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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

2D- und 3D-Matrizen zur Untersuchung der linearen Invadosomenbildung und -aktivität

Published: June 2, 2017 doi: 10.3791/54911
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,3,4, 2, 2, 1, 1
1INSERM U1053, 2Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Tisch Cancer Institute, 3Faculté de Médecine, Casablanca, Université Mohammed 6 des Sciences de la Santé (UM6SS), 4Laboratoire National de Référence
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie man eine 2D-Mischmatrix, bestehend aus Gelatine und Kollagen I, und einem 3D-Kollagen-I-Plug, um lineare Invadosomen zu studieren, vorzubereiten. Diese Protokolle erlauben die Untersuchung der linearen Invadosomenbildung, der Matrixabbauaktivität und der Invasionsfähigkeit von Primärzellen und Krebszelllinien.

Abstract

Zelladhäsion, Migration und Invasion sind in viele physiologische und pathologische Prozesse involviert. Zum Beispiel müssen die Tumorzellen während der Metastasenbildung anatomische Barrieren überqueren, um durch das umgebende Gewebe einzudringen und zu wandern, um Blut oder Lymphgefäße zu erreichen. Dies erfordert die Wechselwirkung zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM). Auf zellulärer Ebene sind viele Zellen, einschließlich der Mehrheit der Krebszellen, in der Lage, Invadosomen zu bilden, die F-Aktin-basierte Strukturen sind, die in der Lage sind, ECM abzubauen. Invadosomen sind protrusive Aktinstrukturen, die Matrixmetalloproteinasen (MMPs) rekrutieren und aktivieren. Die molekulare Zusammensetzung, die Dichte, die Organisation und die Steifigkeit des ECM sind entscheidend für die Regulierung der Invadosomenbildung und -aktivierung. In vitro ist ein Gelatine-Assay der Standard-Assay, der verwendet wird, um Invadosomen-Abbauaktivität zu beobachten und zu quantifizieren. Allerdings ist Gelatine, die denaturiertes Kollagen I ist, keine physiologische Matrix eLeasing Ein neuartiger Test unter Verwendung von Kollagenfibrillen vom Typ I wurde entwickelt und verwendet, um zu zeigen, dass diese physiologische Matrix ein potenter Induktor von Invadosomen ist. Invadosomen, die sich entlang der Kollagenfibrillen bilden, werden als lineare Invadosomen aufgrund ihrer linearen Organisation auf den Fasern bezeichnet. Darüber hinaus zeigte die molekulare Analyse von linearen Invadosomen, dass der Diskoidin-Domänen-Rezeptor 1 (DDR1) der Rezeptor ist, der an deren Bildung beteiligt ist. Diese Daten zeigen deutlich, wie wichtig es ist, eine physiologisch relevante Matrix zu verwenden, um die komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen und ECM zu verstehen.

Introduction

Extrazelluläre Matrix (ECM) Remodeling erfolgt während physiologischer und pathologischer Prozesse wie Angiogenese und Tumorzellinvasion. In physiologischen Bedingungen können viele Zelltypen, meist aus der hämatopoetischen Abstammung, ECM-Elemente abbauen. Zum Beispiel können Makrophagen anatomische Barrieren kreuzen, um Gewebe zu erreichen, und Osteoklasten verschlechtern die Knochenmatrix, um die Calciumhomöostase zu gewährleisten. Weltweit erneuern sich alle Matrizen im Körper, um ihre physikalischen und chemischen Eigenschaften zu erhalten. In Krebsgeweben wird die Tumor-Mikroumgebungszusammensetzung verändert. Zum Beispiel bei Brust-und Lungenkrebs, Typ I Kollagen ist überexprimiert und sammelt sich um den Tumor. Darüber hinaus ist diese Akkumulation mit einem erhöhten Risiko der Entwicklung von Metastasen 1 , 2 verbunden. Die Krebsmetastase hängt von der Fähigkeit von Krebszellen ab, das ECM abzubauen und in benachbarte Gewebe einzudringen.

