Introduction
Перенос генов и белков на микро-организменном уровне играет центральную роль в выживаемости бактерий и эволюции, а также инфекционных процессов. Обмен ДНК между бактериями или между бактерией и клеткой может быть достигнуто с помощью трансформации, конъюгации или вектором трансдукции. 1,2 Сопряжение уникальна по сравнению с трансформацией и трансдукции в том , что при конъюгации между грамотрицательных бактерий , таких как кишечная палочка, перенос ДНК происходит в донорной-контролируемым способом , посредством которого комплекс макромолекулярная система соединяет донора и реципиента клетки. Сопряжение также самый прямой путь, в котором бактериальные клетки взаимодействуют с клетками-хозяевами, чтобы ввести гены, белки или химические вещества, чтобы хост-системах. 3 Довольно часто, передача таких агентов имеет замечательные эффекты на хозяина, начиная от патогенеза и канцерогенеза провести эволюцию и адаптацию. Было показано, что конъюгативная recombinatioп увеличивает скорость адаптации в 3 раза у бактерий с высоким уровнем мутаций в условиях экологического стресса. 4 Кроме того, конъюгация на сегодняшний день является наиболее распространенным путем , через который гены устойчивости к антибиотикам в бактериальных штаммов рассредоточены. 5,6
Микроорганизмы развивались специализированные системы секреции для поддержки передачи макромолекул через клеточные мембраны; Есть в настоящее время 9 типов систем секреции (ЦСС) в грамотрицательных бактерий, которые были описаны: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, а также Sec (секреции) и Tat (два-Аргинин транслокации) пути. 7,8 Каждый тип системы секреции дополнительно делится на различные подтипы, необходимость из - за разнообразия белков и своеобразия путей , участвующих в различных бактериальных штаммов. Например, в системе секреции IV типа (T4SS), системы Ti и CAG облегчают эффекторной транспорт в то время как F-плазмиды, Р27й pKM101 T4SSs облегчают передачу конъюгативной плазмиды. 7,9,10 Детальное понимание механизмов , с помощью которых организмы собирают свои системы секреции из их составных белков и разделяют клеточное содержимое с получателем или их окружающей среды является важным фактором в развитии целевых стратегий борьбы с патогенными микроорганизмами и процессы клеточная инфекция.
После первоначальной идентификации конъюгации бактерий в E.coli путем Ледербергом & Tatum, 11 большое количество мобильных и конъюгативных плазмид были идентифицированы и охарактеризованы. 12 Такие мобильные плазмид показывают значительный диапазон размеров (от 1 до более чем 200 т.п.н. (КБ)), однако все мобильные плазмиды содержат relaxase, признающей происхождение передачи (ОРИТ) , тем самым позволяя передачу плазмиды. Конъюгативных плазмид дополнительные гены кодируют для сборки функционального T4SS, а также типIV соединительный белок. 12 Например, 100 кб F плазмиды E.coli , кодирует все конъюгативных гены в пределах 33,3 кБ передачи (TRA) области. 13 Гены ТНС области плазмиды закодировать F все белки , которые способствуют образованию фимбриевый, присоединительными образования пар (MPF), перенос ДНК и функции исключения во время конъюгативного переноса плазмиды. 10,14,15 Значительный объем знаний доступен для конъюгативной T4SSs, однако подробно Структурные исследования конъюгативных белков и комплексов только в последнее время становятся доступными. 16 - 28
Для того, чтобы собрать полное представление о конъюгативной процесса, соединительное детальных структурных исследований для мутационный анализ конъюгативных белков переноса требуется. Это может быть достигнуто с помощью конъюгативных сопрягаемых анализов. Для получения плазмиды F, каждый белок , кодируемый в пределах области тра играет определенную роль в F-опосредованного соnjugation; поэтому, нокаута / удаление гена переноса отменит конъюгативных способность клетки (рисунок 1). В то время как более мелкие мобильные Плазмиды являются более благоприятными для стандартных процедур, удаление, для больших конъюгативных плазмид, таких как F, нокаут гена более легко достигается с помощью гомологичной рекомбинации, где ген-мишень заменен одним передать отчетливое ген устойчивости к антибиотику. В текущем протоколе, мы используем гомологичной рекомбинации, чтобы заменить ген переноса интереса с хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) в 55 кб F плазмиды производное pOX38-Tc; 29,30 результирующая Нокаут плазмиду pOX38-Tc Δgene :: Cm, способствует устойчивости к наличию хлорамфеникола (Cm) в ростовой среде. Донорские клетки, несущие pOX38-Tc Δgene :: Cm не могут влиять на конъюгативного переноса ДНК / спаривание, как наблюдаемое за счет использования пробирного сопрягаемой; эффективность спаривание донора клетки pOX38-Tc Δgene :: Cm и нормальный Recipнике, будет уменьшаться или, чаще, быть отменена. Конъюгативных перенос плазмиды pOX38-Tc Δgene :: Cm может быть восстановлен с помощью небольшой плазмиды восстановления укрывает целевого гена переноса. Это восстановление плазмида может быть тот , который обеспечивает конститутивную экспрессию, такой как плазмида pK184 (pK184-гена), 31 или тот , который обеспечивает индуцируемой экспрессии до тех пор , как плазмида правильно ориентирована ген на правильное расположение внутри клетки (цитоплазме или периплазмы). Следовательно, в брачных анализах между этим новым донором (укрывательство pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184-гена плазмид) и клетку-реципиент, эффективность спаривание, как ожидается, восстановление до почти у нормального донора и реципиента сопрягаемой анализа. Эта система дает возможность исследовать функцию выбиты гена через поколение серии pK184-генных конструкций (делеции или точечные мутации) и тестирование способности каждой конструкции, чтобы восстановить брачный потенциал укрывательство pOX38-Tc Δgene :: Cm донор клетокs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение ДНК-конструктов
- Проектирование олигомеров для гомологичной рекомбинации гена - мишени
- Конструкция одного 55-72 п.н. вперед олигомера следующим образом: (а) получить длинную последовательность нуклеотидов 19-32 п.н., которая является гомологичной последовательности ДНК, в область 10-100 п.н. выше стартового сайта 5'-гена хлорамфеникол-ацетилтрансферазы в коммерческой плазмиды pBAD33, 32 и (б) выбор 36-54 пар оснований нуклеотидов , гомологичную а в области 10-150 пар оснований ниже по течению от сайта инициации 5' - гена - мишени интерес.
- Присоединяйтесь к 'концу нуклеотидной последовательности определена (б) 5' 3-й конец нуклеотидной последовательности определена (а), что дает одну длинную 55-72 вперед олигомера.
- Разработка единого олигомер обратного 55-72 б.п. следующим образом: (а) получить длинную последовательность нуклеотидов 19-32 п.н., которая является гомологичной последовательности ДНК в области 10-100 б.п. вниз по течениюиз 3'-конца гена хлорамфеникол в коммерческой плазмиды pBAD33, и (б) выбрать 36-54 п.н. нуклеотидную последовательность, гомологичную области в пределах 10-150 пар оснований против хода транскрипции от 3'-концевого участка гена-мишени представляющего интерес ,
- Присоединяйтесь к 'концу нуклеотидной последовательности определена (б) 5' 3-й конец нуклеотидной последовательности определена (а), чтобы сделать его один олигомер.
