Summary
이 프로토콜은 젤라틴과 콜라겐 I로 구성된 2D 혼합 매트릭스를 준비하는 방법과 선형 invadosomes를 연구하기 위해 3D 콜라겐 I 플러그를 작성하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 선형 invadosome 형성, 매트릭스 저하 활동 및 기본 세포와 암세포 라인의 침략 기능에 대한 연구를 허용합니다.
Abstract
세포 접착, 이동 및 침입은 많은 생리적 및 병리학 적 과정에 관여한다. 예를 들어, 전이가 형성되는 동안 종양 세포는 혈액이나 림프관에 도달하기 위해 해부학적인 장벽을 넘어 침입하고 주변 조직을 통해 이동해야합니다. 이것은 세포와 세포 외 기질 (ECM) 사이의 상호 작용을 필요로합니다. 세포 수준에서, 대부분의 암세포를 포함하여 많은 세포가 ECM을 분해 할 수있는 F- 굴지 기반 구조 인 침입자를 형성 할 수 있습니다. Invadosome은 matrix metalloproteinases (MMPs)를 모집하고 활성화시키는 돌출 액틴 구조입니다. ECM의 분자 구성, 밀도, 조직 및 강성은 침입자 형성 및 활성화를 조절하는 데 중요합니다. 시험 관내 에서, 젤라틴 분석은 침입자 분해 작용을 관찰하고 정량화하는데 사용되는 표준 분석법이다. 그러나, 변성 콜라겐 I 인 젤라틴은 생리적 매트릭스가 아니며준비. I 형 콜라겐 원 섬유를 사용하는 새로운 분석법이 개발되어이 생리 학적 매트릭스가 침입자의 강력한 유도제임을 입증합니다. 콜라겐 원 섬유를 따라 형성되는 침입자는 섬유상에서 선형 구조로 인해 선형 침입자로 알려져 있습니다. 또한, 선형 invadosomes의 분자 분석은 discoidin 도메인 수용체 1 (DDR1)은 그들의 형성에 관여 수용체임을 보여 주었다. 이러한 데이터는 세포와 ECM 간의 복잡한 상호 작용을 이해하기 위해 생리 학적으로 관련이있는 매트릭스를 사용하는 것이 중요하다는 것을 분명히 보여줍니다.
Introduction
세포 외 기질 (ECM) 재 형성은 혈관 신생 및 종양 세포 침범과 같은 생리적 및 병리학 적 과정 중에 발생한다. 생리 조건에서 대부분 조혈 계통의 많은 세포 유형이 ECM 요소를 분해 할 수 있습니다. 예를 들어, 대 식세포는 조직에 도달하기 위해 해부학적인 장벽을 넘을 수 있으며 파골 세포는 칼슘 항상성을 보장하기 위해 골질을 분해합니다. 전 세계적으로 신체의 모든 매트릭스가 물리적, 화학적 특성을 유지하기 위해 갱신됩니다. 암 조직에서 종양의 미세 환경 구성이 변경됩니다. 예를 들어, 유방암과 폐암에서 I 형 콜라겐은 과발현되어 종양 주위에 축적됩니다. 더욱이,이 축적은 전이를 일으킬 위험도가 높아진다. 암 전이는 암 세포가 ECM을 저하시키고 인접 조직을 침범하는 능력에 달려 있습니다.
