेर लिया परमाणु मलबे, कणिकाओं (हरे और लाल डॉट्स) युक्त टुकड़े, और अन्य subcellular घटक जो भोजी तंत्र ट्रिगर। (3) विशाल फ़ैगोसाइट (Gφ), लंबी अवधि के न्यूट्रोफिल साइटोकिन्स या apoptotic निकायों और न्यूट्रोफिल मलबे internalizing द्वारा विकास के कारकों से रहित संस्कृतियों में विकसित जबकि बनाए रखने कार्यात्मक NADPH oxidase.They विभिन्न neutrophilic CD66b + / CD63 की विशेषता है + / एमपीओ + / CD15 + / CD11b + / पूर्वोत्तर मार्कर, बड़े कणिकाओं और सेल मलबे, और मेहतर रिसेप्टर्स CD36 और CD68 संलग्न phagosomes। जीबी1; ज्यादातर mononucleated कोशिकाओं, भी विभिन्न कणों और ऑक्सीकरण एलडीएल internalizing में सक्षम हैं और आरओएस उत्पन्न करते हैं। रिक्तिकाएं Gφ भरने की झिल्ली LC3B (गहरे नीले रंग में चिह्नित), autophagosomal झिल्ली के एक मार्कर होते हैं, भोजी और विशाल भक्षककोशिकीय गठन के बीच एक सख्त एसोसिएशन का सुझाव दे। Gφ जीएम- CSF / आईएल 4 युक्त मध्यम में विकसित नहीं है। इसके अलावा, इस तरह के NADPH oxidase अवरोध के रूप में अवरोधकों - diphenylene iodonium (डीपीआई), भोजी अवरोधकों 3-methyladenine (3-एमए) और bafilomycin (BafA1) और phagocytosis अवरोध cytochalasin बी (। Cyto बी) अपने गठन को समाप्त। (4) विवो में संभावित Gφ कार्यों विरोधी या समर्थक भड़काऊ गुणों और atherosclerotic प्रक्रियाओं में भागीदारी (यह आंकड़ा हमारे निष्कर्ष 14, 15 पर आधारित है और बी से साथ संपादकीय से संशोधित किया गया था शामिल हो सकते हैंerton 20)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Protocol

प्रोटोकॉल हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार स्थानीय मानवाधिकार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और सभी प्रतिभागियों को एक सूचित सहमति पत्र पर हस्ताक्षर किए।

1. न्युट्रोफिल अलगाव और संस्कृति में Gφ का विकास

नोट: सभी चरणों का एक जैव सुरक्षा लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ ऊतक ग्रेड lipopolysaccaride (LPS) मुक्त समाधान का उपयोग किया जाना चाहिए। रोसवेल पार्क स्मारक संस्थान (RPMI) -1640 मध्यम करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं, साइटोकिन्स या वृद्धि कारक न जोड़ें।

  1. एक बाँझ खोपड़ी नस सेट का उपयोग कर स्वस्थ युवा वयस्कों से कम से कम 40 मिलीलीटर रक्त शिराओं प्राप्त करते हैं। Vacutainer युक्त ethylenediamine टेट्रा एसिटिक एसिड कश्मीर 3 नमक ट्यूब (कश्मीर 3 EDTA) में रक्त ड्रा और धीरे मिश्रण। कमरे के तापमान पर खून रखें।
  2. 1.119 और 1.077 ग्राम / मिलीलीटर से कम दो कदम असंतत घनत्व polysucrose का उपयोग कर ढाल से न्यूट्रोफिल अलग। उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान के समाधान के लिए ले आओ।
    नोट: centrifugation के दौरान, लाल रक्तकोशिकाओं (लाल रक्त कोशिकाओं) polysucrose और तलछट तेजी से द्वारा एकत्रित कर रहे हैं। / -1077 इंटरफेस polysucrose, जबकि न्यूट्रोफिल polysucrose -1077 / 1119 इंटरफेस (देखें चित्र 2) में, सिर्फ लाल रक्त कोशिकाओं के ऊपर पाए जाते हैं mononuclear कोशिकाओं (monocytes / लिम्फोसाइट) ऊपरी प्लाज्मा के बीच पाया जाता है। इस विधि में एक ही व्यक्ति से mononuclear कोशिकाओं और न्यूट्रोफिल के एक साथ जुदाई की अनुमति देता है।