- Скопируйте этот олигомер в любое доступное программное обеспечение биоинформатики и преобразовать последовательность в ее обратной комплементарной. Это даст единственный 55-72 п.н. обратный олигомера.
- Используя любую доступную программу олиго-анализатор, убедитесь , что рекомбинация олигомеры имеют содержание GC между 40-60%, температура плавления низкая шпилька (Т м), низкой само- и гетеро-димеризации Тпл 's. Заказ праймеров для синтеза и отгрузки из любой предпочтительной компании биотехнологии.
- Конструкция одного 55-72 п.н. вперед олигомера следующим образом: (а) получить длинную последовательность нуклеотидов 19-32 п.н., которая является гомологичной последовательности ДНК, в область 10-100 п.н. выше стартового сайта 5'-гена хлорамфеникол-ацетилтрансферазы в коммерческой плазмиды pBAD33, 32 и (б) выбор 36-54 пар оснований нуклеотидов , гомологичную а в области 10-150 пар оснований ниже по течению от сайта инициации 5' - гена - мишени интерес.
- Усиление CAT кассеты из pBAD33 (Cm R
- Вырастить в течение ночи (O / N, 16-18 ч) культуры клеток DH5 & alpha, несущих плазмиду pBAD33 в стерильной лизогении бульона (LB) с 20 мкг / мл хлорамфеникола (см) при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту и температуре 37 ° С.
- Центрифуга 6-8 мл культуры O / N при комнатной температуре, 5000 мкг в течение 3 мин. Слейте супернатант и извлечения плазмиды pBAD33 из гранул с использованием плазмиды мини-Prep Kit (Материалы таблицу) и протокол производителя.
- У дайджеста плазмидной ДНК pBAD33 добавлением следующей строки в стерильную пробирку в указанном порядке: соответствующий объем бидистиллированной воды (DDH 2 O) до конечного объема 50 мкл, объем 1 мкг pBAD33 плазмиды, 5 мкл 10х фермент реакционный буфер, и 0,5 мкл Avai фермента рестрикции (RE). Осторожно перемешать с помощью пипетки и позволить реакции протекать в течение 1 ч при 37 ° С. Тепло инактивировать реакционную смесь в течение 20 мин (мин) при 80° С. Образцы хранить при температуре -20 ° С в течение не более чем 24 часов, чтобы свести к минимуму деградацию липким класса.
- Готовят 1,2% агарозы, разделяющий гель смешиванием 1,2 г агарозы 100 мл 1x TAE (40 мМ Трис, рН 8,5, 20 мМ уксусной кислоты; 1 мМ ЭДТА) буфере в колбу объемом 250 мл Эрленмейера. Тепло и вихрем, чтобы полностью растворить в микроволновой печи. Немедленно прекратите нагрев, когда жидкость начинает кипеть и вихрем колбу.
- Охладить жидкость агарозы в течение 3 мин при комнатной температуре, в то время как закрученной, добавляют по 2 мкл 10 мг / мл этидий-бромида и завихрения для смешивания. Налейте агарозы в поднос геля с гребнем скважины и позволяют ему затвердеть в течение 1 ч при комнатной температуре. Хранить гели при температуре 4 ° С в течение до 2-х дней в буфер 1x TAE.
- Смешайте каждый RE переваривать из 1.2.3 с 0,2 объема загрузки ДНК красителя (10 мкл красителя на 50 мкл реакции) с помощью пипетки. Нагрузка 5 мкл 500 мкг / мл ДНК трапа в первую лунку и все смеси, RE-дайджеста красителя в другой скважине на аgarose гель. Используйте 2-3 скважины, чтобы загрузить все реакционного объема на гель.
- Выполнить гель едва погруженной в 1x TAE буфер и работающий на 45-50 V (4,5-5 В / см) в течение 65 мин в гель-электрофореза устройства.
- С помощью УФ-шкаф и стерильный бритву, быстро перерезал 2,8 т.п.н. полосу, которая соответствует последовательности CAT из геля, чтобы свести к минимуму воздействие УФ-ДНК. Извлечение ДНК из вырезанного геля среза с использованием набора для экстракции из геля (Материалы таблицу) в соответствии с протоколом производителя.
Примечание: Следите за тем, чтобы не подвергать кожу непосредственно под УФ и обрабатывать бритву с осторожностью. - Amplify КОШКИ кассету, извлеченную из 1.2.6 с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, сконструированных в 1.1, которые содержат свесов, гомологичных последовательности гена, чтобы позволить гомологичной рекомбинации. ПЦР - реакции устанавливаются на льду с использованием руководящих принципов изготовителя (Материалы таблицу) в следующем порядке:
- вСтерильный ПЦР - пробирку, добавьте соответствующий объем DDH 2 O до конечного объема 50 мкл, а затем 10 мкл ПЦР буфера, 1 мкл 10 мМ дНТФ, 2,5 мкл 10 мкМ Прямой праймер, 2,5 мкл 10 мкМ обратного праймера , 1-25 нг матричной ДНК из 1.2.6 и 0,5 мкл 100 ед / мкл полимеразы ДНК.
- Установка отрицательного контроля, который несет в себе те же компоненты, как 1.2.7.1, но за исключением матричной ДНК. Используйте соответствующий объем DDH 2 O вместо матричной ДНК. Настройка положительного контроля с использованием ДНК-матрицы и праймеров, которые были доказаны, чтобы работать в ПЦР-реакции, такие, как те, которые предусмотрены в качестве положительного контроля изготовителем.
- Смешайте все содержимое реакции осторожно пипеткой.
- Amplify с помощью ПЦР с использованием следующих параметров: начальная денатурация в течение 30 сек при 98 ° С, 30 циклов денатурации в течение 10 секунд при 98 ° С, отжига праймеров в течение 20 сек, расширение в течение 20 с на килобаза от ампликона при 72 ° С и плавникAl расширение в течение 10 мин при 72 ° С. Образцы хранить при температуре -20 ° С.
- Подтвердите правильный размер амплификации с помощью электрофореза в агарозном геле (см 1.2.4-1.2.5), используя только 5 мкл каждой реакции. Очищают ампликона ПЦР с использованием набора для очистки ПЦР и протокол производителя. Хранить очищают ДНК при температуре -20 ° С.
- Конструкция прямого праймера, начиная с его 5'-конца и происходит в направлении 3'-конца в следующем порядке: (а) выбрать 4 случайных нуклеотида (сочетание аденин, тимин, гуанин и цитозин), для эффективности расщепления, присоединенные к (б) EcoRI-рестрикционных ферментов (RE) последовательность вырезать участок (GAATTC), а затем (в) 21-25 пар оснований нуклеотидной последовательности, которая является гомологичной 5'-концу гена интереса, в том числе стартовый кодон,. Если ген-мишень содержит сайт EcoRI, выберите другой подходящий RE из pK184 сайт множественного клонирования.
- В случае генов, кодирующих белки периплазмической, включают дополнительную основную последовательность между сайтом RE и старт-кодоном на прямой праймер.
- Используя любой доступный олиго-анализатор, проверьте , что праймеры имеют содержание GC между 40-60%, низкий шпилька T м, низкой само- и гетеро-димеризации Тпл 's. Заказ праймеров для синтеза.