그만큼세포의 침입 성 활동은 침입자 (invadosome)로 알려진 특이한 액틴 풍부 구조에 기인한다. 이 용어는 정상 세포와 암 세포 ( 예 : 대 식세포, 내피 세포, MDA-MB-231 유방암 세포주와 같은 암세포)에 각각 존재하는 포도 솜 (podosomes)과 인다도 포디 아 (invadopodia)를 포함합니다. 시험 관내 에서, invadosome은 점, 집계, 또는 장미와 같은 다양한 형태로 구성 될 수 있습니다 3 . 고전적으로, invadosomes은 integrins과 vinculin 4 와 같은 접착 플라크 분자로 둘러싸인 scaffold protein Tks5와 cortactin과 같은 여러 단백질을 함유 한 F-actin 코어로 구성됩니다. 최근 Tks5와 RhoGTPase Cdc42가 기능성 침입자의 최소 분자 표지로 사용될 수 있음이 밝혀졌습니다 5 . 이러한 구조는 MT1-MMP 및 MMP-2와 같은 특정 메탈로 프로테아제 단백질의 동원 및 활성화를 통해 ECM을 분해 할 수있다. 이전 연구에서 I 형 콜라겐 원 섬유와 I 형 콜라겐 원 섬유의 특이 적 수용체 인 디스코 딘 도메인 수용체 1 (DDR1) 사이의 상호 작용이 선형 침입자라는 새로운 종류의 침입자를 형성한다고보고했습니다. Linear invadosome은 I 형 콜라겐 원 섬유에 따라 형성된다. 이러한 구조는 MT1-MMP / MMP2의 동원 및 활성화를 통해 I 형 콜라겐 섬유질을 분해 할 수 있습니다. 또한, 그들의 형성은 Tks5와 Cdc42 5 에 달려있다. 시험관 내 에서, 우리는 선형 invadosomes의 존재와 DDR1의 형성과 활동 8 의 참여를 보여 주었다 : i) 형광 젤라틴 코팅 coverslips, ii) 형광 타입 I 콜라겐 피 브릴 코팅 된 coverslips, 그리고 iii) 3D 타입 I 콜라겐 플러그. 다른 행렬의 사용으로 인해 우리는 공부할 수 있었고 성격도 좋았습니다.선형 invadosome 형성과 그들의 분해 활성을 감소시킨다. 7 , 8 .
마지막으로 침입 세포의 생물학적 특성을보다 잘 이해하기 위해 종양 미세 환경 조성의 복잡성을 모방 한 2D 및 3D 배양 시스템에서 ECM 구성 요소의 조합을 사용했습니다. 아래는 2D 및 3D 배양 시스템에서 젤라틴 / I 형 콜라겐으로 커버 슬립을 코팅하기위한 프로토콜입니다.
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Protocol
참고 : 고정하기 전에 모든 단계는 멸균 층류 후드에서 완료됩니다.
1. 2D 매트릭스
참고 : 2D 행렬은 침입자를 형성하는 세포의 비율과 세포 당 매트릭스 분해 영역을 결정하는 데 사용됩니다.
그림 1 : 프로토콜. 젤라틴 및 콜라겐 I 매트릭스를 제조하는 데 사용 된 프로토콜 요약. 젤라틴 매트릭스 만 만들거나 젤라틴과 콜라겐 혼합 매트릭스를 만들 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 젤라틴 매트릭스
참고 : 형광 젤라틴 매트릭스는 매트릭스 분해를 정량화하는 데 사용되며 비 형광 젤라틴은 콜라겐 I 섬유의 접착을 촉진하는 데 사용됩니다. 형광 젤라틴 매트rices는 또한 podosome 및 invadopodia 연구에 사용됩니다 ( 그림 1 참조).- 멸균 층류 후드 아래에서 작업 영역에 parafilm (20cm x 15cm) 조각을 놓고 70 % 에탄올로 소독합니다.
- 1 ㎝ 간격으로 줄 지어 1 ㎎ / mL 젤라틴의 분액 20 μL 액적; 방울 조직에 대해서는 그림 1 을 참조하십시오.
- 각 20 μL 젤라틴 방울을 압력솥 유리 coverslip (직경 12 mm)로 덮으십시오.
- 실온에서 20 분 동안 품어 낸다. 젤라틴이 형광등 인 경우 빛으로부터 보호하십시오.
- 1 분 1 초 인산염 완충 식염수 (PBS)에 0.5 % 글루 타르 알데히드 40 μL의 작은 방울을 각각 1.1.3 단계의 커버 슬립 줄 아래 약 1 cm 간격으로 배치합니다.
주의 : 글루 타르 알데히드는 독성 정착 제입니다. 장갑을 착용하고 흡입하지 마십시오. - 보석 포셉을 사용하여 각 젤라틴 코팅 coverslip을 glutaraldehyde 방울로 이동하십시오.
참고 : Itparafilm에 작은 젤라틴 물방울이 남는 것이 정상입니다. 이것을 다른 실험에 다시 사용하지 마십시오. - 실온에서 40 분 동안 품어 낸다. 형광 커버 슬립의 경우 빛으로부터 보호하십시오.
- 24 잘 세포 배양 접시를 가지고 멸균 1X PBS의 500 μL로 각 우물을 작성하십시오. 각 우물에 coverslips, 젤라틴면을 올려 놓으십시오.
- 5 분 각각에 대해 1x PBS로 두 번 씻으십시오.