चित्र 2
चित्रा 2: मानव पूरे रक्त से न्युट्रोफिल अलगाव। एक 1.077 ग्राम में Polysucrose / एमएल ध्यान से एक असंतत ढाल के रूप में करने polysucrose-1.119 ग्राम / मिलीलीटर के शीर्ष पर स्तरित है। पतला पूरे रक्त तो polysucrose-1.077 के शीर्ष पर स्तरित है। नलियों तुरंत 700 XG पर ब्रेक के बिना कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए centrifugation के अधीन हैं। तीन अलग बैंड का उल्लेख किया जाता है। (ए) mononuclear कोशिकाओं, (बी) Polymorphonuclear कोशिकाओं (PMN),ट्यूब के नीचे और (सी) लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. एक 50 मिलीलीटर बाँझ polypropylene शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे करने के लिए 12 मिलीलीटर polysucrose-1119 जोड़ें।
  2. ध्यान से polysucrose -1119 पर polysucrose-1077 12 मिलीलीटर परत।
  3. आयन मुक्त फॉस्फेट बफर खारा के साथ एक अंतिम 24 मिलीलीटर रक्त की मात्रा (पीबीएस) 2% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम (HI-एफसीएस) युक्त करने के लिए 12 मिलीलीटर पूरे रक्त - 10 पतला। ध्यान से ट्यूब के ऊपरी ढाल पर पतला पूरे रक्त की 24 मिलीलीटर की परत।
  4. ब्रेक के बिना - (24 डिग्री सेल्सियस 20) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 700 XG पर अपकेंद्रित्र।
    नोट: कम तापमान पर centrifugation सेल clumping और गरीब वसूली में हो सकता है।
  5. ध्यान अपकेंद्रित्र से ट्यूबों को हटाने withouटी ढाल परेशान। दो अपारदर्शी परतों मनाया जाना चाहिए (ए: mononuclear कोशिकाओं और बी: PMN, चित्रा 2 में दिखाया गया है)।
  6. महाप्राण और इस परत से ऊपर परत ए स्थानांतरण (या त्यागने) 0.5 सेमी की कोशिकाओं के लिए तरल पदार्थ को त्यागने के लिए एक ट्यूब में चिह्नित "mononuclear"।
  7. महाप्राण और त्यागने परत बी से ऊपर 0.5 सेमी करने के लिए शेष तरल पदार्थ को एक ट्यूब लेबल "PMN" के लिए इस परत से कोशिकाओं स्थानांतरण।
  8. प्रत्येक दो ढाल ट्यूब से पूल PMN और पीबीएस युक्त 2% HI-एफसीएस 30 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा से धो लें। 200 XG पर 12 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला हटाने और त्यागें।
  9. लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) contaminating से छुटकारा पाने के लिए, जबकि धीरे 1 मिलीलीटर बाँझ pipet टिप के साथ में और बाहर ड्राइंग द्वारा गोली resuspending hypotonic 0.2% बर्फ के ठंडे बाँझ सोडियम क्लोराइड के 3 मिलीलीटर जोड़ें। 30 सेकंड के लिए बर्फ पर रखें।
  10. 30 एस के बाद, ट्यूब के लिए बाँझ 1.6% बर्फ के ठंडे NaCl के 3 मिलीलीटर जोड़कर isotonicity बहाल।
  11. isotonic खारा के 6 मिलीलीटर करने के लिए, 6 मीटर जोड़नेपूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) के एल RPMI 1640 मध्यम 12 मिनट के लिए 250 XG पर 2% HI-एफसीएस और सेंट्रीफ्यूज के साथ पूरक। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। PMN गोली आरबीसी संदूषण का साफ होना चाहिए।
    नोट: यदि आरबीसी से दूषित, PMN गोली लाल दिखाई देता है।
  12. कुछ दूषित आरबीसी रहते हैं, दोहराने 9 और 10 बार और अधिक कदम।
  13. 4 मिलीलीटर RPMI 1640 10% HI-एफसीएस के साथ पूरक में सेल गोली Resuspend और trypan नीले बहिष्कार से उनकी एकाग्रता और व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए कोशिकाओं की गिनती।
  14. 1.25 करने के लिए एकाग्रता समायोजित - 1.5 x 10 6 PMN / एमएल (प्रयोगात्मक जरूरतों पर निर्भर करता है), और थाली 1.0 एमएल / अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से थाली में।
    नोट: granulocyte जनसंख्या में न्यूट्रोफिल की पवित्रता हमेशा की तरह, 95% से अधिक के रूप में मई Grunewald-Giemsa धुंधला और प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन।
  15. बोने के बाद, एक में कोशिकाओं की जगह humidified 5% सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर।
  16. धीरे श्वास के आधे से हर 3 दिन मध्यम बदलेंमध्यम और 10% HI-एफसीएस के साथ पूरक ताजा RPMI 1640 मध्यम का एक ही मात्रा जोड़ने। उपयोग LPS मुक्त समाधान और यौगिकों और कम LPS स्तरों HI-एफसीएस में (0.05 एनजी / एमएल या कम)।
    नोट: एक सज्जन मध्यम परिवर्तन जरूरी है क्योंकि Gφ, जो संस्कृति में विकसित मजबूती संस्कृति पकवान और जोरदार धोने के लिए संलग्न नहीं करते भी विकसित कोशिकाओं बाहर धो सकता है। रक्त दाता के आधार पर, PMN संवर्धन के बाद 4 दिन - Gφ की उपस्थिति 3 पर ध्यान देने योग्य है। , संस्कृति में 7 दिन जब Gφ आकार में बहुत बड़े हैं - विश्लेषण और assays यहाँ वर्णित के अधिकांश 6 के बीच प्रदर्शन कर रहे हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि 1 के अलावा - RPMI 1640 मध्यम करने के लिए 10 एनजी / एमएल LPS संस्कृति में Gφ विकास को प्रभावित नहीं किया। 14

2. Confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर

  1. हौसले से पृथक न्यूट्रोफिल से cytospins 16 तैयार करें, और 7 दिन विकसित Gφ संस्कृतियों से(खंड 1 में तैयार)।
    नोट: विभिन्न विश्लेषण के लिए डिश में Gφ की एकाग्रता बढ़ाने के लिए, धीरे मध्यम के आधे हटा दें। सुनिश्चित करें कि Gφ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत मध्यम परीक्षण करके हटा माध्यम में पता नहीं कर रहे हैं। फिर, अधिकता को हल्के ढंग से पालन Gφ दूर करने के लिए शेष मध्यम pipet। 200 XG पर 10 मिनट के लिए मध्यम अपकेंद्रित्र, और 100 में गोली resuspend - 120 μl मध्यम।
    1. प्रत्येक स्लाइड के लिए कोशिकाओं से युक्त मध्यम के 120 μl - 100 का प्रयोग करें। प्रत्येक उपचार से डुप्लिकेट या तीन प्रतियों स्लाइड तैयार करें। पर 84 x जी 7 मिनट के लिए स्पिन।
  2. काता कोशिकाओं सूखी और एक रासायनिक हुड के तहत 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4% paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक। पीबीएस के साथ धो 3x (~ धोने प्रति कुछ सेकंड के लिए 100 μl)। intracellular धुंधला के लिए, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 0.5% ट्राइटन X-100 पीबीएस के साथ कोशिकाओं permeabilize और पीबीएस के साथ 5x धो लें।
    नोट: सभी स्तरों पर, उचित बफर / समाधान volu का उपयोगमेरे स्लाइड पर कोशिकाओं की परिधि को कवर करने के लिए। कोशिकाओं परिधि निर्धारित करने के लिए एक हाइड्रोफोबिक बाधा कलम का प्रयोग करें।
    सावधानी: Paraformaldehyde विषैला होता है। त्वचा और आंखों के संपर्क से बचाएं। उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
  3. RPMI 1640 मध्यम में 10% सामान्य बकरी सीरम के साथ ब्लॉक कोशिकाओं और 4 डिग्री सेल्सियस पर या 40 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रातोंरात सेते हैं। पीबीएस के साथ धो लें।
  4. 100 कमजोर पड़ने (~ 100 μl): एकल एंटीबॉडी (अब) या 1 पर माउस और खरगोश प्राथमिक एंटीबॉडी (पेट) के संयोजन के साथ सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर - (20 घंटा 18) रातोंरात सेते हैं।
    नोट: यहाँ, माउस मोनोक्लोनल पेट में शामिल हैं: विरोधी CD14, विरोधी CD63, विरोधी CD66b, विरोधी CD1c, विरोधी CD15, और विरोधी साइटोक्रोम बी-245 प्रकाश श्रृंखला (p22- phox पहचान)। खरगोश पॉलीक्लोनल पेट में शामिल हैं: विरोधी CD68, विरोधी CD36, विरोधी LC3B, विरोधी Myeloperoxidase, विरोधी न्युट्रोफिल इलास्टेज (NE) और विरोधी Nox2 / gp91- phox पेट। निर्धारण नियंत्रण शुद्ध माउस IgG1 और IgG2, और खरगोश आईजीजी शामिल थे। preparई निर्माता के निर्देशों के अनुसार पेट और कोशिकाओं की परिधि को कवर करने के लिए उचित मात्रा (लगभग 100 μl) का उपयोग करें।
  5. कोशिकाओं को धो लें और 1/400 माध्यमिक एंटीबॉडी Cy2-सीएफ (488A) संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (हरा) और साथ सेते / या Cy5 (सीएफ 647) संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी (लाल) 40 के लिए कमरे के तापमान पर मि।
    नोट: पेट पतला और निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार करते हैं।
  6. धोने के बाद, बढ़ते मध्यम, जिसमें 4 ', परमाणु धुंधला के लिए 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) की एक बूंद के साथ स्लाइड माउंट, तो तुरंत कवर पर्ची जगह है।
  7. एक confocal लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति खुर्दबीन और योजना ए पी ओ 40X विसर्जन के तेल उद्देश्य का उपयोग कर प्रणाली द्वारा स्लाइड का विश्लेषण। स्लाइड्स की तैयारी के बाद 30 2 घंटे के लिए मिनट के भीतर विश्लेषण प्रदर्शन या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखने के लिए।
    1. सेल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति तीव्रता एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर (जैसे छवि जम्मू) का उपयोग कर की गणना। सह स्थानीयकरण, योग्यता के लिएManders ओवरलैप गुणांक (एमओसी) 17 का उपयोग सॉफ्टवेयर द्वारा ntify।
      नोट: केवल MOC के साथ कोशिकाओं> 0.6 महत्वपूर्ण सह स्थानीयकरण के साथ कोशिकाओं के रूप में माना जा सकता है।