DasInvasive Aktivität von Zellen wird auf spezialisierte aktinreiche Strukturen, die als Invadosomen bekannt sind, zugeschrieben. Dieser Begriff schließt Podosomen und Invadopodien ein, die jeweils in normalen und Krebszellen vorhanden sind ( z. B. Makrophagen, Endothelzellen und Krebszellen wie die MDA-MB-231-Brustkrebszelllinie). In vitro können Invadosomen in verschiedene Formen organisieren: Punkte, Aggregate oder Rosetten 3 . Klassisch bestehen Invadosomen aus einem F-Aktin-Kern, der mehrere Proteine ​​enthält, wie das Gerüstprotein Tks5 und Cortactin, umgeben von Adhäsions-Plaque-Molekülen wie Integrinen und Vinculin 4 . Vor kurzem wurde gezeigt, dass Tks5 und die RhoGTPase Cdc42 als minimale molekulare Signatur für funktionelle Invadosomen verwendet werden können 5 . Diese Strukturen sind in der Lage, das ECM durch die Rekrutierung und Aktivierung von spezifischen Metalloprotease-Proteinen wie MT1-MMP und MMP-2 zu verschlechtern. In einer früheren Studie berichteten wir, dass die Wechselwirkung zwischen Kollagenfibrillen des Typs I und dem Diskoidin-Domänenrezeptor 1 (DDR1), einem spezifischen Rezeptor von Kollagenfibrillen vom Typ I, zur Bildung einer neuen Klasse von Invadosomen mit dem Namen lineare Invadosomen führt. Lineare Invadosomen werden entlang Kollagenfibrillen des Typs I gebildet 7 . Diese Strukturen sind in der Lage, Typ-I-Kollagenfibrillen durch die Rekrutierung und Aktivierung von MT1-MMP / MMP2 abzubauen. Darüber hinaus ist ihre Bildung abhängig von Tks5 und Cdc42 5 . In vitro zeigten wir die Existenz von linearen Invadosomen und die Beteiligung von DDR1 an ihrer Bildung und Aktivität 8 unter Verwendung verschiedener Strategien, die aus einer Kombination verschiedener Matrixelemente bestehen, einschließlich: i) fluoreszierende Gelatine-beschichtete Deckgläser, ii) fluoreszierende Kollagenfibrillen vom Typ I -beschichtete Deckgläser und iii) 3D-Typ-I-Kollagen-Stopfen. Durch den Einsatz unterschiedlicher Matrizen konnten wir studieren und charakterisierenIve lineare Invadosomenbildung und deren Abbauaktivität 7 , 8 .

Um die Biologie von invasiven Zellen besser zu verstehen, wurde eine Kombination von ECM-Komponenten sowohl in 2D- als auch in 3D-Kultursystemen verwendet, wobei die Komplexität der Tumor-Mikroumgebungszusammensetzung nachgeahmt wurde. Im Folgenden sind Protokolle für die Beschichtung von Deckgläschen mit Gelatine / Typ I Kollagen in 2D- und 3D-Kultursystemen.

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Protocol

HINWEIS: Vor der Fixierung werden alle Schritte in einer sterilen laminaren Strömungshaube durchgeführt.

1. 2D Matrix

ANMERKUNG: 2D Matrizen werden verwendet, um den Prozentsatz der Zellen zu bestimmen, die Invadosomen bilden, und der Matrixabbaubereich pro Zelle.