참고 :이 단계에서 coverslips는 실험에 사용하거나 4 ° C에서 1x PBS에 저장할 수 있습니다. 비 형광 coverslips은 일주일 동안 저장할 수 있으며, 형광 coverslips은 48 시간 동안 저장할 수 있습니다.
- 섬유소 콜라겐 I 형 매트릭스
참고 : 섬유소 콜라겐 I 형 매트릭스는 선형인데 도좀 형성 및 관련 매트릭스 분해를 연구하는 데 사용됩니다. 형광 콜라겐 I과 비 형광 젤라틴 coverslips의 조합은 콜라겐 섬유와 invadosome 마커를 colocalize하는 데 사용됩니다 ( 예 : F - 굴지 나는원적외선 채널, 적색 채널의 콜라겐 I, 녹색 채널의 Tks5, 핵 얼룩의 Hoechst 염료). 반면에 비 형광성 콜라겐 I과 비 형광 젤라틴 coverslips의 조합은 염색 된 침입자 마커의 수를 최대화하기 위해 사용됩니다 ( 예 : 적색 채널의 F- 액틴, 적색 채널의 코르 탁틴, 녹색 채널, 핵 염색을위한 Hoechst 염료). 마지막으로 형광이없는 콜라겐 I과 형광성 젤라틴 coverslips의 조합을 사용하여 젤라틴 관련 분해를 측정합니다 ( 예 : 원적외선 채널의 F- 액틴, 적색 채널의 Tks5, 녹색 채널의 Tks5 및 헴스트 염료 핵 염색을 위해) (그림 1 참조). Hoechst 염료는 핵을 염색하는데 사용되며, 또한 사용 된 세포주에서 정기적으로 수행되는 PCR 검사와 더불어 마이코 플라스마 오염을 검사합니다.- 형광 콜라겐 I
- 0.02 N 아세트산에서 쥐 - 꼬리 힘줄에서 추출한 상업용 콜라겐을 사용하십시오.디. 콜라겐 I의 0.4mg / mL의 최종 농도에서 coverslip 당 500μL의 용액을 준비하는데 필요한 콜라겐의 양을 제거하십시오.
- 콜라겐 I 용액 (nx 500 μL)의 최종 부피를 계산하여 10 μg / mL의 최종 농도로 5-carboxy x rhodamine succinimidyl ester를 첨가한다.
- 위 아래로 pipetting하여 솔루션을 혼합하고 빛으로부터 보호, 실온에서 5 분 품어.
- 칼슘과 마그네슘을 함유 한 1X Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS)으로 최종 부피로 희석하고 직접 사용하십시오.
- 섬유소 콜라겐 나는 coverslip
- 이전에 단계 1.1에서 준비한 비 형광 또는 형광 젤라틴 coverslips를 사용하십시오.
- 칼슘과 마그네슘을 함유 한 1X DPBS에서 0.4mg / mL의 최종 농도로 형광 또는 비 형광 콜라겐 I 용액을 준비합니다.
- 500 μL의 형광 또는 비 형광 콜라겐 I 용액을 추가합니다coverslip 24- 웰 세포 배양 접시에.
- 콜라겐 중합을 위해 37 ° C에서 4 시간 동안 인큐베이션한다.
- 부화 후, 매트릭스를 손상을 피하기 위해 (물론 coverslip에 아닙니다)의 측면에 플레이트와 pipetting 기울여하여 콜라겐 과잉을 제거합니다.
참고 :이 행렬은 저장할 수 없습니다. 과잉 콜라겐을 제거한 직후에 세포에 씨를 뿌린다.
- 형광 콜라겐 I
2. 세포 파종, 배양 시간 및 고정
- 세포 유형에 따라, 적절한 배지에 세포를 준비하고 우물 당 500 μL의 최종 볼륨에 대한 세포를 추가합니다.
- 선형 invadosomes를 형성하고 매트릭스를 저하시키는 세포주의 능력을 특성화하기 위해 선형 invadosome 형성 및 관련 저하 활동의 속도론을 결정하기 위해 콜라겐 I 매트릭스에 4 시간, 12 시간 및 24 시간 동안 세포를 플레이트하십시오.
참고 : 표 1 은 세포주실험실에서 테스트되었습니다.
