Summary
内皮细胞线粒体是维持血脑屏障完整性的关键。我们引入一个协议来测量脑血管内皮细胞生物能量的功能。
Abstract
血 - 脑屏障（BBB）的完整性是关键的，以防止脑损伤。脑血管内皮（CVE）细胞是包含血脑屏障的细胞类型中的一种;这些细胞具有非常高的能量需求，这需要最佳线粒体功能。在疾病或损伤的情况下，在这些细胞中的线粒体功能可以被改变，从而导致疾病或血脑屏障的开口。在这个手稿中，我们将介绍使用的整体，完整的细胞和生物分析仪测量CVE细胞线粒体功能的方法。一个三刀应力测定是用来挑战已经被扰动，物理或化学的细胞，并评估其生物能量的功能。此外，这种方法还提供了筛选具有对线粒体功能的直接影响新的治疗剂的有用方法。我们优化所需的细胞密度，以产生氧消耗速率，其允许多种线粒体段的计算平方米，包括ATP的产生，最大的呼吸和备用容量。我们还通过证明引入微小RNA中，miR-34a的，导致线粒体活性显和检测到的降低表明该测定的灵敏度。而在本文中示出的数据是针对bEnd.3细胞系的优化，我们还进行了优化初级CVE细胞协议，进一步表明在临床前和临床模型的效用。
Introduction
人们普遍认识到，通过脑血管的内皮（CVE）细胞所形成的血 - 脑屏障（BBB）具有极为重要的血管生物学非常不同和独特的功能。这些内皮细胞使用线粒体生成最三磷酸腺苷的细胞供应（ATP）的化学能量源。除了用于CVE细胞中提供的ATP，线粒体调节在血管内皮细胞，如细胞信号1-4的各种细胞过程，细胞凋亡5，和细胞周期控制和细胞生长6。在CVE细胞线粒体生物能量功能的失调可能影响线粒体生物合成，从而导致受损血管内皮活性，并加剧脑血管疾病和神经变性疾病， 如中风7,8和阿尔茨海默氏病（AD）9。我们已经表明，暴露于lipopolysac侮辱CVE细胞charide（LPS）损害的CVE细胞线粒体功能和恶化中风成果7。叔丁基氢醌（TBHQ）通过在CVE电池10的氧化磷酸化的干扰增加中风的死亡率。因此，生物能量功能的CVE细胞不仅导频用于中枢神经系统的一系列机制相关的研究（CNS）的疾病的定量模型，而且还提供了在治疗中血管生物学靶向线粒体功能的药物筛选的一个突破。
分离线粒体已被用来测量生物能的功能。我们7和其他11个通过使用外通量生物分析报告完整CVE细胞生物能量的细胞的评估。该分析仪提供了内源性细胞生物能量评估的优势。这个敏感和一致的测定测量CVE细胞的线粒体代谢和可用于评估由STI生物能障碍木里，调查线粒体信号通路的影响在CVE细胞线粒体功能的机制，和屏幕药物或治疗。耗氧率（OCR）是通过使用药理分析方法相结合，使用四个线粒体干扰生物分析仪记录：寡，羰基氰化物-4（三氟甲氧基）苯腙（FCCP），鱼藤酮，抗霉素和A.在该协议中，我们详细的优化方法，使该测量和CVE细胞线粒体机能参数，包括基底线粒体呼吸，ATP产生，质子泄漏，最大呼吸，和备用呼吸容量的计算，在一个单一的检测。
Protocol
注：该协议的方案示于图1，其中包括的步骤的时间表。
1.文化和CVE细胞通道
- 培养CVE细胞（bEnd.3细胞）在完全生长培养基（高葡萄糖的Dulbecco改良的Eagle氏培养基，DMEM）中补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素的T75厘米2组织培养烧瓶中。在一个5％CO 2培养箱生长于37℃。
- 卸下并丢弃细胞培养基。冲洗用0.25％胰蛋白酶0.03％的EDTA溶液的细胞层，然后添加1 - 2毫升胰蛋白酶-EDTA溶液到烧瓶中，并保持该烧瓶在37℃，3 - 5分钟。观察的倒置显微镜下细胞直至细胞层被分离。加入10 mL的完全生长培养基中，并轻轻吹打吸出细胞。
- 滗流体和细胞进入有15毫升离心管中并旋转，在700×g离心5分钟，除去细胞碎片。 丢弃从离心管的上清液。加入10 mL的完全生长培养基中，并重新悬浮细胞沉淀。旋转细胞在700×g离心5分钟。
- 丢弃从离心管的上清液。重悬在完全生长培养基将细胞沉淀在2.0×10 5个细胞/ mL的浓度（通过使用血细胞计数器计数测定;可以通过台盼蓝染色排除死细胞）。
注：新鲜解冻细胞对于至少3个通道用于实验亚培养。
在细胞培养板2.种子和细胞治疗
- 上的96孔细胞外磁通细胞培养板的种子细胞：80微升/孔。放置在37℃的细胞培养板在5％CO 2的培养箱中。注：每孔16×10 3个细胞将达到60 - 24小时内80％汇合。