Abbildung 1
Abbildung 1: Protokoll. Zusammenfassung des Protokolls zur Herstellung von Gelatine- und Kollagen-I-Matrizen. Es ist möglich, die Gelatine-Matrix nur oder eine Gelatine und Kollagen I gemischte Matrix zu machen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Gelatine-Matrix
    ANMERKUNG: Fluoreszierende Gelatine-Matrizen werden verwendet, um den Matrixabbau zu quantifizieren, und nicht-fluoreszierende Gelatine wird verwendet, um die Adhäsion von Kollagen-I-Fasern zu fördern. Fluoreszierende Gelatine-MatteRizes werden auch für Podosomen- und Invadopodien-Studien verwendet (siehe Abbildung 1 ).
    1. Unter einer sterilen laminaren Strömungshaube legen Sie ein Stück Parafilm (20 cm x 15 cm) auf den Arbeitsbereich und desinfizieren es mit 70% Ethanol.
    2. Aliquotieren von 20 & mgr; l Tröpfchen von 1 mg / ml Gelatine in einer Linie, die etwa 1 cm voneinander entfernt ist; Siehe Abbildung 1 für Tröpfchenorganisation.
    3. Bedecken Sie jedes 20 μl Gelatine-Tröpfchen mit einem Autoklaven-Glasdeckel (12 mm Durchmesser).
    4. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. Wenn die Gelatine fluoreszierend ist, schützen sie vor Licht.
    5. Aliquotieren Sie 40 μl Tröpfchen von 0,5% Glutaraldehyd in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Linie, die jeweils etwa 1 cm unterhalb der Linie der Deckgläser aus Schritt 1.1.3 liegen.
      ACHTUNG: Glutaraldehyd ist ein toxisches Fixiermittel. Handschuhe benutzen und nicht einatmen.
    6. Mit der geschmiedeten Pinzette, jedes Gelatine-beschichtete Deckglas auf ein Glutaraldehyd-Tröpfchen übertragen.
      Notiere esIst normal, dass ein kleines Gelatine-Tröpfchen auf dem Parafilm bleibt. Wiederholen Sie das nicht für ein anderes Experiment.
    7. 40 min bei Raumtemperatur inkubieren. Für fluoreszierende Deckgläser schützen sie vor Licht.
    8. Nehmen Sie eine 24-Well-Zellkulturplatte und füllen Sie jede Vertiefung mit 500 μl sterilem 1x PBS. Legen Sie die Deckgläser, Gelatine Seite nach oben, in jede Vertiefung.
    9. Waschen Sie zweimal in 1x PBS für jeweils 5 min.
      HINWEIS: Bei diesem Schritt können die Deckgläser zum Experimentieren verwendet oder in 1x PBS bei 4 ° C gelagert werden. Nicht fluoreszierende Deckgläser können für eine Woche gelagert werden, und fluoreszierende Deckgläser können für 48 h gelagert werden.
  2. Fibrilläre Kollagen Typ I Matrix
    HINWEIS: Die Fibrillar-Kollagen-Typ-I-Matrix wird verwendet, um die lineare Invadosomenbildung und den damit verbundenen Matrixabbau zu untersuchen. Eine Kombination von fluoreszierendem Kollagen I und nicht-fluoreszierenden Gelatine-Deckgläschen wird verwendet, um Invadosomenmarker mit Kollagenfasern zu kolokalisieren ( z. B. F-Aktin iN der weit-rote Kanal, Kollagen I im roten Kanal, Tks5 im grünen Kanal und Hoechst Farbstoff für einen Kernfleck). Auf der anderen Seite wird eine Kombination von nicht-fluoreszierendem Kollagen I mit nicht-fluoreszierenden Gelatine-Deckgläschen verwendet, um die Anzahl der gefärbten Invadosomen-Marker zu maximieren ( z. B. F-Aktin im weit-roten Kanal, Cortactin im roten Kanal, Tks5 in Der grüne Kanal und Hoechst Farbstoff für einen Kernfleck). Schließlich wird eine Kombination von nicht-fluoreszierendem Kollagen I mit fluoreszierenden Gelatine-Deckgläschen verwendet, um den Gelatine-assoziierten Abbau zu quantifizieren ( z. B. F-Aktin im weit-roten Kanal, Tks5 im roten Kanal, im grünen Kanal und Hoechst-Farbstoff Für einen Kernfleck) (siehe Abbildung 1). Hoechst-Farbstoff wird verwendet, um den Kern zu färben, und es prüft auch auf Mycoplasma-Kontamination, zusätzlich zu einem PCR-Test, der regelmäßig auf den verwendeten Zelllinien durchgeführt wird.
    1. Fluoreszierendes Kollagen I
      1. Verwenden Sie kommerzielles Kollagen, das ich aus Rattenschwanzsehne in 0,02 N Essigsäure extrahiert habeD. Ziehen Sie die Menge an Kollagen, die notwendig ist, um 500 μl Lösung pro Deckglas bei einer Endkonzentration von 0,4 mg / ml Kollagen I herzustellen.
      2. Füge 5-Carboxy-x-Rhodamin-succinimidylester in einer Endkonzentration von 10 μg / ml hinzu, berechnet für das Endvolumen der Kollagen-I-Lösung (nx 500 μL).
      3. Mischen Sie die Lösung durch Pipettieren auf und ab und inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt.
      4. Verdünnen Sie das endgültige Volumen mit 1X Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung (DPBS), die Calcium und Magnesium enthält, und verwenden Sie direkt.
    2. Fibrillar Kollagen I Deckglas
      1. Verwenden Sie die zuvor in Schritt 1.1 hergestellten nicht-fluoreszierenden oder fluoreszierenden Gelatine-Deckgläser.
      2. Vorbereitung einer Lösung von fluoreszierendem oder nicht-fluoreszierendem Kollagen I bei einer Endkonzentration von 0,4 mg / ml in 1X DPBS, enthaltend Calcium und Magnesium.
      3. Füge 500 μl fluoreszierende oder nicht-fluoreszierende Kollagen-I-Lösung hinzuDeckglas in einer 24-Well-Zellkulturplatte.
      4. Inkubieren für 4 h bei 37 ° C für die Kollagen-I-Polymerisation.
      5. Nach der Inkubation das überschüssige Kollagen I durch Kippen der Platte und Pipettieren auf der Seite des Brunnens (nicht direkt auf dem Deckglas) entfernen, um eine Beschädigung der Matrix zu vermeiden.
        HINWEIS: Diese Matrix kann nicht gespeichert werden. Die Zellen sofort nach dem Entfernen von überschüssigem Kollagen I.

