Introduction
Struktur bestemmelse via røntgenkrystallografi har gjort fundamentale bidrag til alle områder af moderne biologi; giver en atomar visning af makromolekyler, der understøtter livet, og hvordan de interagerer med hinanden i forskellige sammenhænge; tillader os at forstå de mekanismer, der forårsager sygdom og giver muligheder for rationelt at designe lægemidler til behandling af sygdomme. Krystallografi har længe været den dominerende eksperimentel teknik til bestemmelse makromolekylære struktur, og i øjeblikket tegner sig for 89,3% af den strukturelle database (www.rcsb.org). Denne teknik har mange fordele, herunder muligheden for meget høj opløsning, evnen til at visualisere makromolekyler med en bred vifte af størrelser, forholdsvis let dataindsamling, og mulighed for at visualisere, hvordan makromolekylet interagerer med opløsningsmiddel samt ligander.
Trods talrige teknologiske forbedringer i rekombinant proteinekspression 1,2, purification 3, og molekylær biologi bruges til at generere disse systemer 4, den største forhindring i den krystallografiske proces forbliver evnen til at vokse diffraktion kvalitet krystaller. Dette har især været tilfældet for proteiner, der indeholder store coiled-coil-domæner. Det er blevet anslået, at så meget som 5% af alle aminosyrer findes inden coiled-coils 5,6, hvilket gør dette til en meget fælles strukturelt træk 7, men disse proteiner er ofte mere vanskelige at oprense og krystallisere end globulære proteiner 8-10 . Dette er yderligere forstærket af det forhold, at coiled-coil domæner ofte findes inden for rammerne af et større protein, derfor korrekt forudsige grænserne for disse domæner er kritisk for at undgå optagelse af ustrukturerede eller fleksibel sekvens, der ofte skadeligt for krystallisation.
Her præsenterer vi en begrebsramme kombinerer webbaseret beregningsmæssige analyser med Experimental data fra bænken, for at hjælpe guide brugerne gennem de indledende stadier af den krystallografiske proces, herunder: Sådan markeres proteinfragment (er) for strukturelle studier, og hvordan man kan forberede og karakterisere proteinprøver før forsøg krystallisering. Vi fokuserer vores analyse på to proteiner, der indeholder store coiled-coil-domæner, Shroom (SHRM) og Rho-kinase (Rock). Disse proteiner blev valgt som de begge indeholder coiled-coil-domæner og er kendt for at danne et biologisk relevant kompleks 11-16. Shroom og Rho-kinase (Rock) forudsiges at indeholde ~ 200 og 680 rester af coiled-coil henholdsvis mange hvoraf dele er blevet karakteriseret strukturelt 17-20. Den her beskrevne fremgangsmåde tilvejebringer en strømlinet arbejdsgang til hurtigt at identificere fragmenter af coiled-coil holdigt protein, der vil være medgørlige til krystallisation imidlertid de beskrevne teknikker kan let tilpasses til de fleste protein eller protein-komplekser eller modificeret til at inkorporere high-throughput approaChes som tilgængelig. Endelig er disse metoder generelt billige og kan udføres af brugerne i næsten alle erfaringer niveauer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Et diagram af begrebsramme eller arbejdsgang er beskrevet i figur 1 for reference. Protokollen kan opdeles i fire faser: beregningsmæssige eller sekvens baserede forudsigelser, protein ekspression og oprensning, biokemisk karakterisering, og krystallisering. De viste eksempler analysere Shroom SD2 domæner og / eller Shroom-Rock-komplekser, men kan anvendes med ethvert protein.
1. Brug Etableret webbaserede værktøjer til at generere Computational Forudsigelser af dobbeltsnoet Domain Boundaries
- Saml en evolutionært varieret sæt Sequence Homologer.
- Gå til www.uniprot.org og skriv Shroom i øverste søgefelt.
- Vælg sekvenser til download ved at markere feltet ved siden af deres tiltrædelse nummer. Sekvenser med en stjerne angiver sekvenser gennemgået af UniProt og er generelt mere pålidelige. Vær omhyggelig med at sikre, at alle sekvenser er fuldstændige og præcise.
- Gem de valgte sequences ved at klikke på knappen Download.
- Juster samling af shroom sekvenser ved hjælp Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Klik på knappen "Gennemse" for at vælge filen med shroom sekvenser og derefter skubbe Send.