- 如果在细胞被暴露于化学，添加处理一旦将细胞附着在板的底部（8 - 24小时后看到鼎）。
注：对于转染实验中，不完全生长培养基中添加抗生素。
3.线粒体功能的评价使用生物分析仪
- 前测定的开始，通过加入外磁通校准溶液的150微升到板，并在37℃下无CO 2的孵育O / N水合的一个细胞外磁通传感器盒与校准。
- 使用洗板站，细胞培养基改变成pH为7.0的细胞外磁通测定培养基。孵育在37℃的细胞无CO 2的30 - 60分钟。
- 准备8μM寡，4.5微米FCCP，10μM鱼藤酮，并在10 DMEMμM抗霉素A的工作方案。装载25μL储备液成盒注射端口：端口A，寡;端口B，FCCP;端口C，鱼藤酮和抗霉素A与细胞外通量分析网上平台。如表1中所述实施分析方案。
- 加载水合盒插入生物分析仪，并通过单击“开始”按钮进行校准。校准完成后，取出硒鼓底板，然后通过单击“卸载磁带”的提示加载单元板。继续试验直至所有测量的结束。
- 打开数据文件并获得生物分析仪的速度值。将数据导出到电子表格文件。
4.数据分析
注：数据分析的计算如下制定。作为OCR 图2中呈现的值是从生物分析仪获得的。
- 为了计算基础呼吸 ，减去非线粒体呼吸（测量10 - 12）从基础值（测量3）。
注：基础呼吸=基础 - 非线粒体呼吸=率③ - 费率⑩⑫〜。 - 为了计算ATP生产图片上，减去的ATP联呼吸（测量4 - 6）从基值（测定3）。
注：ATP生产=基础 - ATP挂钩呼吸=率③ - ④率⑥〜。 - 要计算最大呼吸 ，减去非线粒体呼吸（测量10 - 12）最大呼吸（测量7 - 9）。
注：最大呼吸=最大呼吸 - 非线粒体呼吸=率⑦〜⑨ - 费率⑩⑫〜。 - 要计算余力 ，减去最大呼吸基础值（测量3）（测量7 - 9）。
注：备用容量=最大呼吸 - 基底=率⑦〜⑨ - 率③。 - 计算质子泄漏 ，减去非线粒体呼吸（测定10 - 12）从ATP联呼吸（测定4）。
注：质子漏= ATP挂钩呼吸 - 非线粒体升呼吸率=④ - 费率⑩⑫〜。
Representative Results
评估响应于氧化应激CVE细胞的生物能量函数，我们选择了鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3，其显示相同的屏障特性如原发性脑微血管内皮细胞12。鉴于动力学和响应的相对强度是在各种细胞类型中改变，第一系列的实验中，设计通过识别在测定代谢分析使用bEnd.3细胞的最佳数量，以获得可测的OCR的水平，显示在图2.继评估，数据被量化，并在图3中。基础呼吸，最大呼吸呈现，和备用呼吸容量显示出与细胞密度的比例响应。然而，当选择了每孔64×10 3个细胞的ATP产量下降，这表明在汇合细胞培养物是不适合于该实验。最优细胞密度发生8之间-每孔的细胞的32×10 3个的基础上，响应于线粒体干扰。
对于随后的实验，每孔16×10 3个细胞的接种密度被用来允许在OCR变化的最佳检测。用每孔16×10 3个细胞，我们观察到在OCR所期望的响应，并表明微RNA的miR-34a的减少CVE细胞线粒体功能（ 图4）。我们以前曾报道了miR-34a的在这些细胞中13减少氧化磷酸化。重复实验还表明，最大呼吸和备用容量由在的CVE的miR-34a的表达在24小时后转染显著下降，即使基础呼吸，ATP产生，和质子漏无显著变化（ 图4） 。这些数据证明生物分析仪的灵敏度来检测的CVE中线粒体功能的变化。
图1.战略规划实验。时间线为单元，板和墨盒准备指示。 请点击此处查看该图的放大版本。
在CVE细胞不同的细胞密度测量图2. CVE生物能细胞功能的各种细胞密度的代表性原始数据。耗氧率。数据代表平均值±标准差（n = 5）; OCR：耗氧率; FCCP：羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙;腐/防答：鱼藤酮和抗霉素A.①，②，③和基础注明呼吸; ④，⑤，⑥和ATP注明链接呼吸; ⑦，⑧，⑨和最高指示呼吸; ⑩，⑪，⑫和指示非线粒体呼吸。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.在用各种细胞密度CVE细胞生物能功能的代表结果。基底呼吸，ATP产生，最大呼吸，和备用容量是从由生物能产生的原始数据计算出的图使用公式2功能测定在第4所示。数据代表平均值±标准差（n = 5）; OCR：耗氧率。 F =“http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg”目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