2. Zellseeding, Zeit der Kultur und Fixierung

  1. Je nach Zelltyp werden die Zellen in das entsprechende Kulturmedium vorbereitet und Zellen für ein Endvolumen von 500 μl pro Vertiefung zugegeben.
  2. Um die Fähigkeit einer Zelllinie zu charakterisieren, lineare Invadosomen zu bilden und die Matrix abzubauen, die Zellen für 4 h, 12 h und 24 h auf der Kollagen-I-Matrix zu trennen, um die Kinetik der linearen Invadosomenbildung und der damit verbundenen Abbauaktivität zu bestimmen.
    ANMERKUNG: Tabelle 1 enthält Beispiele für ZelllinienGetestet im Labor.
    Zelllinie Anzahl der Zellen pro Deckglas Zeit der Kontakt mit Matrix für lineare Invadosom-Quantifizierung Zeit der Berührung mit Matrix zur Quantifizierung der linearen Invadosomenabbauaktivität
    MDA MB 231 40.000 4 h 12 h
    HUH7 40.000 12 h 24 h
    HEP 3B 40.000 12 h 24 h
    SNU 398 40.000 12 h 24 h
    NIH 3T3 src 30.000 4 h 12 h
    A431 50.000 6 h 24 h
    A549 40.000 12 h 24 h &# 160;
    ROH 40.000 12 h 12 h
    PAE 40.000 12 h 12 h
    Tabelle 1: Zellseeding und Inkubationszeitreferenz. Diese Tabelle stellt eine nicht erschöpfende Liste von Zelllinien dar, die verwendet werden, um lineare Invadosomen zu studieren. Es gibt die Anzahl der Zellen an, die auf der Matrix säen, die Zeit, die notwendig ist, um lineare Invadosomen zu beobachten, und die Zeit, die notwendig ist, um den assoziierten Matrixabbau zu beobachten. Lineare Invadosomen haben eine kurze Lebensdauer. Um lineare Invadosomen in der maximalen Anzahl von Zellen beobachten zu können, müssen die Zellen für eine kurze Zeitspanne mit der Kollagen-I-Matrix in Kontakt kommen. Um andererseits den gemeldeten Gelatineabbau zu visualisieren, müssen die Zellen über einen längeren Zeitraum mit der Kollagen-I-Matrix in Kontakt kommen als die oben aufgeführten.
  3. Nach der Entfernung des Zellkulturmediums,Die Deckgläser für 10 min in 500 μl 4% Paraformaldehyd in 1X PBS fixieren.
  4. Waschen Sie zweimal mit 1x PBS.
  5. Bei 4 ° C aufbewahren, vor Licht geschützt.