- Вырастить O / N культуре клеток DY330R pOX38-Tc в стерильный LB, содержащей 10 мкг / мл тетрациклина (Tc) при встряхивании при 32 ° С и 200 оборотах в минуту. Центрифуга 6-8 мл культуры O / N при комнатной температуре, 5000 мкг в течение 3 мин. переливатьсупернатант и экстракции плазмидной ДНК из гранул с использованием плазмиды мини-Prep Kit (Материалы таблицу) и протокол производителя.
- Amplify полный интерес ген с грунтами от 1.3.1-1.3.5 использованием pOX38-Tc в качестве матрицы (см 1.2.7.1-1.2.7.3).
- Подтвердите правильный размер амплификации с помощью электрофореза в агарозном геле (см 1.2.4-1.2.5), используя только 5 мкл каждой реакции. Очищают амплифицированной ДНК с использованием набора для очистки ПЦР и протокол производителя. Хранить очищенной ДНК при -20 ° С.
- Сделайте двойной дайджеста как коммерчески доступного pK184 плазмидной ДНК и усиливаемого гена (от 1.3.7.), Добавив следующую строку в стерильную пробирку в указанном порядке: соответствующий объем DDH 2 O до конечного объема 50 мкл , 1 объем мкг плазмиды pK184, 5 мкл 10х буфера фермента реакции, и 1 мкл каждого EcoRI и Hind III.
- Аккуратно перемешать с помощью пипетки и пусть реакция протекать в течение 1 чпри температуре 37 ° С. Тепло инактивировать реакционной смеси в течение 20 мин при 80 ° С. Образцы хранить при температуре -20 ° С в течение не более чем 24 часов, чтобы свести к минимуму деградацию липким класса.
Примечание: Тип рестрикционные используемый здесь, зависит от сайта рестрикции нуклеазная, что было спроектировано в праймеры на этапах 1.3.1 и 1.3.2. - В качестве положительного контроля, установить одиночные дайджесты плазмиды pK184, подготовив такую же реакцию, как в 1.3.8, за исключением того, добавить только один из УЭ в реакционной трубке. Делайте это по отдельности с обоими УЭ.
- Аккуратно перемешать с помощью пипетки и пусть реакция протекать в течение 1 чпри температуре 37 ° С. Тепло инактивировать реакционной смеси в течение 20 мин при 80 ° С. Образцы хранить при температуре -20 ° С в течение не более чем 24 часов, чтобы свести к минимуму деградацию липким класса.
- Запуск дайджестов на агарозном геле 1,2% с использованием протоколов 1.2.4-1.2.5 Извлечение ДНК двойного переваривания фрагменты обоих pK184 и гена интерес согласно пункту 1.2.6.
- Лигирования гена вставляется в вектор pK184 путем добавления компонентов в стерильную пробирку в следующем порядке: 2 мкл 10X T4 ДНК-лигазы буфера, в общей сложности на 100 нг ДНК, состоящую из 1: 3 вектор: вставка (pK184: ген) отношение, DDh 2 O с точностью дообщий объем 20 мкл и 1 мкл ДНК-лигазы Т4. В качестве отрицательного контроля, установить аналогичную реакции с использованием 100 нг вектора без гена вставки.
- Аккуратно перемешать все содержимое реакции с использованием микропипетки и инкубировать в течение 30 мин при 25 ° С. Тепло-инактивировать реакции лигирования в течение 10 мин при 65 ° С, а затем поместить на лед.
- В то время как на льду, добавляют 15 мкл pK184-гена Реакцию лигирования с этапа 1.3.10 к 100 мкл химически компетентных клеток DH5 & alpha в стерильном 1,5 мл трубки. Осторожно перемешать с помощью пипетки и инкубировать на льду в течение 10 мин. Сделайте то же самое для отрицательного контрольного образца. Для положительного контроля используют 20-100 нг плазмиды такой как pBAD33 и превратить его в 50 мкл DHα клеток.
- Непосредственно передавать образцы из льда в С водяную баню 42 ° и инкубировать в течение 90 секунд. Это обеспечивает клеткам теплового шока и позволяет им поглощать плазмидной ДНК.
- Место клетки обратно на льду на другой5 мин и затем добавляют 900 мкл стерильной LB. Инкубируют при 37 ° С в течение 1 ч при встряхивании при 125 оборотах в минуту.
- Алиготе объемом 100 мкл образца из каждой реакции лигирования в 1.3.13 на агаровой пластине, содержащей 50 мкг / мл канамицина (Km) и распределили клетки с помощью стерильной шпателя. Положительный контроль пластины должны иметь соответствующие антибиотики. Держите область стерильной и работать рядом с пламенем. Инкубируйте планшет вверх дном при 37 ° С в течение ночи.
- С помощью стерильной пипетки или петлю, собрать единую отчетливую колонию клеток и инокуляции 20 мл стерильного LB с 50 мкг / мл Km. Держите область стерильной и работать рядом с пламенем. Grow клетки O / N при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту.
- Сделать 3-5 запасы глицерина трансформированных клеток DH5 & alpha путем смешивания 500 мкл O / N культуры с 500 мкл стерильной 100% глицерина (конечная 50% об / об) в стерильных крио-пробирки. Хранить при температуре -80 ° С.
- Кроме того, центрифуга 6-8 мл O / N культура при комнатной температуре, 5,000 мкг в течение 3 мин. Слейте супернатант и извлечения pK184-гена плазмиды восстановления из гранул с использованием плазмиды мини-Prep Kit (Материалы таблицу) и протокол производителя.
Примечание: Грунтовки, предназначенные для делеции, вставки и / или точечных мутаций могут быть легко получены с использованием доступных инструментов онлайн-производителей.
- Конструкция каждого прямого праймера, выбирая длиной в нуклеотидной последовательности 18-32 п.н., которая является гомологичной 5'-концу гена интереса, в том числе стартовый кодон,. Дизайн праймеров таким образом, что каждый прямой праймер отжиги 30-180 б.п. ниже предыдущего, что приводит к делеции мутантов, лишенных N-концевых пептидных фрагментов соответствующей длины.
- Конструкция обратного праймера, выбирая собой длинную последовательность нуклеотидов 18-32 пар оснований, гомологичный 3'-концу гена, представляющего интерес, в том числе и стоп-кодон. Скопируйте этот праймер впу Программа доступна биоинформатики и преобразовать последовательность в ее обратной комплементарной. Это обратный праймер.
- В случае генов, кодирующих периплазмической белки, дизайн обратного праймера, который является обратным дополнением 'концу лидерной последовательности, которая фланкирует 5' 3'-концу гена, и необходим для правильной локализации белкового продукта в периплазме.
- Используя любую доступную программу олиго-анализатор, убедитесь , что удаление праймеров имеют содержание GC между 40-60%, температура плавления низкая шпилька (Т м), низкой само- и гетеро-димеризации Тпл 's. Заказ праймеров для синтеза и отгрузки из любого доступного биотехнологической компании.
- Используя конструкцию pK184-гена , полученного в Протоколе 1.3 в качестве шаблона и руководящих принципов в 1.2.7-1.2.8, ПЦР - амплификации делеции конструкции с использованием праймеров , разработанных на этапах 1.4.1-1.4.3 для генерации pK184-гена ампликонов ? X , Магазин амплифицировали ДНК длинойт -20 ° C.