图4：受miR-34a的生物能降低功能代表性的成果 （A）以下24小时后转染的miR-34a的表达线粒体功能的原始数据。 （B）的基础呼吸，ATP产生，最大呼吸，和备用容量是从由生物能在图4A功能测定法产生的原始数据计算;该参数是由在第4节的miR-34a的表达所指示的公式来计算减少了在24小时后转染CVE细胞线粒体功能。数据代表平均值±标准差（n = 5）; OCR：耗氧率。 ****，P <0.0001。文件/ ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
表1仪器运行协议。
Discussion
该协议代表了脑血管内皮细胞的生物能量表型的评估的方法。它用作用于内皮细胞线粒体评价基本分析，它是最佳的设计，调查刺激可能影响在CVE细胞线粒体信号传导途径的机制的实验。它也提供了用于测试可能的治疗剂为BBB-破坏相关疾病的方法。
该议定书中的关键步骤
胞磁通bioanalyzers必须测量的OCR实时能力。在该测定中，确定适当的细胞密度是至关重要的。如果细胞密度低于每孔8×10 3个细胞，基底OCR太低待分析（ 图2和图3）;如果细胞密度高于每孔32×10 3个细胞，该细胞不响应寡或FCCP treatmeNTS（ 图2和图3）。在我们的实验模型，该细胞系的最佳细胞密度为每孔，这表明复制的结果和敏感性刺激7和治疗10,14 16×10 3细胞。如果使用24孔生物分析仪，细胞密度的新滴定将需要用于测定。
据记载，的CVE具有大的体积线粒体与其它内皮细胞或组织类型15,16相比，表明更大的能源生产和更少的细胞，用于测量生物能量代谢的需要。我们已经测试了几种类型的脑内皮细胞，如初级和永生化的鼠脑的内皮细胞7和永生化人脑内皮细胞（未公布的数据）。要求这些细胞相似的细胞密度40内达到可接受的OCR（基础呼吸OCR - 160皮摩尔/分钟96孔板和50 - 400皮摩尔/ 24孔板分钟）时，进行的生物能学测定法。 Kaczara 等报道测量生物能量代谢中的人脐静脉内皮细胞（HUVEC），它使用了更高的细胞密度17。
我们的团队没有评估来自其他组织或器官血管细胞。从理论上讲，该生物分析仪可能被在任何细胞类型使用，但它需要优化细胞密度，细胞培养基，和培养条件（某些特定的细胞可能需要涂层板生长良好）测定。它要求该实验完成，以确保OCR率在可接受的范围之内。如果OCR在从其它器官的内皮细胞比从大脑的CVE下，增加细胞密度可以帮助到可接受的OCR的范围内得到。另外，如果电池不使用氧化磷酸化作为其主要能源，生物分析仪不会是一个最优升检测。
生物分析仪允许电子传递链的连续中断，基于在施加试剂的顺序。首先，寡被应用，其抑制线粒体复合物V（ATP合酶）。第二，FCCP，电子解偶联剂被施加，这导致质子梯度的干扰。最后，鱼藤酮和抗霉素A，其抑制线粒体复合物I和III分别被施加到导致电子流的总抑制。药物暴露的顺序是必要的，因为该药物阻断的特定电子传输链反应，和顺序的变化可以被测量以反映线粒体功能。
修改和故障排除
以评估线粒体响应在CVE细胞对刺激，则建议的刺激被（见时间轴施加到细胞后的细胞粘附到细胞培养板底部在图1中示出;它通常需要至少6小时）。由处理获得可复制的结果，以保持细胞密度一致是非常重要的。如果预处理之前将细胞接种设计的，对于每个前处理细胞密度应仔细测量，但不包括用于播种的死细胞。如果转染是包含在实验设计，请参照制造商提供的转染方案。在图4给出的数据证明中，miR-34a的转染到使用脂质体转染试剂盒，这要求无抗生素的细胞培养基和丝裂应力测试用miR-34a的表达，以评估在代谢功能的变化CVE细胞。质粒的剂量也可以被优化，如先前发表13。可以对协议进行另一个变化是改变试剂的浓度。寡，FCCP，和/或鱼藤酮和抗霉素A的滴定曲线可以完井特德。
此外，如果各种药物该测定被用于高通量分析，建议包含一个平行试验，以测量细胞生存力和细胞增殖，这是在我们以前的出版物7,13-说明。 OCR的值由细胞数目（ 图2和3）显著的影响，并在细胞增殖和活力测定法中获益的数据的正常化。然而，这些试验的完成是在每个单独的实验室的判断。