3. PMN की स्थानांतरगमन endothelial कोशिकाओं के उस पार: विशालकाय भक्षककोशिकीय पर आईएल -8 के प्रभाव (Gφ) गठन

नोट: उपयोग 24 अच्छी तरह से पारगम्य सेल संस्कृति सेल स्थानांतरगमन परख के लिए सम्मिलित करता है।

  1. कोट 50 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में 150 μl फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ डालने के ऊपरी सदन, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
  2. ऊपरी सदन में जोड़े 5 एक्स 10 4 EA.hy926 endothelial कोशिकाओं / अच्छी तरह से, तैयार की Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (पूरा मध्यम विकास) के 150 μl में resuspended।
    नोट: सुनिश्चित करें कि endothelial monolayer उपयोग करने से पहले मिला हुआ है।
  3. निचले सदन के लिए, पूरा मध्यम विकास के 700 μL जोड़ें।
  4. जगह पारगम्यसेल संस्कृति 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर क्लस्टर ट्रे और संस्कृति 2 दिनों के लिए EA.hy926 endothelial कोशिकाओं में सम्मिलित करता है।
    नोट: समानांतर में, दूसरे दिन ताजा PMN (खंड 1 में वर्णित) तैयार करते हैं।
  5. 2 दिनों के बाद, आवेषण के निचले और ऊपरी कक्षों में मध्यम जगह।
    1. निचले सदन के लिए, 50 एनएम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में RPMI 1640 मध्यम 10% IH-एफसीएस और इंटरल्यूकिन (IL) -8 के साथ पूरक जोड़ें। निचले कक्षों को नियंत्रित करने के आईएल -8 न जोड़ें।
    2. प्रत्येक ऊपरी सदन के लिए, 10% IH-एफसीएस के साथ पूरक RPMI 1640 माध्यम के 100 μl में 10 6 ताजा PMN जोड़ें।
  6. 90 मिनट के लिए 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर क्लस्टर ट्रे सेते हैं।
  7. 90 मिनट ऊष्मायन के बाद, अलग से ऊपरी से कोशिकाओं और निचले कक्षों को हटा दें और प्रत्येक उप-जनसंख्या गिनती। कुल कोशिकाओं का एक प्रतिशत के रूप में प्रत्येक कक्ष में एक्सप्रेस कोशिकाओं को जोड़ा।
    नोट: ध्यान से ऊपरी chamb से कोशिकाओं को हटानेएर आदेश endothelial कोशिकाओं को हटाने से बचने और एक बाँझ ट्यूब को हस्तांतरण करने के लिए धीरे pipetting द्वारा। pipetting और एक दूसरे बाँझ ट्यूब के लिए 500 μl और हस्तांतरण के साथ निचले सदन धोने से निचले सदन से कोशिकाओं निकालें।
  8. पूल 10 6 कोशिकाओं transmigrating (निचले सदन) और गैर-पलायन (ऊपरी सदन) PMN भिन्न और संस्कृति के विकास के कारकों के बिना 7 दिनों के लिए प्रत्येक के कई कुओं से चरणों में निर्दिष्ट के रूप में 14 - 16 (खंड 1)।
  9. स्लाइड 16 पर कोशिकाओं स्पिन और धारा 2 में वर्णित के रूप में confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्येक संस्कृति हालत में विकसित कोशिकाओं का विश्लेषण।

Representative Results

न्युट्रोफिल Autophagocytosis और विकास संस्कृति में

न्युट्रोफिल autophagocytosis और संस्कृति में 7 दिनों के भीतर Gφ में उनके विकास के आंकड़े 3 और 4 में दिखाया गया है। द्वारा दिन 4 - 7, उनके आकार, बेहद बढ़ा दिया गया है और 15 autophagosytosis के बाद 90 मिनट के रूप में जल्दी के रूप में स्पष्ट हो गया था सह संवर्धन फ्लोरोसेंट झिल्ली दाग (PKH-26, लाल; PKH-67, हरा) के साथ न्यूट्रोफिल। 14 इस न्यूट्रोफिल उप-जनसंख्या नियंत्रण के लिए एक के रूप में, कुछ न्यूट्रोफिल संस्कृतियों भी जीएम- CSF / आईएल -4 के साथ इलाज किया गया। संस्कृति में 14 दिनों के रूप में पहले से वर्णित - साइटोकाइन इलाज कोशिकाओं 7 भीतर आकार में वृद्धि हुई है। 18, 19, Gφ से छोटे थे और cytoplasmic अनुमानों कोशिकाओं (चित्रा 5) जैसी डीसी की तरह, जैसा कि पहले ख सूचना दी थी Y Oehler एट अल। 19 इसके अलावा, जीएम- CSF / आईएल 4 इलाज किया कोशिकाओं नकारात्मक रहे थे या एक कम CD66b अभिव्यक्ति थी, 15 स्पष्ट रूप से रूपात्मक और संभावित कार्यात्मक मतभेद प्रदर्शन के रूप में अच्छी तरह से।