표 1 : 세포 파종 및 배양 시간 참고. 이 표는 선형 invadosomes를 연구하는 데 사용되는 세포 라인의 비 포괄적 인 목록을 제공합니다. 이것은 매트릭스에 시드 할 세포의 수, 선형 침입자를 관찰하는 데 필요한 시간 및 관련 매트릭스 분해를 관찰하는 데 필요한 시간을 나타냅니다. 선형 침입자는 수명이 짧습니다. 세포의 최대 숫자에서 선형 invadosomes을 관찰 할 수 있도록, 세포는 시간이 짧은 기간 동안 콜라겐 전 매트릭스와 접촉해야합니다. 반면에,보고 된 젤라틴 분해를 시각화 할 수 있으려면 세포는 콜라겐 I 매트릭스와 위에 나열된 것보다 오랜 기간 동안 접촉해야합니다.세포주 coverslip 당 세포의 수 선형 invadosome 부량을위한 모체와의 접촉 시간 선형 invadosome 분해 활성의 정량을위한 matrix와의 접촉 시간 MDA MB 231 40,000 4 시간 12 시간 HUH7 40,000 12 시간 24 시간 HEP 3B 40,000 12 시간 24 시간 서울대 398 호 40,000 12 시간 24 시간 NIH 3T3 src 30,000 4 시간 12 시간 A431 50,000 6시 24 시간 A549 40,000 12 시간 24 시간 후# 160; 노골적인 40,000 12 시간 12 시간 PAE 40,000 12 시간 12 시간 - 세포 배양 배지를 제거한 후,1X PBS에 4 % paraformaldehyde 500 μL 10 분 coverslips을 수정.
- 1x PBS로 두 번 씻으십시오.
- 빛으로부터 보호 된 4 ° C에서 보관하십시오.
3. 면역 형광법
- 신선하게 준비된 용액으로 10 분 동안 세포를 침투시킨다. 1X PBS 중 0.2 % Triton X-100. 이 솔루션을 다시 사용하지 마십시오.
- coverslips를 1x PBS로 두 번 씻으십시오.
- 벤치에 parafilm (20cm x 15cm) 조각을 놓습니다.
- 재료 표 에 설명 된대로 1x PBS에 4 % 소 혈청 알부민 (BSA)에 기본 항체를 희석합니다.
- 한 줄에 1 차 항체 용액을 50 μL 나누어 각각 약 1 cm 간격으로 둡니다.
- 각 coverslip을 물방울에 놓습니다.
- 빛으로부터 보호 된 실온에서 40 분 동안 품어 낸다.
- 잠복기 후, 1x PBS로 두 번 씻으십시오.
- 2 차 항체, phalloidin, Hoechst dye를 1 % BSA 4 %PBS.
- 분량 50μL의 혼합 액을 각각 이전에 행한 것처럼 coverslips의 첫 번째 줄 아래 약 1cm 간격으로 배치합니다.
- 각 coverslip을 물방울에 놓습니다.
- 빛으로부터 보호 된 실온에서 30 분 동안 품어 낸다.
- 부화 후, 1x PBS로 두 번 씻으십시오.
- 증류수로 한 번 씻어서 소금을 제거하십시오.
- 마운팅 매체 중합과 유리 슬라이드에 coverslips를 탑재하십시오.
- 현미경 검사 전에 실온에서 밤 사이에 커버 슬립을 건조시켜 빛으로부터 보호하십시오.
4. 수량
그림 2 : 선형 침입 정량. 매크로는 F - 굴지와 Tks5 얼룩 (형식 : 1,024 X 1,024)의 공 촛점 이미지가 필요합니다. ( A ) 먼저 F-actin 그림을 열고 가면을 만드십시오. ( B ) 그런 다음, openTks5 그림과 그것을 임계 값. 매크로를 적용하십시오. ( C ) 분석 결과는 두 테이블에 나타납니다. 셀당 선형 침입자의 수와 셀의 선형 침입자가 사용하는 백분율 영역과 같은 기타 정보는 요약 테이블에 있습니다. 각 선형 침입자의 크기는 결과 테이블에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 선형 invadosomes를 형성하는 세포의 백분율
- 선형 invadosomes를 형성 셀을 계산, coverslip 당 약 100 세포 (기술 triplicates를 사용). n 당 3,000 개 이상의 세포를 정량화하십시오.
- 세 번의 독립적 인 실험의 평균을 취하여 선형 인베 돌좀을 형성하는 세포의 백분율을 계산하면 900 개의 정량 세포가 생성됩니다.
- 세포 당 선형 침입 크기 및 수
- 보충 매크로와 함께 ImageJ를 사용하십시오.
- 조건 당 3 개의 커버 슬립을 사용하십시오.