- Efter justeringen er færdig, klik på "Download Alignment File" knappen.
- Åbn tilpasning multipel sekvens genereret i 1.1.5 ved hjælp jalview (Filer | Input Justering | Fra fil). Inden for den nye justering vindue, farve ved identitet (farve | Procent Identity).
- Beregn forudsigelser af sekundær struktur, forudsigelser af fleksible eller uordnede sekvens, og forudsagde coiled-coil regioner inden for protein (er) af interesse.
- Gå til http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi at beregne dobbeltsnoede forudsigelser. Kopier og sæt den sekvens i Sequence Box og klik på Send.
BEMÆRK: Denne analyse kan tage et par timer at complete. Da shroom sekvenser er ganske store, kan sekvenserne skal opdeles i blokke på mindre end 1.000 aminosyrer til at passe i størrelse begrænsning af webserveren. Ved analyse Shrm2, anbefales det, at de C-terminale 1.000 aminosyrer anvendes som dette afsnit indeholder SHRM SD2 domæne, som vides at indeholde coiled-coil-regioner. Når gentage denne analyse med andre proteiner, anbefales det at bruge fuld længde proteinsekvenser når det er muligt. Hvis det ikke er en mulighed, skal du bruge den største fragment mulig eller dissekere sekvensen baseret på kendte biokemiske eller funktionelle data. - Gå til http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi at beregne dobbeltsnoede forudsigelser. Kopier og sæt den sekvens i Sequence Box og klik på Send.
- Gå til http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi at beregne dobbeltsnoede forudsigelser. Kopier og sæt den sekvens i Sequence Box og klik på Send.
- Kombiner resultaterne af trin 1.1 til 1.2.2 i en enkelt omfattende annotation af Shroom sekvens.
BEMÆRK: Det er stærkt opfordres til også omfatte enhver og alle relevante information, der kan udledes fra litteraturen eller andre kilder om protein funktion eller rensning på dette stadium. - Brug af denne omfattende kommenteret sekvens, forudsige domænegrænser (eller en række mulige grænser) hvor proteinet, forsøger at maksimere bevarelsen og forudsagte strukturelle træk samtidig minimere mængden af uordnede eller fleksibel sekvens. Hvis kendt, bør det resulterende protein bevarer de funktionelle egenskaber af interesse.
2. Express og rense Proteiner med Domain Boundaries identificeret i Afsnit 1
BEMÆRK: Målet med dette afsnit er at bruge en række hurtige og let kvantificerbare analyser til at screene hypotetiske domænegrænser genereret i afsnit 1.
- Anvendelse af standard molekylærbiologiske teknikker, generere et ekspressionsplasmid med den ønskede kodende sekvens i ramme inden for His 10 -mRuby2-XH2 plasmidet (se figur 3 for vektoren kort ennd yderligere detaljer).
- Test ekspressionsniveauer for hver ekspressionsplasmid under anvendelse BL21 (DE3) E. coli eller en anden egnet ekspression stamme i autoinduktion medium 1 ved stuetemperatur i 18-24 timer.
- Omdan ekspressionsplasmider samt et tomt plasmid kontrol i BL21 (DE3) efter instruktionerne, der fulgte med cellerne eller ved hjælp af robust transformation protokol, som den her (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -transformation /).
- Fra frisk transformerede plade, vælge en enkelt koloni og vokse en 5 ml starterkultur ved 37 ° C natten over i lysogeni Broth (LB) medium med 34 ug / ml kanamycin.
- Den følgende dag, pelletere kultur og vask pellet med frisk LB.
- Tilføj starterkulturen til 50 ml autoinduktion medier med 34 ug / ml kanamycin. Tillad kulturen at vokse til mætning ved enten stuetemperatur eller 37 ° C. Typisk vokse i ~ 18-24 timer.
- pellet celles og fryse de resulterende cellepellets ved -80 ° C uendeligt inden oprensning.
- Sammenlign helcelleekstrakter fra hvert udtryk stamme og den tomme vektor kontrol ved SDS-PAGE for at bestemme den stamme, der mest effektivt frembringer den ønskede fusionsprotein. For hans 10 -mRuby2-Shroom SD2 fusionsproteiner, køre 10% SDS-PAGE geler ved 180 V for ~ 50 min eller indtil farvefronten når bunden af gelen 22.