चित्र तीन
चित्रा 3: संस्कृति में दिग्गज कंपनी को विकसित phagocytes (Gφ) में Autophagocytosis। हौसले से पृथक शुद्ध न्यूट्रोफिल PKH-67 (हरा) या शून्य समय में PKH-26 (लाल) झिल्ली फ्लोरोसेंट रंजक, और फिर सह सुसंस्कृत के साथ लेबल और सात दिन तक पीछा किया गया था। प्रकोष्ठों, कांच स्लाइड पर काता थे नाभिक DAPI के साथ दाग थे और नमूने confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया। Autophagocytosis पहले से ही सह संस्कृति के 90 मिनट के बाद ध्यान देने योग्य है। लाल और पीले और नारंगी रंग में हरे रंग के विलय के विकास Gφ में स्पष्ट रूप से स्पष्ट है।फ़ाइलें / ftp_upload / 54826 / 54826fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: संस्कृति में विशालकाय phagocytes (Gφ) का विकास। हौसले से पृथक शुद्ध न्यूट्रोफिल संस्कृति में 7 दिनों के लिए पीछा किया गया था। प्रकोष्ठों संकेत समय के अंतराल मई Grunewald-Giemsa साथ दाग पर कांच स्लाइड पर घूमती है, और एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ विश्लेषण किया गया। कुछ eosinophils के साथ एक व्यक्ति की तुलना के लिए प्रस्तुत किया है। ध्यान दें कि eosinophils के आकार संस्कृति में अपरिवर्तित रहता है। बढ़ाई 100X तेल। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: विशालकाय phagocytes (जी φ) और जीएम-सीएसएफ / आईएल के विकास संस्कृति में न्यूट्रोफिल इलाज के बीच तुलना। (ए) मई Grunwald-Giemsa दाग न्यूट्रोफिल के बिना (Gφ) सुसंस्कृत और जीएम-सीएसएफ के साथ / 7 दिनों के लिए आईएल 4। नमूने एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ विश्लेषण किया गया। बढ़ाई, X40। जीएम- CSF / आईएल 4 शो व्यापक cytoplasmic अनुमानों के साथ पूरक माध्यम के साथ संस्कृतियों में विकसित किया लेकिन कोशिकाओं Gφ से छोटे हैं। (बी) के हौसले से पृथक न्यूट्रोफिल साथ PKH-26 (लाल) डाई और सुसंस्कृत साइटोकाइन मुक्त माध्यम में 7 दिनों के लिए लेबल थे या जीएम- CSF / आईएल 4 के लिए के साथ पूरक माध्यम में साथ PKH-67 (हरा) डाई लेबल और सुसंस्कृत 7 दिन। 1 के अनुपात और सह-सुसंस्कृत 2 घंटे के लिए: फिर, विकसित कोशिकाओं को एक 1 में मिलाया गया। प्रकोष्ठों तय की और confocal माइकर द्वारा विश्लेषण किया गयाoscopy। यह आंकड़ा संदर्भ से संशोधित किया गया है। 15 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आगे Gφ विकास के पाठ्यक्रम की जांच के लिए, उनके शब्द के भागों परिवर्तन भी समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा किया गया था। वीडियो-1 (4 दिन के लिए 3 दिन) और वीडियो -2 (5 दिन के लिए 4 दिन) शुद्ध न्यूट्रोफिल संस्कृतियों में उनके विकास का प्रदर्शन। ये Gφ गैर पक्षपाती या हल्के सीमित आंदोलन क्षमता के साथ पक्षपाती और सक्रिय रूप से न्यूट्रोफिल अवशेष और मलबे आसपास निगलना कर रहे हैं। वीडियो-3 में, monocyte व्युत्पन्न Mφ और Gφ के आंदोलन को एक मिश्रित monocyte / न्युट्रोफिल संस्कृति में तुलना की जाती है। Mφ सक्रिय रूप से (बाएं, लेबल हटाया गया सेल) क्रॉल। Gφ (दाएं), उज्ज्वल PKH-26 लेबल सेल है।


वीडियो-1: - समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा 4 दिन 3 पर शुद्ध PMN संस्कृतियों में विशालकाय phagocytes के विकास को दर्शाता है। न्यूट्रोफिल बाद-4 थे दिन के लिए 3 दिन से संस्कृति में समय चूक microscopy.The समय चूक माइक्रोस्कोपी प्रणाली द्वारा उल्टे मोटर चालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप से बना है, और मंच इनक्यूबेटर पर एक उच्च संकल्प बी / डब्ल्यू सीसीडी कैमरा, एक साथ। समय चूक की छवि पर कब्जा अधिग्रहण हर 10 मिनट में लिया गया था। मूलतः संदर्भ 14 में प्रकाशित इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आकृति 1
वीडियो-2: - तिवारी द्वारा 5 दिन पर शुद्ध PMN संस्कृति में विशालकाय phagocytes के विकास को दर्शाता है 4मेरे चूक माइक्रोस्कोपी। न्यूट्रोफिल बाद-समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा 5 दिन के लिए 4 दिन से संस्कृति में किया गया। समय चूक माइक्रोस्कोपी प्रणाली चरण इनक्यूबेटर पर उल्टे मोटर चालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप से बना है, और एक उच्च संकल्प बी / डब्ल्यू सीसीडी कैमरा, एक साथ। समय चूक की छवि पर कब्जा अधिग्रहण हर 10 मिनट में लिया गया था। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आकृति 1
वीडियो-3: एक विशालकाय भक्षककोशिकीय और एक Macrophage सह संस्कृति में विकसित की है। Monocytes / न्यूट्रोफिल सह संस्कृति बाद-समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा 5 दिन के लिए 4 दिन से किया गया था। Monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बाएं); उज्ज्वल (PKH-26 दाग सेल) न्यूट्रोफिल व्युत्पन्न विशाल भक्षककोशिकीय (दाएं)। वीडियो के लिए समय चूक माइक्रोस्कोपी प्रणाली उल्टे मोटर चालित फ्लोरोसेंट माइकर से बना हैoscope, और एक उच्च संकल्प बी / डब्ल्यू सीसीडी कैमरा, चरण इनक्यूबेटर पर एक साथ। समय चूक की छवि पर कब्जा अधिग्रहण हर 10 मिनट में लिया गया था। मूलतः संदर्भ 14 में प्रकाशित इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