- 형광 젤라틴과 Hoechst 얼룩 핵의 coverslip 당 30 이미지를 가져 가라.
- Martin KH et al. 에 설명 된대로 ImageJ 소프트웨어를 사용하십시오 . 9 .
5. 3D 콜라겐 침입 분석
그림 3 : 침입 분석 스키마. 침략 분석 프로토콜 요약. 콜라겐 I은 숙신 이미 딜 에스테르 염료와 가교 결합되어 37 ° C에서 1 시간 동안 중합됩니다. 세포는 혈청이없는 배지에 콜라겐 I 플러그 위에 첨가됩니다. 삽입물은 중간 크기10 % FBS. 콜라겐 I 플러그는 대조군에서 세포 파종 1 시간 후 및 실험 조건에서 세포 파종 3 일 후 세포의 침투 용량을 결정하기 위해 고정시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 콜라겐 I 준비 플러그
- 세포 유형에 따라 젤에 침략의 속도론을 결정하는 첫 번째 실험에 대한 4 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간의 시간 과정을 확인하십시오. 각 실험마다 침입이 일어나지 않을 때 기준 시점으로 1 시간 지점을 추가하십시오.
- 멸균 층류 후드 아래 얼음에 콜라겐 I 솔루션을 준비합니다. 3 개의 Boyden 챔버 인서트 용 용액 500 μL를 준비하십시오.
- 상업용 쥐 - 꼬리 콜라겐 1mg을 흡인하여 2mg / ml 콜라겐 I의 최종 농도를 갖는 용액을 제조하십시오.
- 5- 카르복시 x 로다 민 석신 이미 딜 에스테르를콜라겐 I 용액 (이 경우, 500 μL)의 최종 부피에 대해 계산 된 1 μg / mL의 최종 농도.
- 잘 섞어서 빛으로부터 보호되는 멸균 층류 후드 아래 얼음 위에서 5 분 동안 품어 라.
- 얼음처럼 차가운 1 M 수산화 나트륨 (NaOH)을 얼음 저온의 여과 된 10X PBS와 6.25 μL의 50 μL를 첨가한다.
- 식 443.75 - x μL의 콜라겐 I에 따라 멸균 수를 추가하십시오.
- Boyden chamber insert 당 100 μL의 용액을 첨가하십시오.
- 중합을 허용하기 위해 37 ° C에서 1 시간 동안 품어 낸다.
- 태아 소 혈청 (fetal bovine serum, FBS)이 풍부한 세포 배양 배지를 새로운 우물에 첨가한다. 이 우물에 삽입물을 넣으십시오.
- 콜라겐 위에 씨앗 30,000 개의 세포를 넣고 FBS가없는 배지를 연결합니다.
- 37 ° C에서 세포를 배양 후, 1X PBS에 4 % paraformaldehyde에 30 분 동안 콜라겐 제가 플러그 수정.
- 다음 단계를 제외하고 3 단계에서와 같이 완전한 면역 형광법을 사용하십시오 : 투과 액30 분 동안 10 분이 아닌 1 x PBS에서 0.2 % Triton X-100으로 ze 처리; 각각 40 분 및 30 분이 아닌 1.5 시간 동안 1 차 및 2 차 항체 용액과 함께 배양하십시오. 세포를 국한시키기 위해 F- 액틴 또는 핵에 염색합니다.
- immunofluorescence 후, 삽입물의 멤브레인 주위를 잘라하고 유리 바닥 접시에 콜라겐 내가 플러그를 신중하게 메스를 사용합니다. 콜라겐 I 플러그의 꼭대기가 유리와 접촉되어 있는지 확인하십시오. 플러그의 완전성을 유지하기 위해 삽입 막을 콜라겐 바닥에 붙이십시오.
참고 : 콜라겐 I 플러그는 유리 바닥 접시에 그대로 남아 있습니다. 유리 바닥과 유리 바닥을 감싸는 플라스틱 사이의 깊이는 플러그의 두께와 동일합니다. - 콜라겐 I에 coverslip을 놓고 마개가 막히는 것을 막기 위해 중합 매체를 장착합니다.
- 콜라겐 I 이미지를 이미지화하기 위해 역상 공 촛점 현미경을 사용하십시오. 정상플러그가 접시의 유리 바닥과 접촉합니다.