- Перевязывать усиленную конструкцию с использованием любого доступного набора для мутагенеза (Материалы таблицу).
- Преобразование каждого из ligates pK184 ? X-генов отдельно в химически компетентные клетки DH5 & alpha с использованием стандартного протокола теплового шока (см 1.3.11-1.3.13).
- Алиготе объемом 100 мкл образца из каждой реакции лигирования в 1.4.12 на агаровой пластине, содержащей 50 мкг / мл Km, и распределили клетки с помощью стерильной шпателя. Держите область стерильной и работать рядом с пламенем. Инкубируйте планшет вверх дном при 37 ° С в течение ночи.
- С помощью стерильной пипетки или петлю, собрать единую отчетливую колонию клеток и инокуляции 20 мл стерильного LB среды с 50 мкг / мл Km. Держите область стерильной и работать рядом с пламенем. Grow клетки O / N при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту.
- Сделать 3-5 запасы глицерина трансформированных клеток DH5 & alpha путем смешивания 500 мкл O / N культуры с 500 мкл стерильной 100% глицерина (FInal 50% об / об) в стерильных крио-пробирки. Хранить при температуре -80 ° С.
- Центрифуга 6-8 мл культуры O / N при комнатной температуре, 5000 мкг в течение 3 мин. Слейте супернатант и извлечь ген плазмиду ? X pK184 построить из гранул с использованием плазмиды мини-Prep Kit (Материалы таблицу) и протокол производителя. ДНК Хранить при температуре -20 ° C.
2. Генерация pOX38-Tc Δgene :: Cm Штаммы
- DY330R pOX38-Tc Δgene :: Cm нокауты
- Приготовьте O / N культуре клеток DY330R pOX38-Tc в 10 мл стерильного LB, содержащей 10 мкг / мл Tc. Grow культуры O / N при 32 ° C и 200 оборотов в минуту.
- Сделать 1:70 разбавление O / N культуры в 20 мл свежей стерильной LB. Растут клетки при 32 ° С до середины логарифмического (OD 600нм 0,4-0,6) роста.
- Передача 10 мл культуры в стерильную колбу и инкубировать при 42 ° С в течение 15 мин при 150 оборотах в минуту в покиванием ба водыго. Это будет стимулировать экспрессию рекомбинации специфических белков в DY330R.
- Холод культуры в ледяной водяной бане в течение 10 мин. Готовят Электрокомпетентные клетки следующим образом.
- Передача охлажденные клетки в предварительно охлажденные конические пробирки и центрифуге при 4000 мкг в течение 7 мин при 4 ° С. Все пробирки и пипетки, которые будут использоваться в следующих шагах должны быть размещены при 4 ° С или на льду для охлаждения.
- Удалить супернатант и осторожно ресуспендируют клетки в 1 мл охлажденного льдом DDH 2 O. Добавить еще 30 мл охлажденного льдом DDH 2 O.
- Центрифуга клетки (4000 XG, 7 мин, 4 ° C), выбросьте супернатант и осторожно ресуспендируют клеток в 1 мл охлажденного льдом DDH 2 O.
- Передача ресуспендировали клеток в предварительно охлажденные 1,5 мл микроцентрифужных пробирках и центрифугируют при 15000 х г в течение 1 мин при 4 ° С.
- Аккуратно ресуспендировали осадок в 200 мкл охлажденного на льду DDH 2 O и аликвоту в 50 мкл объемы. ElectrocompeteКлетки нт можно хранить при температуре -80 ° C
- Добавьте 300 нг амплифицированного CAT кассеты от 1,2 в 50 мкл электрокомпетентных клеток DY330R pOX38-Tc при перемешивании на льду, осторожно пипеткой вверх и вниз. Повторите этот шаг с использованием немодифицированного плазмиды pBAD33 в качестве положительного контроля.
- Передача клеток в предварительно охлажденный кювету для электропорации (-20 ° C) 1 мм. Электропорации клетки при 1,8 кВ с постоянной времени 5,5 мс, используя электропоратора. Сразу же после нанесения импульса, разбавленные клетки с 1 мл SOC сред и переносят в свежую микроцентрифужную пробирку. Инкубируйте клетки при 32 ° С в течение 2 ч.
- Аликвоты по 100 мкл каждого образца на чашках с агаром, содержащих 10 мкг / мл Tc и 20 мкг / мл Cm и Распределенные с помощью стерильного шпателя. Держите область стерильной и работать рядом с пламенем. Инкубируйте планшет вверх дном при 32 ° С в течение ночи, чтобы выбрать для успешных рекомбинантов. КПП кассета введена в клетку будет претерпевать гомологичную повторнокомбинация с интересующим геном и создать DY330R pOX38-Tc Δgene :: Cm (Rif R, Tc R, Cm R) клон.
Примечание: Важно, чтобы вырастить DY330R клеток при 32 ° С, за исключением 15 мин индукции при 42 ° C на стадии 2.1.3 до генерации Электрокомпетентные клеток, продолженный рост при повышенных температурах риск гибели клеток в результате образования токсичных продуктов из L оперона р , ответственного за рекомбинации функций в DY330R. 33,34 - Подготовка O / N из DY330R pOX38-Tc Δgene :: клетки Cm путем сбора одного отчетливое колонию клеток с помощью стерильной пипетки или петлей, и прививка носитель 20 мл стерильного LB с 10 мкг / мл Tc, и 20 мкг / мл См. Держите область стерильной и работать рядом с пламенем. Grow клетки O / N при 32 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту.
- Сделать 3-5 запасы глицерина из O / N путем смешивания 500 мкл O / N культуры с 500 мкл стерильной 100% этиленгликольycerol (конечная 50% об / об) в стерильных крио-пробирки. Хранить при температуре -80 ° С.
- Центрифуга 6-8 мл культуры O / N при комнатной температуре, 5000 мкг в течение 3 мин. Слейте супернатант и извлечь pOX38-Tc Δgene :: Cm построить из гранул с использованием плазмиды мини-Prep Kit (Материалы таблицу) и протокол изготовителя; хранить очищенную ДНК при -20 ° С.
- Провести анализ конъюгативных спаривании с использованием XK1200 клеток в качестве получателя для подтверждения нарушения сопряжения по нокаут гена согласно протоколу 3.1.
- DY330R pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184-гена
- Transform Электрокомпетентные клетки DY330R pOX38-Tc Δgene :: Cm с 300 нг конструкции pK184-гена с помощью электропорации в соответствии с шагами 2.1.4-2.1.7. Все селективные среды должны содержать 20 мкг / мл и 50 Cm мкг / мл Km. Инкубировать при 32 ° С. Плазмида восстановления в клетках электропорации теперь восстановить функцию выбиты гена в DY330R pOX38-Tc Δgene :: Cm клетки.
- Подготовка O / N из DY330R pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184-генные рекомбинантные клетки путем сбора одну отчетливую колонию клеток с помощью стерильной пипеткой или петлей, и прививка носитель 20 мл стерильного LB с 20 мкг / мл Cm и 50 мкг / мл км. Держите область стерильной и работать рядом с пламенем. Grow клетки O / N при 32 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту.