该技术的局限性
这个协议的主要限制是，我们仅仅在研究中使用的体外细胞培养物模型。目前，没有可用的体外模型或动物模型可针对内皮细胞的线粒体功能。预期新的模型生物能量函数的体内评估待开发和 另一个限制是继生物能措施的障碍评估的扩展。因为，首先，将生物能量测量完成后，细胞存活率减弱的电子传递链的完整的中断不能进行的实验;第二，需要特定的细胞培养板和插入检测生物能量值，不适合障碍评估插入。因此，没有能生物能学分析后可以完成很多功能分析。然而，可以预期的特殊装置，可开发来执行前的生物能测定功能测定。 关于到现有/替代方法的技术意义 先前的技术来评价线粒体功能必要线粒体的分离从细胞18。该网元使用生物分析仪W¯¯技术允许完整细胞线粒体活性，它保留超过评估分离线粒体细胞环境的测量。 掌握这一技术后，未来的应用方向或 该协议被设计和用于bEnd.3细胞系开发的，但它也与初级脑血管内皮（pCVE）细胞7或其他内皮兼容，我们已经在我们以前使用pCVE电池7出版物表明了这一点。当使用其他类型的内皮细胞的，可能需要在培养板的涂布和使用的生长因子。然而，滴定试验被推荐用于其它细胞类型为好。这个协议提供了在CVE细胞的生物能学的评价将要通过通常的方法，它可以进一步施加到机构的研究或以这种方式治疗反应。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bEnd.3 cell line | ATCC | CRL-2299 | 25 - 30 passages |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450 | 10% final concentration |
| Penicillin/Steptomycin | Hyclone | SV30010 | 1×100 stocking |
| 0.25% trypsin, 0.03% EDTA solution | Corning | 25-053-CI | |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-CI | 1.0 µM final concentration |
| Glucose | Sigma | CAS 50-99-7 | 25 mM final concentration |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | 1.0 µM final concentration |
| Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | 0.5 µM final concentration |
| Rotenone | Sigma | R8875 | 1.0 µM final concentration |
| Antimycin A | Sigma | CAS 1397-94-0 | 1.0 µM final concentration |
| Plate wash station | Seahorse Bioscience | ||
| Extracellular flux bioanayzer | Seahorse Bioscience | XFe96 | |
| Extracellular flux cell culture plate | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
| Extracellular flux sensor cartridge | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
| Extracellular flux calibrant solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| Extracellular flux assay medium | Seahorse Bioscience | 102365-100 | PH buffered prior to assay |
References
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