- 세포 침입을 시각화하기 위해 연결하는 콜라겐의 상단에서 하단까지 z 스택을 얻습니다. 세포가 이미징 분야에 얼마나 깊이 침투 하는지를 조사하여 z-stack의 두께를 결정하십시오. 0.25x의 z- 스텝 크기를 가진 512x512 포맷의 40X 오일 대물 렌즈로 수집을 수행하십시오.
참고 : 참고로, MDA-MB-231 세포의 평균 z-stack은 seeding 3 일 후에 30 μm입니다.
- 세포 침입을 시각화하기 위해 연결하는 콜라겐의 상단에서 하단까지 z 스택을 얻습니다. 세포가 이미징 분야에 얼마나 깊이 침투 하는지를 조사하여 z-stack의 두께를 결정하십시오. 0.25x의 z- 스텝 크기를 가진 512x512 포맷의 40X 오일 대물 렌즈로 수집을 수행하십시오.
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Representative Results
젤라틴과 I 형 콜라겐의 두 가지 유형 ( 그림 1 과 4 )의 조합을 사용하여 선형 침입자로 알려진 새로운 유형의 침입자를 강조했습니다. 이러한 매트릭스의 라벨링은 콜라겐 I 섬유 및 그 분해능에 따른 선형인데 돔 형성의 관찰을 허용한다 ( 도 5 ). 침입 구조의 수는 이전에 설명한 매크로 (단계 4.2)에 의해 정량화 될 수 있으며, 분해 활성도는 Martin 등이 기술 한 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 결정할 수 있다. 및 Diaz et al. 9 , 10 . 혼합 된 매트릭스는 선형 invadosome 형성과 기능에 필요한 수용체로서 DDR1을 정의함으로써 선형 invadosomes의 특성화를 가능하게합니다 ( 그림 6 ).
그림 3 및 7 ). 이 분석을 통해 우리는 z-stack 재구성을 사용하여 이동 한 거리뿐 아니라 콜라겐 I 플러그에 침입 한 세포의 수를 결정할 수 있습니다.
그림 4 : 공 촛점 현미경을 사용하여 젤라틴과 젤라틴 - 콜라겐 I 혼합 매트릭스의 비교. 상단 패널에 형광 젤라틴 coverslips의 조직을 보여주는 도식 표현. ( A ) 공 촛점 z - 스택 재구성은 형광 젤라틴 매트릭스가 coverslip의 전체 표면을 덮는 얇고, 균일 한 레이어를 형성하고 있음을 보여줍니다. ( B ) 혼합 매트릭스에서, coverslips에 형광 젤라틴의 증착 후, 입력 콜라겐 섬유소상단에 중합. 콜라겐 I 피 브릴은 빨간색으로 얼룩 져 있습니다. 콜라겐 I 매트릭스는 커버 슬립에서 두껍고 이질적입니다. 콜라겐 I 섬유의 분포는 콜라겐 I α 사슬의 중합에 의존한다. 눈금 막대 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 젤라틴 및 젤라틴 - 콜라겐 I 매트릭스가 침입자 형성 및 활성에 미치는 영향. 이 검사에 사용 된 세포는 MDA-MB-231 유방암 세포입니다. ( A ) 도식 표현은 상단 패널에 형광 젤라틴 coverslip에 심어 세포를 보여줍니다. 형광의 감소로 인해 분해 영역이 검은 색으로 시각화됩니다. Tks5 염색은 침입 마커로 사용되었습니다. 젤라틴에서는 inv형태를 이루는 adosomes은 점으로 구성됩니다. ( B ) 도식 표현은 젤라틴과 콜라겐 I의 혼합 매트릭스에 시딩 된 세포를 보여줍니다. 콜라겐 I은 빨간색으로 표시되어 있습니다. 타입 I 콜라겐 섬유소의 첨가는 세포가 젤라틴을 분해하는 능력을 증가시킨다. 흥미롭게도, 침입 마커 Tks5가 재조직되고, 도트는 선형 침입자를 나타내는 선형 구조로 대체된다. 형광의 감소로 인해 분해 영역이 검은 색으로 시각화됩니다. 스케일 바 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 젤라틴 및 혼합 매트릭스 조건에서의 invadosomes의 분자 구성 및 구성에 대한 공 촛점 현미경 분석. ( A ) gelatin condition에서 invadosomes는 점으로 구성되어 있고 F-actin (빨간색)은 Tks5 (녹색, 아래쪽 패널)와 함께 현지화되지만 DDR1 (녹색, 상단 패널)과는 동일하지 않습니다. 