- Сделать 3-5 запасы глицерина из O / N путем смешивания 500 мкл O / N культуры с 500 мкл стерильной 100% глицерина (конечная 50% об / об) в стерильных крио-пробирки. Хранить при температуре -80 ° С.
- Кроме выполнения протокола 3.1 для генерации XK1200 pOX38-Tc Δgene :: Cm рекомбинантных клеток.
- XK1200 pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184-гена и Мутанты
- Приготовьте клетки Электрокомпетентные XK1200 pOX38-Tc Δgene :: Cm (со стадии 2.2.4).
- Отдельно электропорации 300 нг pK184-гена или pK184-мутантного гена плазмид в 50 мкл Electrocompetent XK1200 pOX38-Tc Δgene :: Cm клетки как на шаги 2.1.4-2.1.7. Все селективные среды должны содержать 10 мкг / мл налидиксовой кислоты (NAL), 20 мкг / мл Cm, и 50 мкг / мл Km, и инкубировать при температуре 37 ° С.
- Подготовка O / N из XK1200 pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184-генные рекомбинантные клетки путем сбора одну отчетливую колонию клеток с помощью стерильной пипеткой или петлей, и прививка носитель 20 мл стерильного LB с Нал, 20 мкг / мл Cm и 50 мкг / мл км. Держите область стерильной и работать рядом с пламенем. Grow клетки O / N при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту.
- Сделать 3-5 запасы глицерина из O / N путем смешивания 500 мкл O / N культуры с 500 мкл стерильной 100% глицерина (конечная 50% об / об) в стерильных крио-пробирки. Хранить при температуре -80 ° С.
3. конъюгативных Спаривание Assays
- Конъюгативных Спаривание для генерации XK1200 pOX38-Tc Δgene :: Cm Cells
- Приготовьте 20 мл стерильного LB O / N CULратуре DY330R pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184-генные клетки с помощью стерильной пипетки или петлю для инокуляции 20 мл стерильного LB, содержащей 20 мкг / мл Cm и 50 мкг / мл Km, с глицерином запаса или одной колонии на агар пластины. Grow при 32 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту. Приготовьте то же самое для XK1200 клеток в 20 мл стерильного LB с 10 мкг / мл Нал, растет при 37 ° С.
- Сделать 1:70 разведений каждой культуры по отдельности в 2 мл стерильного LB с тем же содержанием антибиотика; добавить глюкозу до конечной концентрации 100 мМ для всех донорских клеток. Рост клеток в фазе середины логарифмической (OD 600 0,5-0,7) при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту.
- Центрифуга (4000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С), чтобы осадить клетки, отбросить супернатант, промыть один раз холодным стерильным LB для удаления антибиотики и ресуспендирования клеток в 2 мл холодной стерильной LB.
- Алиготе 100 мкл каждой культуры в 800 мкл стерильными средами LB и дать им возможность спариваться при 32 ° С в течение 1 ч без встряхивания. <li> Vortex клетки в течение 30 секунд, чтобы разрушить пары сопрягаемых и разместить их на льду в течение 10 мин, чтобы предотвратить дальнейшее спаривание.
- Аликвоты по 100 мкл клеточной смеси на чашку с агаром, содержащей 10 мкг / мл Наль и 20 мкг / мл Cm, чтобы выбрать для клеток XK1200 pOX38-Тс Δgene :: Cm. Распространение клеток с помощью стерильного шпателя. Держите область стерильной и работать рядом с пламенем. Инкубируют пластины O / N при 37 ° C в обратном порядке.
- Заготавливают одну колонию гена нового XK1200 pOX38 Тс-Д :: Cm Штамм Нокаут с помощью стерильной пипетки или петлю и расти в стерильном LB с 20 мкг / мл Cm, O / N в 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту. Сделать 3-5 запасы глицерина из O / N путем смешивания 500 мкл O / N культуры с 500 мкл стерильной 100% глицерина (конечная 50% об / об) в стерильных крио-пробирки. Хранить при температуре -80 ° С.
Примечание: Полученные клетки теперь могут быть сделаны компетентным для трансформации с pK184-генных конструкций (протоколы 1.3 и 1.4) для попкуэссинга ген и его мутантов на способность восстанавливать конъюгативных передачи в протоколе 3.2.
- Подготовка O / N культуры XK1200 pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184-гена клетки в 20 мл стерильного LB с 20 мкг / мл Cm, 50 мкг / мл Км и MC4100 клеток в 5 мл LB с 50 мкг / мл стрептомицина (SM) с использованием клеток из глицерина запаса или одной колонии на агаровой пластине и стерильный пипетка или петли. Grow культуры в 37 ° C с 200 оборотов в минуту дрожать.
- Сделать 1:70 разведений от каждого O / N культуры по отдельности в 2 мл стерильного LB с теми же антибиотиками. Добавить глюкозу до конечной концентрации 100 мМ для всех донорских клеток. Рост клеток в фазе середины логарифмической (OD 600 0,5-0,7) при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту.
- Центрифуга (4000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С), чтобы осадить клетки, отбросить супернатант, мыть один раз с холодной стерильной LB для удаления antibioтики и ресуспендирования клеток в 2 мл холодной стерильной LB.
- В двух экземплярах, аликвоты по 100 мкл каждой культуры в 800 мкл стерильными средами LB и дать им возможность спариваться при 37 ° С в течение 1 ч без встряхивания.
- Vortex клетки в течение 30 секунд, чтобы разрушить пары сопрягаемых и разместить их на льду в течение 10 мин, чтобы предотвратить дальнейшее спаривание.
- Использование культур в середине журнала со стадии 3.2.2 и свежего стерильного LB, готовят 6 серийных разведений донора и реципиента клеток от 10 -2 до 10 -7.
- На каждой из двух половин чашки с агаром , содержащей 10 мкг / мл Nal, 20 мкг / мл и 50 Cm мкг / мл Km , появления пятен 10 мкл аликвоты каждого разведения XK1200 донорских клеток, как показано на рисунке 2. Повторите эти действия для Разведения MC4100 реципиент клеток на чашках с агаром, содержащих 50 мкг / мл Sm. Инкубируйте пластины O / N при 37 ° C.
- Используя встряхивали смесь со стадии 3.2.5 и свежей стерильной LB, готовят 6 разведения (10 -2 -10 -7 показано на рисунке 2. Повторите эти действия для обоих дублированных смесей. Держите область стерильной и работать рядом с пламенем. Инкубируйте пластины O / N при 37 ° C.
- Определить эффективность спаривание каждого конструкта, как описано в протоколе 3.3.
- Повторите этот протокол для всех плазмид восстановления, чтобы оценить влияние конкретной мутации на эффективность сопряжения.
- Подсчитайте количество колоний из того же разведения кровянистые выделения для каждого донора, реципиента и transconjugant клеток на их соответствующих пластин.
- Количество колоний получателей проверить любое смещение, которое привело бы от необходимости большего количества трансконъюгантов чем реципиентов при этом данного разведения.