विशालकाय फ़ैगोसाइट में मार्करों की अभिव्यक्ति

Gφ की neutrophilic मूल निम्नलिखित न्युट्रोफिल मार्कर CD66b / CD63 / MPO / पूर्वोत्तर / CD15 (चित्रा 6) की सकारात्मक अभिव्यक्ति द्वारा सत्यापित किया गया था। Gφ भी NADPH oxidase, oxLDL मेहतर रिसेप्टर्स व्यक्त - CD68 और CD36, और निहित LC3B लेपित रिक्तिकाएं और समुच्चय (LC3BII 15 के रूप में पश्चिमी सोख्ता द्वारा की पहचान), एक भोजी मार्कर की उपस्थिति का प्रदर्शन है। हालांकि वे monocytic वंश (CD14, CD16 और CD163) और dendrit के लिए नकारात्मक रहे थेआईसी कोशिकाओं (CD1c और CD141) मार्कर, सुझाव है कि Gφ दूषित monocytes से नहीं उठता था।

चित्रा 6
चित्रा 6: संस्कृति में 7 दिनों के बाद न्यूट्रोफिल, विशालकाय phagocytes (Gφ) में monocytes और वृक्ष के समान कोशिकाओं के लिए विभिन्न मार्करों की अभिव्यक्ति। न्यूट्रोफिल विशिष्ट दाना मार्कर CD66b, azurophil कणिकाओं मार्कर CD63 और एमपीओ, न्यूट्रोफिल elastase और CD15 के सकारात्मक अभिव्यक्ति। वृक्ष के समान CD1c और CD141 मार्करों और monocytic वंश मार्कर CD14, CD16 और CD163 के लिए नकारात्मक अभिव्यक्ति। इसके अतिरिक्त, Gφ भोजी मार्कर LC3B व्यक्त की, मेहतर रिसेप्टर्स CD68 और CD36 और NADPH oxidase सब यूनिटों gp91-phox / P22-phox सब यूनिटों। नाभिक DAPI के साथ दाग थे, और नमूने confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया। यह आंकड़ा संदर्भों से संशोधित किया गया है। 14 p>, 15 यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

Gφ के कार्य - NADPH oxidase एक्टिवेशन, आरओएस उत्पादन और phagocytosis:

लेटेक्स मोतियों की phagocytosis और opsonized zymosan Gφ में स्पष्ट किया गया था। Gφ भी बेसल आरओएस (चित्रा 7A) उत्पन्न, और oxidative फट (चित्रा 7 बी-डी) द्वारा zymosan और पीएमए उत्तेजना को जवाब दिया। हालांकि, monocytes या न्यूट्रोफिल के विपरीत, Gφ आरओएस भी oxLDL उत्तेजना के जवाब में उत्पन्न होता है और तेल लाल हे (चित्रा 7 बी, एफ) द्वारा दाग रहे थे। ध्यान दें, NADPH oxidase अवरोध करनेवाला के साथ नए सिरे न्यूट्रोफिल के उपचार की - डीपीआई, न केवल आरओएस उत्पादन, लेकिन यह भी पी हिचकतेसंस्कृति में revented Gφ गठन, सुझाव है कि आरओएस सिगनल Gφ गठन के लिए आवश्यक है। 14, 15

चित्रा 7
चित्रा 7: ऑक्सीडेटिव फट, phagocytosis, और विशालकाय phagocytes द्वारा oxLDL तेज (Gφ)। (ए) बेसल आरओएस उत्पादन Gφ की लाइसोसोम में स्पष्ट है। (बी) के ऑक्सीकरण एलडीएल (oxLDL) के जवाब में आरओएस उत्पादन, पीएमए और zymosan (zymosan कणों स्पष्ट रूप से उल्लेख किया गया है)। (सी) Nitroblue tetrazolium (एनबीटी) Gφ में परीक्षण के बिना और पीएमए (स्लाइड बेदाग हैं, लेकिन सम्मिलित मई Grunwald-Giemsa साथ दाग रहे हैं) के साथ श्वसन फट गतिविधि दिखा। (डी) एनबीटी परीक्षण और मई Grunewald-Giemsa पीएमए और पीएमए / डीपीआई जो NADPH oxidase और आरओएस हिचकते साथ Gφ दाग। (ई) एल के phagocytosisATEX और PKH-26 (लाल) दाग कोशिकाओं में आईजीजी opsonized zymosan। इलाज और oxLDL में (एफ) तेल लाल हे धुंधला Gφ इलाज किया। यह आंकड़ा संदर्भों से संशोधित किया गया है। 14, 15 में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Endothelial कोशिकाओं के उस पार PMN की स्थानांतरगमन

आदेश में संभावित न्यूट्रोफिल उप आबादी कि Gφ में विकसित हो सकता है की पहचान करने के लिए, endothelial सेल monolayers के माध्यम से न्यूट्रोफिल के पलायन निर्धारित किया गया था (चित्रा 8A)। 90 मिनट के बाद, neutrophils के 62.3 ± 12.2% कम डिब्बे में आईएल -8 की ओर endothelial कोशिकाओं के माध्यम से transmigrated। ध्यान से, Gφ CD66b / CD15 / कोशिकाओं जो गैर पलायन न्यूट्रोफिल अंश से विकसित की है, जबकि neutrophils के transmigrated आबादी से ही विकसित LC3B के लिए सकारात्मक आकार में छोटे और neutrophilic मार्करों के लिए नकारात्मक रहे थे CD66b / CD15 (चित्रा 8B, 8) ।