- Stain gel med Coomassie Blue for at visualisere totale cellulære proteiner inden for hver stamme 23.
- Foretage en første affinitetschromatografi trin på hver stamme, der med succes udtrykt mRuby2-fusionsprotein. Typisk udføre oprensning trin 2.3.2-2.3.7 ved stuetemperatur, medmindre proteinet vil drage fordel af ændrede betingelser, såsom oprensning ved 4 ° C.
- Optø cellepellets fra trin 2.2.5.
- Resuspender hver cellepellet i 1,5 ml lyseringspuffer (10% glycerol, 500 mM NaCl, 40mM imidazol, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM beta-mercaptoethanol). Supplement lysis buffer med proteasehæmmere efter behov.
- Tilsæt 30 pi 10 mg / ml lysozym og inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter. Soniker følge instruktionerne for instrumentet, der anvendes.
- Overfør i et 1,5 ml rør og centrifugeres i en bordcentrifuge i 30 minutter ved 14.000 xg for at pelletere uopløseligt materiale eller ikke-lyserede celler. Spare både supernatant og pellet til efterfølgende analyse via SDS-PAGE.
- Udfør nikkel affinitetsoprensning, inkubere den opløselige fraktion med 100 pi Ni-NTA perler. Inkuber perlerne med opløselig lysat i 5-10 min, invertere flere gange for at blande perlerne.
- Centrifuger ved 800 x g i 30 sekunder i en bordcentrifuge til pelletering af perlerne. Følg dette ved at vaske pelleten 3-5 gange med lyseringsbuffer at rense ud uspecifikke kontaminanter.
- Elute Ruby fusionsproteinet fra perlerne med lyseringsbuffer suppleret med 1M imidazol.
- Brug SDS-PAGE for at sammenligne adfærd Hans-mRuby2-shroom proteiner i "quick and dirty" rensning ovenfor.
3. Karakterisere Protein Prøve at identificere dem med fordelagtige egenskaber
- Brug et spektrofotometer sæt ved 280 nm for at måle koncentrationen af Ruby fusionsproteinet, og derefter vurdere homogeniteten af prøven ved at indlæse 1-5 ug fusionsprotein på en indfødt PAGE-gel 24. Kør 10% Native PAGE-gel ved 4 ° C i 140 minutter ved 175 V.
- Billede det native PAGE under anvendelse af en billeddanner udstyret til at visualisere fluorescens, observere hvor mRuby-mærkede fusion migrerer i dette assay.
BEMÆRK: Vær omhyggelig med at observere fusionsprotein, der sidder fast i brønden, da dette protein er sandsynligvis sammen. Hvis en fluorescens imager ikke er tilgængelig, kan man ofte visualisere og billeddata koncentreret prøver af Ruby tagget protein under en sort lys eller med en UV lyskasse.
- Billede det native PAGE under anvendelse af en billeddanner udstyret til at visualisere fluorescens, observere hvor mRuby-mærkede fusion migrerer i dette assay.
- Udfør begrænset proteolyse for at identificere stabilt foldede domæner. Inkuber 95 pi Ruby-SHRM SD2 fusion på ~ 1 mg / ml med 5 pi 0,025% Subtilisin A.
- Prøve reaktionen ved tidspunkter på 0, 0,5, 2, 5, 15, 60 og 120 min, fjerne 10 pi fra reaktionen for hvert tidspunkt og visualisere forløbet af reaktionen via SDS-PAGE under anvendelse af en 15% acrylamidgel .
- Farv med Coomassie Blå som i trin 2.2.7 og vurdere, om der kan identificeres en protease-resistente arter.
- Integrer data fra rensning effektivitet, adfærd i indfødte SIDE, og begrænset proteolyse på de delvist oprensede mRuby2-shroom fusionsproteiner i en omfattende vurdering af den samlede opførsel af disse proteiner i opløsning.
- (Valgfrit) Hvis en egnet funktionel analyse er tilgængelig, så tjek for aktivitet på dette punkt.
4. producere høj kvalitet Krystaller af den dobbeltsnoet SD2Domæne fra Shroom
BEMÆRK: Alle trin i afsnit 4.1 udføres ved stuetemperatur, medmindre proteinet ville have gavn af oprensning ved en anden temperatur, sædvanligvis 4 ° C.