- Сalculate эффективность матовую как количество transconjugant колоний, поделенное на число колоний-доноров. Умножьте на 100, чтобы получить значение эффективности на 100 донорских клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Процесс F плазмиды управляемой бактериальной конъюгации представляет собой скоординированный процесс , который включает в себя белки переноса в тра области F-плазмиды , которая собирает T4SS для облегчения синтеза фимбриевый и конъюгативных перенос ДНК. Белок TRAF (GenBank, # BAA97961; UniProt ID P14497) необходим для формирования конъюгативной F-пилей. 10,14,35 - 37 Белок содержит С-концевой тиоредоксин-подобный домен, хотя он не имеет каталитический CXXC мотив. 35,38 Несмотря на то, что было предсказано , чтобы взаимодействовать с белком трах через его N-концевой домен, 39 область , показано более динамичны , чем его С-концевого домена, 37 не так много еще известно о структурных особенностей белка. Для того, чтобы оценить функциональные аспекты белка TRAF в сочетании со структурными исследованиями, мы впервые нокаутирован ген Traf на pOX38-Tc посредством гомологичнойрекомбинации, генерации плазмиды pOX38-Tc ΔtraF :: Cm (Таблица 1) в E.coli DY330R клетках. 33,34 Также генерируется была плазмида pK184-Traf из Traf -специфических праймеров (таблица 2) , чтобы обеспечить восстановление сопряжения и позволяют зондировании последовательность белка. Перенос плазмиды pOX38-Tc ΔtraF :: Cm в XK1200 клетки 40 из DY330R клеток при pK184-Traf был предоставлен в транс (трансконъюгантов выращивают на 10 мкг / мл Нал, 10 мкг / мл Tc и 20 мкг / мл Cm) указывает что (а) нокаут Traf в pOx38-Tc ΔtraF :: Cm обеспечивает в рамке CAT кассету, и (б) что pK184-Traf может восстановить конъюгативных функцию.
Серия Traf мутантов были получены для анализа с помощью анализа конъюгативных матовую 37 с использованием XK1200 pOX38-Tc ΔtraF :: Cm + pK184-Traf ? Xклетки и клетки MC4100 41 в качестве доноров и реципиентов, соответственно. Один представитель мутант Traf 55-247 (таблица 1), N-концевую делецию мутант , который удаляет область белка предсказал взаимодействовать с трах. Когда полноразмерный белок TRAF предоставляется донорских клеток, конъюгативная передача восстанавливается (рисунок 2), обеспечивая при этом пустые плазмиды pK184 нет (таблица 3). Точно так же, конъюгативная функции в клетках XK1200 донора не восстанавливается при условии плазмидой pK184-Traf 55-247 (таблица 3). Это указывает на то, что укороченная область белка имеет важное значение для функции TRAF в пределах конъюгативной аппарата, скорее всего, через взаимодействие с трах, и обеспечивает область белка целевой для дальнейшего мутационного анализа.
в транс с помощью плазмиды восстановления (pK184-гена). Полученную плазмиду pOX38-Tc Δgene :: Cm передается штамм XK1200 (этап 2) для дальнейшей оценки гена с использованием брачные анализов с получателем MC4100 (шаг 3). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: МатИНГ анализа для оценки функции гена-мишени в в сопряжении. Донора и реципиента клетки кишечной палочки XK1200 pOX38-Tc ΔtraF :: Cm трансформировали pK184-Traf и MC4100, соответственно. Полученные трансконъюганты (MC4100 pOX38-Tc ΔtraF :: Cm) растут на пластинах , содержащих Sm и Cm, что указывает на успешное восстановление конъюгативной функции. Эксперимент проводится в двух экземплярах на одной чашке с агаром, и серийные разведения используются для того расчета эффективности сопрягаемой реституционной мутантов гена (таблица 2). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Бактериальный штамм / Плазмидная | Соответствующие характеристики | Селективного маркера (ов) † | Справка |
бактериальными штаммами | |||
DY330R | W3110 ΔlacU169 gal490 λc1857 Δ (CRO-BIOA) Rif R | понижение в должности | 33,34 |
XK1200 | F - lacΔU124 Δ (NADA Arog гал attλ био GYRA) | Нал | 40 |
MC4100 | araD139 Δ (ФГДД-ЛАК) U169 rpsL150 relA1 flbB3501 deoC1 ptsF25 rbsR | Sm | 41 |
Векторы и конструкты | |||
pBAD33 | Плазмида для экспрессии под P от araBAD | См | 32 |
pK184 | 2.4 кб клонирующий вектор, p15a репликон | Km | 31 |
pK184-Traf ‡ </ TD> | F Traf от pOX38 в pK184 | Km | 35 |
pK184-Traf 56-247 | F Traf аа 56-247 из pK184-Traf | Km | |
конъюгативных Плазмиды | |||
pOX38-Тс | IncFI, Тра +, RepFIA +, f1 HindIII фрагмент F, мини-Tn | Тс | 29,30 |
pOX38-Tc ΔtraF :: Cm | pOX38 Тс-с КПП вставляется в Traf | Tc Cm | 35 |
† Cm, хлорамфеникол; Km, канамицин; Нал, налидиксовой кислоты; Rif, рифампицин; Sm, стрептомицин; Тс, тетрациклин | |||
‡ Все конструкции Traf содержат 19-остатков лидерной последовательности, чтобы обеспечить локализацию периплазмическое пространства. |
Таблица 1: штаммы палочки и плазмиды использовали в данном исследовании.
сооружать | Грунтовка * |
Traf-Cm-For | 5'- GATCGAGGCTGGCAGTGGTATAACGAGAAAATAAATCCGAAGGA - CTGTGACG GAAGATCACTTC -3 ' |
Traf-Cm-Rev | 5'- TCTTCAGAAACGTTCAGGAACTGTTTTGCCAGGTCGTCCT - CTTATTCAGGCGT AGCACCAG -3 ' |
pK184-TRAF-For | 5'- TTTTTT GAATTC TATGAATAAAGCATTACTGCCAC -3 ' |
pK184-TRAF-Rev | 5'- TTTTTT AAGCTT TAAAAATTGGGTTTAAAATCTTCAGAAA -3 ' |
pK184-Traf 55-247 -Для | 5'- TACG CATATG ATGGCCGCACTGCAGACGG -3 ' |
pK184-Traf 55-247 | 5'- TACG CATATG TCCTGACGCCGGAAAAATAAAGCAGCAGAGTAA -3 ' |
† Таблица заимствована из Lento и др. 2016 35 с разрешения | |
* Traf нависающие участки Курсивом. Ограничение ферментные сайты подчеркнуты (HindIII: AAGCTT, EcoRI: GAATTC, NdeI: CATATG) |
Таблица 2: Перечень праймеров , использованных в данном исследовании.