आंकड़ा 8
8 चित्रा: आईएल -8 पर निर्भर PMN स्थानांतरगमन के प्रभाव पर विशाल भक्षककोशिकीय (Gφ) गठन Endothelial कोशिकाओं के माध्यम से। (ए) एक योजना आईएल -8 की ओर endothelial सेल monolayers (ईसीएस) के पार न्युट्रोफिल स्थानांतरगमन परख को दर्शाता हुआ। इस परख तीव्र भड़काऊ साइट्स के लिए न्यूट्रोफिल भर्ती के लिए एक मॉडल के रूप में माना जा सकता है। (बी - सी) सेल प्रवास परख (प्रोटोकॉल 3 में निर्दिष्ट) में, (बी) transmigrating और गैर-पलायन (सी) न्यूट्रोफिल इन्हींमाहौल (1 प्रोटोकॉल के रूप में) में वृद्धि कारकों के बिना सात दिनों के लिए सुसंस्कृत थे। फिर, कोशिकाओं गिलास स्लाइड पर घूमती है और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया। फिक्स्ड कोशिकाओं CD66b (लाल), LC3B (हरा) और CD15 (लाल) के लिए दाग रहे थे। नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग रहे थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

विशालकाय फ़ैगोसाइट (Gφ) न्यूट्रोफिल व्युत्पन्न कोशिकाओं ऐसे CD66b / CD15 / CD63 / MPO / पूर्वोत्तर के रूप में मौलिक और विशिष्ट neutrophilic मार्कर व्यक्त करने का एक नव परिभाषित उप-जनसंख्या कर रहे हैं। न्यूट्रोफिल व्युत्पन्न भक्षककोशिकीय के इस प्रकार के साहित्य में पहले वर्णित नहीं किया गया था। न्यूट्रोफिल कि अल्पकालिक होते हैं और apoptosis से गुजरना विपरीत, Gφ Annexin-V-नकारात्मक हैं और बढ़ाया उम्र प्रदर्शित करते हैं। फिर भी, न्यूट्रोफिल की तरह, Gφ भी कणों internalize और उन कणों को और पीएमए के जवाब में NADPH oxidase निर्भर आरओएस का उत्पादन। हालांकि, उनकी क्षमता OxLDL internalize और फलस्वरूप उत्पादन करने के लिए आरओएस Gφ की अनूठी विशेषताएं हैं। 14

कारकों की एक संख्या संस्कृति में उनके विकास को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। मध्यम विकास में बाहरी साइटोकिन्स या वृद्धि कारकों की कमी आवश्यक है (विशेष रूप से जीएम-सीएसएफ / आईएल 4)। हालांकि, आईएल -8 की ओर पलायन न्यूट्रोफिल उन है कि देव के बीच एक भेदभाव कारक साबित कर दियाGφ में भाग गई और उन है कि ऐसा नहीं किया। इसके अलावा, apoptotic न्यूट्रोफिल से उत्पन्न होने वाले मलबे के internalization, भोजी प्रोटीन (LC3B) और कार्यात्मक NADPH oxidase की अभिव्यक्ति, सभी उनके विकास के लिए जरूरी हो सकता है, के बाद से उनके निषेध Gφ गठन (चित्रा 1) को रोका दिखाया गया। जाहिर है, इन विशाल न्यूट्रोफिल से उत्पन्न होने वाली कोशिकाओं के विकास monocyte / बृहतभक्षककोशिका वंश में है कि निस्र्पक विशाल सेल के गठन से अलग है। विविध जीर्ण सूजन रोग, 20, 21 के साथ जुड़े बाद फार्म बहु nucleated विशाल कोशिकाओं जबकि neutrophilic Gφ यहाँ autophagocytosis के माध्यम से विकसित वर्णित है, सेल अवशेष छा द्वारा और ज्यादातर मोनो nucleated रहने के लिए अपने विकास के दौरान, 14 (शायद ही कभी लेकिन, कभी कभी एक दूसरे नाभिक मनाया जा सकता है)। इसके अलावा, नियंत्रण की एक संख्या में अपने neutrophilic मूल की स्थापना: (1) Expreविशिष्ट neutropilic मार्करों के ssion और वृक्ष के समान है और monocytic वंश मार्कर के अभाव, (2) monocytes में उनकी बाधा उत्पन्न विकास / PMN सह संस्कृतियों, (3) मैक्रोफेज (के रूप में लाइव सेल इमेजिंग और समय इसका सबूत से संस्कृति में आंदोलन की अपनी अलग पैटर्न -lapse माइक्रोस्कोपी), 14 (4) प्लास्टिक के बर्तन और (5) शुद्ध CD15 + / CD14 से उनके विकास के लिए उनके प्रकाश पालन - PMN प्रवाह cytometry द्वारा हासिल कर ली।

कार्यों में इन विट्रो पहचान से कुछ हमें विवो में अपनी क्षमता से कार्य करने के रूप में सुराग दे सकता है। एक भोजी प्रोटीन जो सहज प्रतिरक्षा संकेत दे रास्ते के साथ बातचीत के माध्यम से नियामक सूजन को कम करने के लिए योगदान देता है, 22 - - उदाहरण के लिए, Gφ की क्षमताओं न्यूट्रोफिल कणिकाओं और मलबे, बड़े रिक्तिकाएं की उपस्थिति, और अभिव्यक्ति LC3B की बड़ी मात्रा में उपभोग करने के लिए जो सभी के लिए समर्थन सफाई क्षमताओं। जैसे की, इन निष्कर्षों भी संकेत मिलता है कि Gφ भड़काऊ साइटों जहाँ Mφ / डीसी प्रणाली अपर्याप्त या अभिभूत है पर कार्य किया जा सकता है, और इस तरह सूजन के समाधान के लिए योगदान करते हैं। यह धारणा है कि इस तथ्य के मिश्रित monocyte / न्यूट्रोफिल संस्कृतियों में Gφ विकास प्रभावित होता है द्वारा समर्थित किया जा सकता है। 14 इसके अलावा, यह देखते हुए कि Gφ, oxLDL मेहतर रिसेप्टर्स (CD36, CD68) एक्सप्रेस oxLDL भली, और यह के जवाब में आरओएस उत्पादन, संकेत हो सकता है कि वे सूजन को हल करने atherosclerotic प्रक्रियाओं में शामिल रहे हैं। चूंकि Gφ केवल न्यूट्रोफिल जो आईएल -8 की ओर चले गए, और आईएल -8 तीव्र भड़काऊ साइट्स के लिए न्युट्रोफिल भर्ती का प्रतिनिधित्व करने की दिशा में endothelial monolayers भर न्यूट्रोफिल 'स्थानांतरगमन से विकसित की है, यह निष्कर्ष भी विरोधी भड़काऊ कार्यों का समर्थन कर सकता है। इसके विपरीत, कुछ भड़काऊ शर्तों में Gφ के प्रदर्शन को दाना घटकों और आरओएस का निर्वहन करने के लिए, इस प्रकार उन्हें सक्षम हो सकता है, प्रति के लिए योगदानsistent सूजन और ऊतकों को नुकसान। 20 हालांकि, कुल मिलाकर, उनकी क्षमताओं autophagic संकेत मिलता है कि Gφ संभावना भड़काऊ प्रतिक्रिया ह्रासमान के बजाय इसे बनाए रखने में शामिल हैं।