- Brug af 50 ml vækster som et groft skøn over ekspression og oprensning potentiale, udføre storstilede udtryk for mRuby2-Shroom SD2 med det mål at opnå 5-20 mg helt oprenset prøve. Typisk 2 l kultur giver tilstrækkelig udgangsmateriale. Efter vækst pellet cellerne ved centrifugering ved 8000 x g i 10 min.
- Pelleten resuspenderes fra 2 L vækst i lysepuffer som før, under anvendelse ~ 2 ml lysis per gram frosne cellepellet hvis hjælp lysozym til lysis. Alternativt resuspender på ~ 8 ml / g pellet, hvis du bruger en homogenisator eller fransk presse. Pelletere cellerester via centrifugering ved 30.000 xg i 30 min.
- Batch binder den opløselige fraktion fra 4.1.1 hjælp 10 ml Ni-NTA-harpiks. Hæld i passende tyngdekraft kolonneog tillade ubundne proteiner løbe fra.
- Vask af resin 3-5 gange med 40 ml lysepuffer efterfulgt af en vask med lyseringsbuffer suppleret til 1 M NaCl.
- Vask harpiksen med 40 ml lysisbuffer tilsat 80 mM imidazol.
- Elueres Ruby-Shroom fusionsprotein med 40 ml lysisbuffer suppleret til 1 M imidazol. Manuelt fraktionere eluerede protein i 4-10 ml fraktioner.
- Bekræft fraktioner indeholdende Ruby-Shroom fusionsprotein under anvendelse af 10% SDS-PAGE.
- Dialyse passende fraktioner (typisk fraktioner der 2-4) i 8% glycerol, 250 mM NaCl, 15 mM imidazol, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM β-ME, ved hjælp af 6-8 kDa MWCO dialyse slangen. Tilsæt 1 mg TEV protease for hver 25-50 mg af fusionsprotein. Dialyse natten over ved stuetemperatur med langsom omrøring.
- Gentag nikkel affinitetsoprensning trin 4.1.2. til 4.1.6. Den Shroom SD2 domænet bør nu forblive i den ubundne fraktion, mens Hans 10 -mRuby2 forbliver bundet tilharpiksen og vil blive fundet i elueringsfraktionerne. Bekræft denne anvendelse af 12% SDS-PAGE farvning med Coomassie Blue.
- Dialysere fraktioner indeholdende Shroom SD2 domæne i 8% glycerol, 100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, 5 mM p-mercaptoethanol puffer natten over.
- Udføre anionbytterkromatografi 25 under anvendelse af et FPLC, og eluering med en NaCl-gradient 0,1-1,0 M NaCl. Analyser fraktioner anvendelse af 12% SDS-PAGE.
- Ved hjælp af en spindekoncentrator (MWCO på 10 kDa eller derover afhængigt af proteinet blev undersøgt), koncentreres topfraktioner til ~ 0 mg / ml, og derefter udføre gelpermeationskromatografi 26, analysere topfraktioner via 12% SDS-PAGE.
- Pool topfraktioner og dialyseres i 20 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 2% glycerol, 1 mM β-ME, og koncentrer til 10 mg / ml før krystallisation.
Valgfrit: Under dette trin fjernes 5 pi prøver ved koncentrationer på 1, 2, 5 og 10 mg / ml i løbet af koncentrering af prøven.Kør en indfødt SIDE belastning 2-5 pi af hver prøve at se på adfærd af prøven i dette trin.
- Screene et lille array af 12 betingelser for at identificere en optimal proteinkoncentration til krystallisation forsøg. Sammensætningen af disse betingelser er beskrevet i figur 7.
- Under anvendelse 24-brønd siddende dråbe krystallisationskemikalier bakker, udføre krystallisations- forsøg under anvendelse af dampdiffusion metode, pipettering 500 ul af hver af de 12 betingelser i separate brønde efterfulgt af dråber, der oprindeligt indeholder 1 pi brønd opløsning og 1 pi proteinprøve på dækglassene . Se venligst 27 for yderligere oplysninger om denne teknik.
- Hurtigt forsegle bakken med klar tape og flytte bakken til en passende temperatur kontrolleret miljø, der er vibrationsfri. Det anvendte kan variere temperatur, men 4 ° C, 16 ° C, og 20 ° C er helt almindelige.