이들은 고전적인 침입자입니다. 스케일 바 = 5 μm. ( B ) 젤라틴 - 콜라겐 I 혼합 매트릭스 조건에서, DDR1 (녹색, 상부 패널)은 콜라겐 I 피 브릴 (적색, 상부 패널), Tks5 (녹색, 바닥 패널) 및 F- 액틴 (적색, 바닥 패널). 제 1 형 콜라겐 원 섬유는 선형 침입자의 형성을 유도한다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7 : 콜라겐 I 플러그에서의 MDA-MB-231 세포의 세포 침윤 분석. 세포를 파종 한 지 1 시간 후, 대조군 삽입물이 고정되고 염색된다. ( A ) z- 스택 a콜라겐 I 플러그의 획득은 공 촛점 현미경을 사용하여 수행됩니다. 이 시점에서 세포가 콜라겐을 침범하지 않습니다. 오히려, 그들은 콜라겐 I 플러그의 위에 남아 있습니다. 따라서 침입이 발생하지 않는 경우를 제어 시점으로 사용합니다. MMP 활성화는 세포가이 밀도에서 콜라겐 I 플러그를 침범하는 데 필요합니다. ( B ) 씨 뿌리기 3 일 후, 일부 세포가 콜라겐 I 플러그를 침범합니다. 이 분석은 세포 침입의 관찰 및 정량화를 허용합니다. 또한 다양한 약물이나 siRNA의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
고전적으로, invadosomes는 microenvironment 및 세포가 도금되는 매트릭스에 관계없이 체외에서 공부 하고 있습니다. 젤라틴, fibronectin, vitronectin 또는 고밀도 원 섬유 콜라겐 (HDFC) 7,11을 포함하여 여러 유형의 매트릭스가 현재 사용됩니다. 그러나, 이들은 종종 세포가 존재하고 생리 학적으로 관련이없는 미세 환경을 대표하지 못한다. 여기에는 젤라틴과 섬유소 I 형 콜라겐 사이의 결합으로 구성된 새로운 유형의 매트릭스가 사용되었습니다. I 형 콜라겐 원 섬유의 사용은 우리가 생리 학적 구조에서 콜라겐 I 상에 특이 적으로 형성하는 선형 침입자 (invadosomes)로 알려진 새로운 종류의 침입자를 강조 할 수있게한다. 콜라겐에 라벨을 붙이면 섬유를 따라 선형 침입자를 관찰하고 Tks5와 코르 탁틴과 같은 세포 마커를 사용하여 그 형성을 정량화 할 수 있습니다. 마일 사용하기우리는 새로운 수용체, 선형 invadosomes 8 의 형성에 관여 discoidin 도메인 수용체 1 (DDR1)을 확인했습니다.
2D 혼합 매트릭스는 zymography in situ 분석을 통해 선형 인베도 솜의 기질 분해 활성을 정량화합니다. 이 분석은 형광 젤라틴 층에서 블랙 홀의 존재를 분석하여 MMP의 단백질 분해 활성을보고합니다. 흥미롭게도, 선형 invadosomes로 F - 굴지의 조직은 젤라틴 전용 7에 비해 매트릭스 저하 활동을 증가시킵니다. 이 분석의 한 가지 한계는 젤라틴이 비 생리 학적 매트릭스이며, 생리 학적 기질이 미세 환경에 대한 세포 반응을 변화 시킨다는 것이 증명되었습니다. MMP 활성이 젤라틴 - 콜라겐 I 혼합 매트릭스상에서 정량화되는 방식에 추가적인 한계가있다. 콜라겐 If 아래에 국한되는 젤라틴 분해 만bril layer는 정량화 될 수있다. 따라서 이것은 콜라겐 I 매트릭스 분해를 정량화하는 간접적 인 방법입니다. 선형 침입자의 분해 활성을 시각화하는 또 다른 방법은 콜라겐 절단 부위 (Col1-3 / 4C, 면역 글로불린)에 대한 특이 항체로 콜라겐 I 섬유를 표지하는 것이다. 이것은 immunofluorescence에 의해 cleaved 섬유의 시각화 수 있습니다. 그러나, 세포 이동으로 인해,이 항체는 선형 invadosome 형성으로 인해 2D에서 매우 특이 적이지 않다. 콜라겐 I 섬유의 분해 활성을 시각화하고 정량화하는 또 다른 방법은 다 광자 현미경 및 2 차 고조파 생성 8을 사용하는 것 입니다. 이 방법은 얼룩없이 콜라겐 I 섬유를 이미징 할 수 있습니다.