Донор Плазмида † | Восстановление Плазмида | Трансконъюгаты ‡ § (клетки мл -1) | Спаривание Efficiency§ || |
pOX38-Tc ΔtraF :: Cm | Никто | 0 | 0 |
pOX38-Tс ΔtraF :: Cm | pK184 | 0 | 0 |
pOX38-Tc ΔtraF :: Cm | pK184-Traf | 5 х 10 3 | 0,0167 |
pOX38-Tc ΔtraF :: Cm | pK184-Traf 55-247 | 0 | 0 |
* Таблица заимствована из Lento и др. 2016 35 с разрешения | |||
† Донорские клетки кишечной палочки XK1200, со средней концентрацией 3 × 10 7 клеток мл -1 | |||
‡ клетки - реципиенты были кишечной палочки MC4100. Число трансконъюгантов для положительного контроля составляет от 10-5 разведения. 0 указывает на отсутствие трансконъюгантов от 10-2 разведения. | |||
§An в среднем от двух до четырех брачных экспериментов были выполнены для каждой конструкции. | |||
|| Эффективность спаривание definэд в качестве трансконъюгантов на 100 донорских клеток. 0 КПД спаривание указывает на отсутствие трансконъюгантов от 10-2 разведения |
Таблица 3: упразднены эффективность спаривания с помощью Traf делеционных конструкций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Бактериальный процесс конъюгации обеспечивает средства, с помощью которых бактерии могут распространяться гены обеспечивая эволюционное преимущество для роста в сложных условиях, таких как распространение маркеров устойчивости к антибиотикам. Поскольку многие из конъюгативных плазмид настолько велики, 12 функциональных исследований по белков , участвующих в сборке передачи аппарата в результате мутации генов - мишеней , на самом конъюгативной плазмиды являются громоздкими. В данном документе подробно описанные протоколы обеспечивают средство , с помощью которого можно более легко оценить целевой интерес ген , за счет использования меньшие, более экспрессионных плазмид (рисунок 1). Мы используем плазмиды F производное pOX38-Tc (таблица 1) для изучения F плазмиды опосредованной конъюгации; другие конъюгативных плазмиды могут быть изучены с помощью подробных здесь протоколы и соответствующие производные плазмид. Сопряженные анализы , описанные были адаптированы от мороза и коллег, 42 с некоторыми modificatiдополнения. В предыдущих исследованиях, 8,33,42 создание конструкции pOX38-Tc Δgene :: Cm была достигнута путем скалывания интересующего гена с соответствующими ферментами рестрикции и встраиванием амплифицированной CAT кассету в pOX38-Tc. 42 В текущем методе мы используем гомологичной рекомбинации в recombineering штамма E.coli DY330R 33,34 нокаут гена - мишени и заменить его на CAT кассете. Это имеет преимущество, что позволяет результирующую DY330R штамм укрывает pOX38-Тс Δgene :: Cm сооружать действовать в качестве контроля для нокаута гена специфических из F-T4SS опосредованной конъюгативного переноса через восстановление переноса с использованием плазмиды восстановления pK184-гена , В то время как это может быть возможно генерировать просвечивания с использованием методологии Зернистое-cas9, 43 мы не имеем в это время использовали эту возможность.
Процесс начинается с генерации гена в нокауте производной плазмиды F pOX38-Tc (Figurе 1). Это достигается с помощью гомологичной рекомбинации в клетках DY330R (таблица 1), также могут быть использованы и другие штаммы с аналогичными характеристиками , такими как DY329, DY331 и DY378. Грунтовки первоначально предназначены для ПЦР - амплификации КОШКИ кассеты из плазмиды pBAD33 32 и содержат нависающих основы , которые являются специфическими для гена - мишени (таблица 2); ПЦР-продукт затем электропорации в DY330R клеток, несущих pOX38-Tc. Гомологичные рекомбинация генерирует нокаут плазмиды pOX38-Tc Δgene :: Cm, где CAT кассета вставляется в рамке в пределах гена-мишени, эффективно нарушая сборку и спряжения T4SS, обеспечивая при этом Cm сопротивление. В то же время, гена-мишени амплифицировали с помощью ПЦР из pOX38-Tc и вставляется в небольшой экспрессирующую плазмиду; В этом протоколе мы используем pK184 для конститутивной экспрессии, тем не менее можно было бы выбрать плазмиду с индуцируемой экспрессии гена-мишени, если это желательно. Плазмида pK184-ген затем трансформируютв клетки DY330R pOX38-Tc Δgene :: Cm, и эти клетки затем используются в качестве доноров Для переноса pOX38-Tc Δgene :: Cm построить с помощью сопряжения в XK1200 клеток для вязки анализов. В ответными анализах, донор и реципиент клетки XK1200 pOX38-Tc Δgene :: Cm и MC4100, соответственно. Восстановление плазмида pK184-гена, а также мутанты серий гена - мишени (делеции или точечные мутации), предоставляется донорских клеток , чтобы оценить их способность восстанавливать спаривание, и определить его эффективность, с клетки - реципиенты MC4100 (рисунок 2 ; Таблица 3).
Решающее значение для процедуры является использование соответствующего донора и штаммов - реципиентов (таблица 1), а также от конструкции используемых праймеров. Для каждого праймера разработан, существуют общие принципы, которые следует соблюдать. В то время как мы строго стараться соблюдать с 40-60% содержанием GC, это не всегда возможно. В таких случаях своему усмотрению экспериментатора, чтобы проверить грунт шСодержание GC Ith немного ниже или выше этого диапазона. Температура плавления (Тпл) переднего и обратного праймера , должны быть одинаковыми, а температура отжига (Т а) значение всегда должно быть ниже , чем Тпл на 2-5 ° С для ПЦР. Свободная энергия , доступная для обеспечения возможности заколку для разработки должен быть значительно ниже , чем Т а, в то время как гомо- и гетеро- димеризации Тпл 's должно быть очень низким (менее чем -10 кДж и 30 ° С). Праймеры могут быть разработаны, чтобы исследовать делеции, инсерции или точечные мутации по своему желанию. Это, конечно, важно, чтобы полученный в результате конструкт гена амплифицировать и лигировали в плазмиду восстановления в рамке считывания таким образом, чтобы он правильно экспрессирован. Трансформация компетентных клеток может быть сделано с помощью электропорации или теплового шока с использованием Электрокомпетентные или химически компетентных клеток, соответственно. Мы считаем, что электропорации является более эффективным для больших конструкций, таких как pOX38-Tc и гомологичной рекомбинации oligonucleotide, в то время как более мелкие плазмиды экспрессии, такие как pK184-TRAF могут быть легко преобразованы в клетки, используя методы теплового шока. И, наконец, важно помнить, что будет несколько антибиотиков в использовании на протяжении всего протокола, поскольку оба доноров и получателей штаммы требуют различных сопротивлений, которые отличаются от тех, которые использованы на конъюгативных и восстановления плазмид.
Помимо методов сопрягаемые анализов, описанных здесь, существуют другие методы, которые используются для изучения конъюгации бактерий, слегка различающиеся по их подходе. Горизонтальный перенос генов представляет собой процесс, в котором бактерии переноса плазмиды в клетку-реципиент, в том числе получателей межвидовых. 44 Исследование Дальбергом и его коллеги 44 например использовали конъюгации бактерий , чтобы определить степень межвидовой горизонтального переноса генов. Они использовали включение зеленого флуоресцентного белка (GFP) в плазмиду клонировали в KT2442 клеток; хромосомный лAC I кв гена в клетках KT2442 подавляют экспрессию GFP. Когда плазмиду , несущую GFP , передается вида без гена д лаковые I, наблюдается флуоресценция. 44 Несмотря на ограничения , чтобы обеспечить определенную функцию белка у разных видов, эксперимент межвидовой спряжения возможно может быть связан с протоколами , представленными здесь , чтобы сделать эволюционные предсказания для белок-белковых взаимодействий между различными видами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Discovery Гранта из наук и инженерного совета природного Канады (NSERC).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
GeneJet Gel Extraction Kit | Fisher Scientific | K0692 | |
GeneJet PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0554S | |
Broad Range DNA Ladder | New England Biolabs | N0303A | |
Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
Electroporator | Eppendorf | 4309000027 | |
Electroporation cuvettes | Fisher Scientific | FB101 | Cuvettes have a 1 mm gap. |
Enzymes | |||
AvaI | New England Biolabs | R0152S | |
EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
DpnI | New England Biolabs | R0176S | |
Antibiotics | Final Concentrations | ||
Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | 20 µg/mL |
Kanamycin (Km) | BioBasic Inc. | DB0286 | 50 µg/mL |
Nalidixic acid (Nal) | Sigma-Aldrich | N8878-25G | 10 µg/mL |
Rifampicin (Rif) | Calbiochem | 557303 | 20 µg/mL |
Tetracycline (Tc) | Fisher Scientific | BP912-100 | 10 µg/mL |
Streptomycin (Sm) | Fisher Scientific | BP910-50 | 50 µg/mL |
References
- Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms. Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).