- Undersøg dråberne i bakkerne over de næste 3 days anvendelse af et mikroskop med op til 100X forstørrelse. Ved slutningen af den 3-dages periode, score hver dråbe som ikke indeholder nedbør (klar), let nedbør, kraftig nedbør (brun), eller krystaller. En egnet proteinkoncentration bør ikke indeholde mere end 6 tunge udfældninger.
- Brug af proteinkoncentration identificeret i 4,2, screene et bredt udvalg af kommercielt tilgængelige krystallisering skærme. Anvendelsen af en flydende håndtering eller krystallisering robot spænder fremskynder denne proces samtidig minimere fejl i dråberne. Det kræver langt mindre protein samt, så brugeren kan screene flere betingelser med en enkelt prøve.
- Forbedre oprindelige betingelser identificeret fra brede skærme ved systematisk at variere hver af variablerne i krystallisering slip fra 24-godt screening bakker som før.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et diagram, der afbilder arbejdsgang anvendes i dette system er vist i figur 1 og omfatter tre hovedfaser. Computational analyse af sekvensen anvendes til at udvikle hypoteser om de domænegrænser af coiled-coil protein af interesse. Et eksempel på en kommenteret analyse af Shrm2 SD2 domænet er vist i figur 2. I dette diagram, var målet at identificere mulige domænegrænser for en konserveret domæne ved C-terminalen af cytoskeletale regulator Shroom kaldet SD2. Fra denne analyse var tre forskellige sæt af hypotetiske domæne grænser blev genereret indeholder coiled-coil fragmenter, der spænder over hele bevaret SD2 eller minimale fragmenter nær C-terminalen, der endte som de bedste kandidater til krystallisering. Kandidater identificeret fra sekvensanalysen er derefter hurtigt afprøvet i lille skala under anvendelse af et protein fusion med mRuby2 (figur 3) for effektiv analyse. Repræsentativ lille skala (50 ml kultur) oprensninger fra to Hans 10 -mRuby2-mærkede proteiner er vist i figur 4. I denne figur adfærd et uopløseligt protein er indlysende i forhold til dens opløselige modstykke. Dårligt udtrykker eller uopløselige proteinfusioner nemt og hurtigt identificeret på denne måde. Biokemiske analyser af proteinfragmenter ved begrænset proteolyse er vist i figur 5 for en række fragmenter under anvendelse visne Ruby beskrevne system eller med isolerede og oprensede Shroom SD2 domæner. I figur 5A, to varianter af muse SHRM SD2 svarende til hypotetiske domænegrænser # 2 og # 1 i figur 3 blev spaltet under anvendelse af en gradient af protease-koncentration fra (0-1,0%) i 30 min ved stuetemperatur. Begge disse blev effektivt nedbrudt til en række mindre produkter ved moderate enzymkoncentrationer. Figur 5B viser same eksperiment udføres ved hjælp af hypotetiske grænse # 3 fra Drosophila SHRM SD2. Dette protein har krystallisere og dets struktur er blevet beskrevet 19. Proteolytisk analyse kan også være nyttige i forbindelse med behandlingen Ruby-fusioner, som genereres fra protokollen ovenfor. Som vist i figur 5C, en Ruby fusionsprotein med humant Shrm2 SD2 (1427-1610) blev fordøjet med en høj koncentration (0,025%) af den ikke-specifikke protease Subtilisin ved stuetemperatur i de angivne tidspunkter. Her linkeren mellem Ruby og SHRM blev straks spaltet som ville forventes. Derudover blev mindre produkter dannet indikerer dette protein har to andre følsomme regioner protease imidlertid Nedbrydningsprodukterne som er produceret inden for 2 min forblev stort set intakt i hele resten af eksperimentet angiver proteinet er faktisk ret stabilt.