3. Immunfluoreszenz

  1. Permeabilisieren Sie die Zellen für 10 min mit einer frisch zubereiteten Lösung Von 0,2% Triton X-100 in 1x PBS. Diese Lösung nicht wiederverwenden.
  2. Waschen Sie die Deckgläschen zweimal mit 1x PBS.
  3. Lege ein Stück Parafilm (20 cm x 15 cm) auf die Bank.
  4. Verdünnen Sie den primären Antikörper in 4% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS, wie in der Materialtabelle beschrieben .
  5. Aliquotieren Sie 50 & mgr; l Tröpfchen der primären Antikörperlösung in einer Linie, die jeweils etwa 1 cm voneinander entfernt sind.
  6. Lege jedes Deckglas auf ein Tröpfchen.
  7. 40 min bei Raumtemperatur inkubieren, vor Licht geschützt.
  8. Nach der Inkubationszeit zweimal mit 1x PBS waschen.
  9. Verdünnen Sie den sekundären Antikörper, Phalloidin und Hoechst Farbstoff in 4% BSA in 1xPBS
  10. Aliquotieren Sie 50 μl Tröpfchen der Mischung, die jeweils etwa 1 cm unterhalb der ersten Linie der Deckgläser liegen, wie zuvor getan.
  11. Lege jedes Deckglas auf ein Tröpfchen.
  12. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren, vor Licht geschützt.
  13. Nach der Inkubation zweimal mit 1x PBS waschen.
  14. Waschen Sie einmal mit destilliertem Wasser, um die Salze zu entfernen.
  15. Montieren Sie die Deckgläser auf einer Glasrutsche mit polymerisierendem Montagemedium.
  16. Lassen Sie die Deckgläser über Nacht bei Raumtemperatur trocknen, vor Licht geschützt vor der Mikroskopie.

4. Quantifizierungen

Figur 2
Abbildung 2: Lineare Invadosom-Quantifizierung. Das Makro erfordert konfokale Bilder von F-Aktin und Tks5-Färbung (Format: 1.024 x 1.024). ( A ) Zuerst das F-Aktin-Bild öffnen und eine Maske machen. ( B ) Dann öffne dichDas Tks5 Bild und Schwelle es. Tragen Sie das Makro auf. ( C ) Die analysierten Ergebnisse werden in zwei Tabellen angezeigt. Die Anzahl der linearen Invadosomen pro Zelle und andere Informationen, wie der prozentuale Bereich, der von linearen Invadosomen in der Zelle verwendet wird, befindet sich in der Übersichtstabelle. Die Größe jedes linearen Invadosoms wird in der Ergebnistabelle liegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Prozentsatz der Zellen, die lineare Invadosomen bilden
    1. Zählen Sie die Zellen, die lineare Invadosomen bilden, ungefähr 100 Zellen pro Deckglas (verwenden Sie technische Triplikate). Quantifizieren Sie mindestens 300 Zellen pro n mit n = 3.
    2. Berechnen Sie den Prozentsatz der Zellen, die lineare Invadosomen bilden, indem Sie den Durchschnitt von drei unabhängigen Experimenten, was zu 900 quantifizierten Zellen führt.
  2. Lineare Invadosomgröße und Anzahl pro Zelle
  3. Verwenden Sie ImageJ mit dem zusätzlichen Makro.
  • Abbau pro Zelle
    1. Verwenden Sie drei Deckgläser pro Zustand.
    2. Nehmen Sie 30 Bilder pro Deckglas von fluoreszierenden Gelatine und Hoechst-gefärbten Kernen.
    3. Verwenden Sie die ImageJ-Software, wie in Martin KH et al. 9