दिलचस्प बात यह है कि हम हाल ही में मानव atherosclerotic सजीले टुकड़े में Gφ की उपस्थिति की पहचान की है। (तैयारी में)। फिर भी, सवालों की एक बड़ी संख्या को सुलझाया जा रह है। उदाहरण के लिए, Gφ समर्थक या विरोधी भड़काऊ रहे हैं? कारक हैं जो इन विट्रो में या विवो में अपने गठन और समारोह का निर्धारण कर रहे हैं? जो विशिष्ट न्यूट्रोफिल उप-जनसंख्या उनकी अग्रदूत सेल कि Gφ में उनके विकास की सुविधा है? वे कुछ विकृतियों और जो के साथ जुड़े रहे हैं? सामूहिक रूप से, अपने मूल और संभावित कार्यों के रूप में दिलचस्प सवाल प्रस्तुत।

प्रोटोकॉल के भीतर हालांकि महत्वपूर्ण कदम और नुकसान को ध्यान में रखा जाना चाहिए। Gφ मैं के विकास में एक महत्वपूर्ण कदमएस संवर्धन साइटोकिन्स, वृद्धि कारक या एंटीबायोटिक दवाओं के माध्यम से रहित शुद्ध न्यूट्रोफिल। एक और महत्वपूर्ण कदम शासन से बाहर है कि Gφ दूषित monocytes से विकसित करने और Gφ की neutrophilic उत्पत्ति का पता लगाने के लिए है। मार्कर - इस प्रकार, असंतत ढाल से रक्त जुदाई के बाद, न्यूट्रोफिल आगे की शुद्धि के लिए एक अतिरिक्त कदम के प्रवाह से granulocyte gating और CD15 + / CD14 का उपयोग कर cytometry अधीन थे। विकसित Gφ न्यूट्रोफिल कि आगे जुदाई प्रवाह cytometry द्वारा शुद्ध कर रहे थे कि उन लोगों के शुद्धिकरण के इस कदम के अधीन नहीं किया गया से अलग नहीं किया था से प्राप्त की। इसलिए, प्रयोगों के सबसे अतिरिक्त सेल नुकसान के कारण शुद्धि के कदम प्रवाह cytometry के बिना आयोजित की गई। ध्यान से, कुछ दुर्लभ मामलों में कुछ eosinophils संस्कृति में नोट किया गया। उनके आकार संस्कृति अवधि के दौरान अपरिवर्तित रहे। हमें यह भी ध्यान रखना चाहिए कि यद्यपि वहाँ तरीकों में से एक नंबर रहे हैंमानव रक्त से न्यूट्रोफिल अलग होने के लिए, विधि यहाँ वर्णित केवल विधि हम कार्यरत है और इसलिए हम न्युट्रोफिल जुदाई के लिए उपलब्ध अन्य तरीकों से Gφ विकास की तुलना नहीं कर सकते हैं।

Gφ की जांच में एक प्रमुख ख़तरा विभिन्न जैव रासायनिक assays के लिए उपयुक्त शुद्ध Gφ आबादी के लिए पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए अक्षमता का परिणाम है। यह स्थिति हमारे प्रयोगों का आयोजन किया गया में मूल रूप से असंभव है। सबसे पहले, Gφ की उपज कम है। 1.0 x 10 6 से PMN वरीयता प्राप्त लगभग 100 - 200 से Gφ संस्कृति में सात दिनों के बाद विकसित करने, रक्त दाता पर निर्भर करता है। दूसरा, यह पल डिश में शेष न्यूट्रोफिल मलबे से संस्कृति में विकसित Gφ को अलग करने पर मूल रूप से मुश्किल है। इन सीमाओं यह व्यावहारिक रूप से असंभव जैव रासायनिक या आणविक जीव विज्ञान के तरीकों द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए बनाया है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल के प्रकाश का उपयोग करके Gφ पहचान और समारोह का वर्णन पर ध्यान केंद्रित किया हैऔर confocal माइक्रोस्कोपी। उनके रूपात्मक संस्कृति में Gφ में न्यूट्रोफिल से परिवर्तन भी लाइव सेल इमेजिंग और समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया। 14 जाहिर है, बहुत बड़ा रक्त की मात्रा में जैव रासायनिक या आणविक जीव विज्ञान के तरीकों को लागू करने और कम उपज प्राप्त काबू पाने के लिए आदेश और डिश में न्यूट्रोफिल 'मलबे से व्यवहार्य Gφ को अलग करने में जरूरत हो सकती है।