En komplementær tilgang er vist ved hjælp af indfødte SIDE analyser i figur 6. I figur 6A, Ruby-tagget humant SHRM SD2 (1427-1610) såvel som protein indeholdende de anførte punktmutationer inden SHRM analyseres ved nativ PAGE. I dette eksperiment vildtype-proteinet (som danner krystaller) løber som to distinkte bånd, mens de tre mutanter, der ikke krystalliserer har dramatisk anderledes adfærd. For at demonstrere, at systemet også kan være nyttige på proteinkomplekser blev en række Shroom-Rock-komplekser analyseret ved nativ PAGE i figur 6B. I dette tilfælde blev det samme fragment af human Shrm2 SD2 (1427-1610), der anvendes til at bidrage til at afklare analysen, mens forskellige fragmenter af menneskelig Rock blev udnyttet. Denne tilgang foreslog, at komplekser dannet ved hjælp Rock 700-906 og 746-906 havde flere arter, var smeary, og mindre homogen. Komplekser udnytte 788-906 blev forbedret, om end ikke dramatisk, og denne art var i stand til at krystallisere, selv om krystaller tog mange uger til at danne og conindeholdt nedbrudt Rock protein. Komplekser genereret ved hjælp Rock 834-913 dannede en enkelt og mere ensartede arter på gelen og let krystalliseret natten over. Figur 7 viser et sæt fælles krystallisationsbetingelser, der bruges til at informere om opførslen af proteinet prøven i krystallisations- forsøg, og kunne anvendes generelt med ethvert protein. Ideelt vil der opnås en blanding af klare og udfældende betingelser. Proteiner, der ikke danner bundfald kræver høje koncentrationer eller strengere buffermidler betingelser, mens de, der udfældes i mange betingelser bør anvendes ved en lavere koncentration protein eller med bufrende betingelser, som fremmer proteinopløselighed.
Figur 1: Workflow Diagram. En generaliseret afbilder integrationen af beregningsmæssige sekvensanalyse og biokemiske ogandre våde lab teknikker i en omfattende strategi for afgrænsningen domæne grænser og identificere protein fragmenter for krystallisering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Annotated sekvensanalyse for coiled-coil SD2 domæne fra Shroom. En overlejring af beregningsmæssige analyser til Shroom SD2 domæne, herunder en tilpasning multipel sekvens genereres af CLUSTAL omega og farvet af sekvens identitet inden jalview (trin 1.1). Også inkluderet er forudsagt sekundær struktur, uordnede sekvens forudsigelser, og coiled-coil forudsigelser af Shroom SD2 domæne (trin 1.2). Hypotetisk domæne grænser (Trin 1.3) er angivet som er de observerede grænser og sekundær strukturelementer som afsløret ved efterfølgende krystallografiske analyse 19. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Diagram over His 10 -mRuby2-ekspressionssystem. (A) Skematisk af ekspressionsvektoren His 10 -mRuby2-XH2 vektor, der anvendes i denne undersøgelse. (B) Diagram af det multiple kloningssted fra denne vektor. Protein-kodende sekvenser er typisk indsat i denne vektor via BamHI og EcoRI kloningssteder. Den ekstreme C-terminalen af mRuby2 proteinet er vist i rødt, er TEV proteasespaltningssted angivet med parentes og med spaltningsstedet vist som en rød trekant. En linker-sekvens mellem mRuby2 og TEV site er vist i cyan.Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative lille skala oprensninger af to mRuby2 mærkede fusionsproteiner. (A) Et billede af prøver af bakteriekultur udtryk Ruby SHRM SD2 eller en ubeslægtet Ruby fusionsprotein kendt for at være uopløselige er afbilledet. En separat kultur udtrykker et protein uden en Ruby-tag er vist til sammenligning. (B) Den opløselige fraktion fra kulturerne ovenfor blev afbildet efter lysis og centrifugering ved 30.000 xg i 30 min, hvilket viser visualiseringen af opløseligt Ruby-SHRM SD2. Billede (C) i de Ni-NTA perler efter binding og efterfølgende vasketrin indikerer, at Ruby-SHRM SD2 bliver immobiliseret påperlerne. (D) Prøver af vaske- og elueringstrin som beskrevet i trin 2.3.6 og 2.3.7 viser, at Ruby-SHRM SD2 fusion forbliver bundet til harpiksen, mens i nærvær af op til 80 mM imidazol og effektivt elueres fra søjlen med 1 M imidazol elueringspuffer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Begrænset proteolyse af kandidat SD2 domæner fra forskellige shroom proteiner. En sammenligning af fire SD2 domæner fra forskellige shroom proteiner. (A og B) De angivne SHRM SD2 fragmenter blev inkuberet med en koncentrationsgradient af proteasen trypsin fra 0 til 1,0 vægt-%, og resultaterne analyseret ved SDS-PAGE. Forholdet af dette protein fragment with de hypotetiske grænser er indikeret. (C) SDS-PAGE-analyse af begrænset proteolytisk fordøjelse af His 10 -mRuby2-Shroom SD2 fusionsproteinet under anvendelse af tidsforløbsfremgangsmåden beskrevet i protokollen. Reaktionen indtraf med 0,025% trypsin ved stuetemperatur. Fordøjelse af linker mellem Ruby og Shroom SD2 er hurtig og fungerer som en intern kontrol. Et formodet nedbrydningsprodukt, der co-renser med His 10 -mRuby2-Shroom SD2 fusionsprotein er angivet (*). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Observation ændringer i protein adfærd ved at anvende native gel. (A) 10% Native PAGE viser effekten af en mutant, der ændrer egenskaberne af mRuby2-Shroom SD2. Under disse betingelser SHRM SD2 kører som to adskilte bånd, mens angivne punkt mutanter i SD2 vise en række afvigende mønstre migration. (B) En sammenligning af Shroom SD2-Rock-komplekser dannes under anvendelse af forskellige versioner af Rock og analyseret ved nativ PAGE. Komplekser mellem Shroom SD2 og de angivne fragmenter af Rock-kinase (både coiled-coil proteiner) blev opløst ved nativ PAGE. Krystaller blev opnået for den komplekse indeholder Rock 788-906 efter mange uger, men kompleks indeholdende Rock 834-913 krystalliserede hurtigt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Hurtig primære screening til krystallisation. (A) En hurtig skærm af fælles krystallisation cold anvendes til at vurdere opførslen af proteinet prøven i krystallisations- forsøg. (B) Eksempler på den simple scoring matrix for at vurdere krystallisations- dråber. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne protokollen er designet til at hjælpe brugeren identificere domæne grænser inden for store coiled-coil proteiner for at lette deres krystallisering. Protokollen bygger på en holistisk inkorporering af en række data fra beregningsmæssige forudsigelser og andre kilder for at generere en serie af potentielle domænegrænser. Disse efterfølges af et sæt af biokemiske eksperimenter, som er hurtig og billig, og som anvendes til yderligere at forfine disse indledende hypoteser. Ved hjælp af denne metode, kan brugeren hurtigt fjerne potentielle protein fragmenter, der er uønskede, og fokusere mere opmærksomhed på bedre kandidater og dermed forbedre udsigterne til at opnå krystaller.
Der er mange vigtige skridt inden for denne teknik, men ingen som kritiske for produktionen af krystaller som udvikling af den oprindelige sæt af hypotetiske domænegrænser. Dette trin omfatter en række beregningsmæssige metoder, samt information obindeholdt fra litteraturen eller funktionelle data, når de foreligger. Der bør udvises forsigtighed for at undgå at bruge strategi for at finpudse straks ned til singlen "bedste" løsning, da der er i øjeblikket ingen metode på plads til at vedhæfte en kvantificerbar tillid værdi til nogen af forudsigelserne. I stedet er det bedst anvendes som en metode til hurtigt at identificere et lille sæt af mulige domænegrænser som skal eksperimentelt verificeret.
Egenskaberne af coiled-coil-proteiner, der kan analyseres med denne protokol, er ganske bredt. Fra et beregningsmæssige perspektiv styrken af coiled-coil forudsigelser begrænset under 20 aminosyrer, og som nævnt i trin 1.2.1, coiled-coil regioner større end 1.000 aminosyrer vil skulle opdeles i flere sektioner til analyse ved DISOPRED. Vi se senere begrænsning som midlertidig, da det pålægger webserver og kan ændre som metoden bliver opgraderet i fremtiden. Den efterfølgende biokemisk analyse kan imidlertid lidepå forskellige måder. Først interne loops eller regioner er overfølsomme over for proteaser kan gøre prøven synes at være mindre stabil end den egentlig er. Stabile proteiner, der har spaltede sløjfer eller på anden måde hakkede af protease bør stadig give en stabil udseende på indfødte SIDE, hvorfor det anbefales, at brugeren udforske begge strategier. Native SIDE kan være vanskeligt for nogle proteiner, dog, enten fordi de er meget lange og migrere langsomt ind gel eller fordi deres særlige afgift kan gøre dem køre den modsatte retning ud af gelen helt. I disse tilfælde kan det være nyttigt at udforske forskellige buffer betingelser for de indfødte PAGE-gel system.