- Furuya, E. Y., Lowy, F. D.
Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting. Nat Rev Microbiol. 4 (1), 36-45 (2006). - Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R., Gelbart, W. An Introduction to Genetic Analysis, 7th Edition. , W.H. Freeman. San Fransisco. (2000).
- Cooper, T. F. Recombination Speeds Adaptation by Reducing Competition between Beneficial Mutations in Populations of Escherichia coli. PLoS Biol. Barton, N. H. 5 (9), 225 (2007).
- Lujan, S. A., Guogas, L. M., Ragonese, H., Matson, S. W., Redinbo, M. R. Disrupting antibiotic resistance propagation by inhibiting the conjugative DNA relaxase. Proc Natl Acad Sci. 104 (30), 12282-12287 (2007).
- Carattoli, A.
Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013). - Shala, A., Ferraro, M., Audette, G. F. Bacterial Secretion Systems: Nanomachines for Infection and Genetic Diversity. Handbook of Clinical Nanomedicine: Nanoparticles, Imaging, Therapy and Clinical Applications. Bawa, R., Audette, G. F., Rubenstein, I. , Pan Sanford Publishing. Singapore. 657-686 (2016).
- Tseng, T. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), Suppl 1 2 (2009).
- Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
- Lawley, T. D., Klimke, W. A., Gubbins, M. J., Frost, L. S. F factor conjugation is a true type IV secretion system. FEMS Microbiol Lett. 224 (1), 1-15 (2003).
- Lederberg, J., Tatum, E. L.
Gene Recombination in Escherichia Coli. Nature. 158 (4016), 558-558 (1946). - Smillie, C., Garcillan-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P. C., de la Cruz, F.
Mobility of Plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010). - Willetts, N., Skurray, R. The Conjugation System of F-Like Plasmids. Annu Rev Genet. 14 (1), 41-76 (1980).
- Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., Skurray, R. A. Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor. Microbiol Rev. 58 (2), 162-210 (1994).
- Audette, G. F., Manchak, J., Beatty, P., Klimke, W. A., Frost, L. S. Entry exclusion in F-like plasmids requires intact TraG in the donor that recognizes its cognate TraS in the recipient. Microbiology. 153, Pt 2 442-451 (2007).
- Christie, P. J., Atmakuri, K., Krishnamoorthy, V., Jakubowski, S., Cascales, E. Biogenesis, Architecture, and Function of Bacterial Type Iv Secretion Systems. Annu Rev Microbiol. 59 (1), 451-485 (2005).
- Christie, P. J. Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1694 (1-3), 219-234 (2004).
- Bhatty, M., Laverde Gomez, J. a, Christie, P. J. The expanding bacterial type IV secretion lexicon. Res Microbiol. 164 (6), 620-639 (2013).
- Christie, P. J., Cascales, E. Structural and dynamic properties of bacterial Type IV secretion systems (Review). Mol Membr Biol. 22 (1-2), 51-61 (2005).
- Christie, P. J. Type IV secretion: Intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines. Mol Microbiol. 40 (2), 294-305 (2001).
- Christie, P. J., Whitaker, N., González-Rivera, C. Mechanism and structure of the bacterial type IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1578-1591 (2014).
- Cascales, E. The type VI secretion toolkit. EMBO Rep. 9, 735 (2008).
- Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. Structure and Regulation of the Type VI Secretion System. Annu Rev Microbiol. 66 (1), 453-472 (2012).
- Chandran, V., et al. Structure of the outer membrane complex of a type IV secretion system. Nature. 462 (7276), 1011-1015 (2009).
- Rivera-Calzada, A., et al. Structure of a bacterial type IV secretion core complex at subnanometre resolution. EMBO J. 32 (8), 1195-1204 (2013).
- Waksman, G., Fronzes, R. Molecular architecture of bacterial type IV secretion systems. Trends Biochem Sci. 35, 691 (2010).
- Fronzes, R., Christie, P. J., Waksman, G. The structural biology of type IV secretion systems. Nat Rev Microbiol. 7 (10), 703-714 (2009).
- Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 5-9 (2015).
- Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 45, Pt 1 135-140 (1981).
- Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
- Jobling, M. G., Holmes, R. K. Construction of vectors with the pl5a replicon, kanamycin resistance, inducible lacZα and pUC18 or pUC19 multiple cloning sites. Nucleic Acids Res. 18 (17), 5315 (1990).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P(BAD) promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5978-5983 (2009).
- Lawley, T. D., Gilmour, M. W., Gunton, J. E., Standeven, L. J., Taylor, D. E. Functional and Mutational Analysis of Conjugative Transfer Region 1 (Tra1) from the IncHI1 Plasmid R27. J Bacteriol. 184 (8), 2173-2180 (2002).
- Elton, T. C., Holland, S. J., Frost, L. S., Hazes, B. F-Like Type IV Secretion Systems Encode Proteins with Thioredoxin Folds That Are Putative DsbC Homologues. J Bacteriol. 187 (24), 8267-8277 (2005).
- Hazes, B., Frost, L. Towards a systems biology approach to study type II/IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1778, 1839-1850 (2008).
- Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. Tsolis, R. 590 (3), 376-386 (2016).
- Audette, G. F., Van Schaik, E. J., Hazes, B., Irvin, R. T. DNA-binding protein nanotubes: Learning from nature's nanotech examples. Nano Lett. 4, 1897-1902 (2004).
- Harris, R. L., Silverman, P. A. Tra proteins characteristic of F-like type IV secretion systems constitute an interaction group by yeast two-hybrid analysis. J Bacteriol. 186 (16), 5480-5485 (2004).
- Moore, D., et al. Characterization of the F-Plasmid Conjugative Transfer Gene traU. J Bacteriol. 172 (8), 4263-4270 (1990).
- Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
- Klimke, W. A., Frost, L. S. Genetic analysis of the role of the transfer gene, traN, of the F and R100-1 plasmids in mating pair stabilization during conjugation. J Bacteriol. 180 (16), 4036-4043 (1998).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69 (1), 209-228 (2015).
- Dahlberg, C., Bergstrom, M., Andreasen, M., Christensen, B. B., Molin, S., Hermansson, M. Interspecies bacterial conjugation by plasmids from marine environments visualized by gfp expression. Mol Biol Evol. 15 (4), 385-390 (1998).