सारांश में, हम हाल ही में पहली बार के लिए Gφ के विकास संस्कृति में, का वर्णन किया है neutrophilic मूल के लंबे समय रहते फ़ैगोसाइट की एक उप-जनसंख्या। (Gφ की कम उपज संस्कृति में प्राप्त की और अक्षमता संस्कृति में न्यूट्रोफिल मलबे से विकसित Gφ अलग करने के लिए इसलिए, यह केवल विधि वर्तमान संस्कृति में Gφ प्राप्त करने के लिए उपलब्ध है, हालांकि दो प्रमुख सीमाओं से ऊपर उल्लेख दूर किया जाना चाहिए पकवान)। फिर भी, उनकी तैयारी और पहचान, इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किया, आवश्यक तत्व हैआदेश में आगे संभावित महत्व और Gφ के कार्यों की जांच करने में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं और न्युट्रोफिल जीव विज्ञान और plasticity में रुचि है, वैज्ञानिकों के लिए एल।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों confocal माइक्रोस्कोपी पढ़ाई के साथ उसकी अमूल्य मदद के लिए डॉ एडिथ सुश-टोबी धन्यवाद। इस अध्ययन Kamea कार्यक्रम (एलडी और एपी) के ढांचे के तहत आव्रजन अवशोषण के मंत्रालय और योजना के लिए समिति और उच्च शिक्षा के लिए परिषद के बजट से समर्थन किया था। हम भी आभार लेडी डेविस फाउंडेशन पोस्ट-डॉक्टरल रिसर्च फैलोशिप से रिसर्च फेलो (या) के समर्थन स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile scalp vein set (21GX3/4)  Bio Diagnostics Ltd. # 20080312 A strile needle for venipancture
VACUETTE HOLDEX Single-Use Holder PP Greiner Bio-One # 450263 For securing during venipuncture 
VACUETTE Tube K3E K3EDTA (16 x 100/9 mL) Greiner Bio-One # 455036 Sterile tube for blood collection
Nunclon MultiDish (24 well x 1 ml) Thermo Scientific # 142475
Polypropylene conical centrifuge tube (50 ml) Greiner Bio-One # E14103PJ
Transwell-24 well (transmigration assay) Corning # CA-3415 Polycarbonate membrane, 6.5 mm diameter, 3 μm pores) 
RPMI-1640 medium BioIndustries # 01-100-1A Do not add antibiotics  
EA.hy926 (ATCC CRL2922)   BioIndustries # CRL-2922
ATCC-formulated Dulbecco’s  Modified Eagle’s Medium BioIndustries # 302002 complete growth medium
Polysucrose - Histopaque1119 Sigma-Aldrich # 1119-1 Tissue culture grade
Polysucrose - Histopaque1077 Sigma-Aldrich # 1077-1 Tissue culture grade 
Phosphate buffered saline (PBS) - ion free BioIndustries # 02-023-1A Cell biology and molecular biology grade
Heat inactivated Fetal calf serum (HI-FCS) BioIndustries # 04-121-1B Cell biology grade or tissue culture grade, low LPS
NaCl Sigma # S3014 Molecular biology grade, suitable for cell culture
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Sciences # 15710 Cell bology grade or tissue culture grade (only 16% PFA)
Triton X-100 Sigma-Aldrich # 9002-93-1 Molecular biology grade 
Normal Goat Serum BioIndustries # 04-009-1 Cell biology and molecular biology grade
Trypan blue BioIndustries # 031021B Tissue culture grade 
May-Grünwald Sigma-Aldrich # MG500 Cell biology grade-(procedure No GS-10)
Giemsa stain Kit Sigma # 48900 Cell biololgy grade-(procedure No GS-10)
Fibronectin BioIndustries # 03090105
Human Interleukin-8 (CXCL8) PeproTech # 200-08-5
Anti-CD14 (clone 5A3B11B5) Santa Cruz Biotechnologies # sc-58951 Mouse IgG2b; expressed by  monocytes
Anti-CD63 (clone MX-49.129.5) Santa Cruz Biotechnologies # sc-5275 Mouse IgG1; expressed by neutrophils
Anti-CD66b (clone 80H3) AbD Serotec # MCA216 Mouse IgG1; expressed by neutrophils
Anti-CD1c (BDCA-1) (clone AD5-8E7) MACS Miltenyi Biotec # 130-090-695 Mouse IgG2a; expressed by  dendritic cells
Anti-CD15 (clone MY-1) Abcam # ab754 Mouse IgM; expressed by neutrophils
Anti-Cytochrome b-245 Light Chain (p22-phox) (clone 44.1) BioLegend # 650001 Mouse IgG2a; to recognize neutrophil NADPH oxidase complex
Anti-CD68 Protein Tech # 16192-1-AP Rabbit IgG; to recognize oxLDL scavenger receptor 
Anti-LC3B Sigma # L7543 Rabbit IgG 
Anti-Myeloperoxidase Abcam # ab45977 Rabbit IgG
Anti-Neutrophil elastase Calbiochem # 481001 Rabbit IgG 
Anti-NOX2 (gp91-phox) Abcam # ab131083 Rabbit IgG
Anti-CD36 (SR-B3) Novus Biologicals # NB400-144 Rabbit IgG
Purified Mouse IgG1, κ Isotype Control (clone MG1-45) BioLegend # 401401 Antibody used as isotype control
Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control (clone MOPC-173) BioLegend # 400263 Antibody used as isotype control
Normal rabbit IgG Santa Cruz Biotechnologies # sc-2027 Antibody used as isotype control
CF488A Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Biotium  # 20012 Anti-Rabbit IgG with the green fluorescent dye CF488A
CF647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Biotium  # 20043 Anti-Rabbit IgG with the red fluorescent dye CF647
CF488A Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Biotium  # 20010 Anti-Mouse IgG with the green fluorescent dye CF488A
CF647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Biotium  # 20040 Anti-Mouse IgG with the red fluorescent dye CF647
Fluorescent Mounting Medium with DAPI Vectashield H-1000; Vector Lab Inc. # E19-18 Nuclear staining
Confocal laser scanning microscope (LSM 700)    Carl Zeiss Ser.# 3523000380 Plan Apo 40X immersion oil objective  
Zeiss CLSM software (ZEN 2010) Carl Zeiss MicroImaging GmbH version 6.0 For colocalization analysis
ImageJ software Wayne Rasband, NIH, USA version 1.49k For determination of cell  areas and fluorescence intensity
Light microscope (Axiovert 25) Carl Zeiss Ser.# 201060153 Examination of cells in culture
Centrifuge (Megafuge 1.0 R) Heraeus Instruments # D-37520 Cells separation from blood; cytospins preparation
Inverted fluorescent microscope (Zeiss Axio Observer Z.1) Carl Zeiss Ser.# 3834001470 Demonstration of giant phagocytes development
Temperature-controlled incubation system (Cube&Box) Life Imaging Services Temperature control system for microscopes
High resolution digital CCD camera (AxioCam HRm) Carl Zeiss Ser.# 117090279 For capturing high-contrast  image data from an examined cell objects
Hydrophobic barrier pen (Elite PAP Pen) Diagnostic Biosystems # K039 For defining cell perimeter for immunoflourescence staining

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 119 न्युट्रोफिल व्युत्पन्न विशाल फ़ैगोसाइट मानव न्यूट्रोफिल भेदभाव (सीडी) 66B microtubule जुड़े प्रोटीन -1 प्रकाश श्रृंखला 3 बी (LC3B) autophagocytosis के क्लस्टर ऑक्सीकरण कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (oxLDL) मेहतर रिसेप्टर्स confocal माइक्रोस्कोपी
विकास और मानव न्युट्रोफिल व्युत्पन्न विशालकाय phagocytes के एक उपन्यास उप-जनसंख्या की पहचान<em&gt; इन विट्रो</em
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Lavie, L., Dyugovskaya, L.,… More

Lavie, L., Dyugovskaya, L., Polyakov, A., Rogovoy, O., Leder, E. Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro. J. Vis. Exp. (119), e54826, doi:10.3791/54826 (2017).

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