Mens fokus i arbejdet præsenteret her har været på store coiled-coil indeholdende proteiner, kan denne protokol anvendes til næsten ethvert protein med meget få tilpasninger. Den primære tilføjelse til kugleformede proteiner ville være tilføjelsen af domænet forudsigelse software som pDomTHREADER 28 </ sup> eller DomPred 29 for at lede efter domæne grænser, og tertiære struktur forudsigelser såsom Phyre2 30 at øge den prædiktive effekt af sekvensanalyse. Derudover er der mange algoritmer til rådighed til at udføre sekundære struktur forudsigelser og uordnede forudsigelser, og medtagelse af yderligere algoritmer kunne være nyttige. Kugleformede proteiner ofte besidder enzymatisk aktivitet eller andre funktionelle udlæsninger, der ville give vigtige yderligere oplysninger under mål udvælgelse. Endvidere kan moderate eller højt gennemløb teknikker inkorporeres efter behov. For eksempel, billige systemer til 1-2 ml kulturer og metal affinitet oprensninger i 96-brønds format er let tilgængelige 31. Endelig er brugen af robotteknologi til opsætning stort antal krystallisationseksperimenter bruger minimal prøve at blive rutine, men effektiv drift af robotsystemer er baseret på den adfærd godt karakteriserede proteinprøver. Additional modifikationer af denne protokol kunne omfatte prøveudtagning forskellige affinitet tags. Mange forskellige fluorescerende tags er tilgængelige, eller His, GST, Thioredoxin-, Strep-, og MBP- er blandt snesevis af muligheder, hvis en fluorescerende tag ikke er nødvendig eller hensigtsmæssig.
Når du udfører denne procedure, skal brugeren være opmærksom på den virkning, at mRuby2 tag kan have på brugernes protein af interesse. Anekdotiske beviser fra at bruge dette tag på en række forskellige fusioner støtter, at mRuby2 undertiden vil binde ganske stramt til proteinet af interesse, forbliver bundet gennem flere kromatografiske trin. Denne adfærd er naturligvis uønsket, men utilsigtede Ruby komplekser kan normalt adskilles og fjernes chromatografisk. Det er uklart, om dette er en chaperone-lignende opførsel som det er blevet observeret for MBP 32.
Efter opnåelse af krystaller, er der stadig mange udfordringer, der almindeligvis står over for oplysninger om oprindelseslandeførte-coil proteiner, som ikke er behandlet i denne protokol. Den mest almindelige er fattige diffraktion kvalitet, enten på grund af ufuldkomment dannet gitre eller anisotropisk diffraktion. Der er værktøjer på plads til at hjælpe med anisotropisk diffraktion 33, og disse har været afgørende for at løse nogle coiled-coil strukturer 18,20. Mange krystal patologier er desværre vanskeligt at overvinde hurtigt, derfor er det ofte klogt at søge efter yderligere krystal former med forbedrede diffraktion egenskaber. Dette lettes af robot screening af tusinder af betingelser. Alternativt er der mange post-krystallisationsmetoder til forbedring diffraktion kvalitet, såsom dehydrering, eller såning 34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| Lysozyme | Spectrum Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA resin | Life Technologies | 25216 | |
| SubtilisinA | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Overnight Express Autoinduction System 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| Lysogeny Broth powder | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
References
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
- Chapman, T. Protein purification: pure but not simple. Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. Predicting coiled coils from protein sequences. Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).
- Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils. J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).
- Lupas, A. N., Gruber, M. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).
- Hernandez Alvarez, B., et al. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).
- Slabinski, L., et al. The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics. Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).
- Slabinski, L., et al. XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
- Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure. Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).
- Hildebrand, J. D. Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network. J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).
- Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins. J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).
- Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction. Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).
- Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).
- Das, D., et al. The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice. Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).
- Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).
- Mohan, S., et al. Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology. PLoS One. 8 (12), e81075 (2013).
- Mohan, S., et al. Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction. Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).
- Tu, D., et al. Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I. PLoS One. 6 (3), e18080 (2011).
- Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7, 539 (2011).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Jungbauer, A., Hahn, R.
- Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).
- Giege, R. A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day. FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).
- Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination. Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).
- Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure. Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).
- Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
- Elsliger, M. A., et al. The JCSG high-throughput structural biology pipeline. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).
- Bach, H., et al. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies. J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).
- Strong, M., et al. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).
- Heras, B., Martin, J. L. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).