I 형 콜라겐을 중합하는 우리의 방법은 문헌 12 , 13 에서 사용 된 다른 방법과 비교하여 다릅니다. 예를 들어, Artym 세포 침입에 선형 침입자의 관련을 연구하기 위해 3D 콜라겐 I 플러그 분석이 사용되었습니다. 3D 콜라겐 I 플러그는 이미 침입 과정에서 침입 구조 또는 metalloproteinases의 관련을 연구하기 위해 과학계에서 사용됩니다 14 , 15 , 16 . 이러한 유형의 3D 행렬에는강성 - 예를 들어 3D 콜라겐 I 플러그는 2D 매트릭스보다 덜 단단합니다. 또한, 콜라겐의 종류와 기원은 생체 내 콜라겐 섬유의 다른 구성에 관해서도 중요합니다. 마지막으로, 생체 내 미세 환경 조성과 관련하여, 세포 외 기질의 한 요소 인 I 형 콜라겐 만이 초점을 맞추었다. 더 많은 연구가 생체 내 선형 invadosomes의 관련성을 결정하는 데 필요합니다. 선형 침입자의 연구 외에도, 여기에 기술 된 혼합 매트릭스는 fibronectin, vitronectin 및 다른 유형의 collagens ( 예 : IV 콜라겐)와 같은 다른 유형의 매트릭스 구성 요소와 함께 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 관심있는 행렬 요소의 유형과 연구 할 프로세스에 따라 조정될 수 있습니다. 그러나 복잡하고 생리적 인 매트릭스를 생성하면 ne세포 이동, 이동 및 침입에 관여하는 경로.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
JDM은 INSERM / Région Aquitaine의 PhD 펠로우쉽에 의해 후원되었으며 Mount Sinai School of Medicine의 박사후 ARC 펠로우쉽과 Tisch Cancer Institute의 지원을받습니다. EH는 Ministère de l' Enseignement Supérieur et de la Recherche의 박사 과정에서 지원됩니다. ZE는 ANR (Agence Nationale de la Recherche)의 박사후 연구원이 후원합니다. CM은 Mount Sinai School of Medicine의 Tisch Cancer Institute에서 지원하고 JJBC는 NIH / NCI 보조금 K22CA196750, TCI Young Scientist Cancer Research Award JJR Fund 및 Mount Sinai School of Tisch Cancer Institute의 지원을받습니다. 이 작업은 ANR-13-JJC-JSV1-0005의 보조금으로 지원되었습니다. FS는 "Ligue nationale contre le cancer"에 의해 지원됩니다. VM 및 FS는 "Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016"및 National de Cancer Institut, INCA_8036 및 PLBio2012에서 자금을 지원받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin solution | Sigma | G1393 | Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml |
| Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate | Molecular probe life technologies | G13186 | 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water |
| Microscope cover glasses | Marlenfeld GmbH & Co | 111520 | Ø12mm No.1 |
| 2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 | Electron microscopy science | 15960 | Dilute at 0.5 % in sterile water |
| 1x PBS pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010-015 | Use this PBS in all steps before fixation |
| Collagen I Rat tail | Corning | 354236 | |
| 5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester | Life technologies | C-6125 | |
| DPBS 1x + calcium + magnesium | Gibco by life technologies | 14040-091 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron microscopy science | 15710 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 10x PBS buffer pH 7.4 | Ambion | AM9625 | Dilute at 1X in water Use in steps after fixation |
| Tks5 antibody | Santa Cruz | sc-30122 | Invadosome markers Dilution : 1/100 |
| Cortactin 4F11 antibody | Millipore | 5180 | Invadosome markers Dilution :1/100 |
| DDR1 antibody | Cell signaling | 5583 | Linear invadosome receptor |
| Dilution :1/100 | |||
| Phalloidin FluoProbes | Interchim | FT-AZ0330 | Fibrillary actin marker Dilution :1/200 |
| Hoechst | Sigma | 33258 | Nucleus marker Dilution :1/200 |
| Secondary antibodies FluoProbes | Interchim | FP-488 FP-547H or FP-647H | |
| Albumin from bovine serum | Sigma | A2153 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Fluoromount G mounting medium | Interchim | FP 483331 | |
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| Cell culture insert | Corning | 353097 | 8.0µm pore size / 24 wells |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 221465 |
References
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