    • 5. 3D-Kollagen-Invasionstest

    Abbildung 3
    Abbildung 3: Invasionstestschema. Zusammenfassung des Invasionstestprotokolls Kollagen I wird mit Succinimidylester-Farbstoff vernetzt und für 1 h bei 37 ° C polymerisiert. Die Zellen werden in serumfreiem Medium auf den Kollagen-I-Stopfen gegeben. Der Einsatz ist mittig wiTen 10% FBS. Kollagen I-Stöpsel sind 1 h nach Zellsäen in der Kontrolle fixiert und 3 Tage nach Zellsäen im experimentellen Zustand, um die Invasionskapazität der Zellen zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    1. Kollagen I Stecker Vorbereitung
      1. Machen Sie einen Zeitverlauf von 4 h, 12 h, 24 h, 48 h und 72 h für das erste Experiment, um die Kinetik der Invasion in das Gel nach dem Zelltyp zu bestimmen. Für jedes Experiment fügen Sie einen 1-Stunden-Zeitpunkt als Referenzzeitpunkt hinzu, wenn keine Invasion auftritt.
      2. Bereiten Sie die Kollagen-I-Lösung auf Eis unter einer sterilen laminaren Strömungshaube vor. 500 μl Lösung für 3 Boyden Kammereinsätze vorbereiten.
      3. 1 mg handelsübliches Ratten-Schwanz-Kollagen I einspülen, um eine Lösung mit einer Endkonzentration von 2 mg / ml Kollagen I herzustellen.
      4. Füge 5-carboxy x Rhodamin-succinimidylester bei einEine Endkonzentration von 1 & mgr; g / ml, berechnet für das Endvolumen der Kollagen-I-Lösung (in diesem Fall 500 & mgr; l).
      5. Mischen Sie gut und inkubieren Sie für 5 min auf Eis unter der sterilen laminaren Strömungshaube, geschützt vor Licht.
      6. 50 μl eiskaltes, filtriertes 10X PBS und 6,25 μl eiskaltes 1 M Natriumhydroxid (NaOH) zugeben.
      7. Addieren Sie steriles Wasser gemäß der Formel 443,75 - x μl Kollagen I.
      8. 100 μl Lösung pro Boyden-Kammereinsatz zugeben.
      9. 1 Stunde bei 37 ° C inkubieren, um die Polymerisation zu ermöglichen.
      10. Addieren Sie Zellkulturmedium, angereichert mit fötalem Rinderserum (FBS) in neue Brunnen; Platzieren Sie Einsätze in diese Brunnen.
      11. Seed 30.000 Zellen auf dem Kollagen Ich stecke FBS-freies Medium ein.
      12. Nach dem Kultivieren der Zellen bei 37 ° C fixieren Sie den Kollagen-I-Stopfen für 30 min in 4% Paraformaldehyd in 1x PBS.
      13. Komplette Immunfluoreszenz wie in Schritt 3, mit Ausnahme der folgenden Schritte: permeabiliZe mit 0,2% Triton X-100 in 1x PBS für 30 min, nicht 10 min; Inkubieren mit primären und sekundären Antikörperlösungen für jeweils 1,5 h, anstatt 40 min bzw. 30 min. Fleck für F-Aktin oder Kerne, um die Zellen zu lokalisieren.
      14. Nach der Immunfluoreszenz ein Skalpell verwenden, um die Membran des Einsatzes zu schneiden und den Kollagen-I-Stecker vorsichtig auf eine Glasbodenschale zu übertragen. Stellen Sie sicher, dass die Oberseite des Kollagen-I-Steckers mit dem Glas in Berührung kommt. Halten Sie die Einsatzmembran an der Unterseite des Kollagen-I-Steckers befestigt, um die Integrität des Steckers beizubehalten.
        HINWEIS: Der Collagen-I-Stecker bleibt in der Glasbodenschale intakt. Die Tiefe zwischen dem Glasboden und dem Kunststoff, der den Glasboden umgibt, entspricht der Dicke des Stopfens.
      15. Legen Sie ein Deckglas auf das Kollagen I-Stecker und montieren mit polymerisierenden Montagemedium, um zu verhindern, dass der Stecker austrocknet.
      16. Verwenden Sie ein umgekehrtes konfokales Mikroskop, um den Kollagen-I-Stecker abzubilden. die Spitze vonDer Stecker steht mit dem Glasboden der Schale in Kontakt.
        1. Erwerben Sie einen Z-Stapel von der Oberseite bis zum Ende des Kollagen-I-Steckers, um die Zellinvasion zu visualisieren. Bestimmen Sie die Dicke des Z-Stapels, indem Sie untersuchen, wie tief die Zellen in das Bildgebungsfeld eindringen. Führen Sie Akquisitionen mit einem 40X Ölobjektiv in einem 512 x 512 Format mit einer z-Schrittgröße von 0,25 μm durch.
          HINWEIS: Als Referenz ist der durchschnittliche Z-Stack für MDA-MB-231 Zellen 3 Tage nach dem Seeding 30 μm.

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    Representative Results

    Unter Verwendung einer Kombination von zwei Arten von Matrizen, Gelatine und Typ I Kollagen ( Fig. 1 und 4 ) haben wir eine neue Art von Invadosom, bekannt als lineare Invadosomen, hervorgehoben. Die Markierung dieser Matrizen ermöglicht die Beobachtung der linearen Invadosomenbildung entlang der Kollagen-I-Fasern und ihrer Abbaubarkeit (Abbildung 5 ). Die Anzahl der invasiven Strukturen kann dann durch das zuvor beschriebene Makro quantifiziert werden (Schritt 4.2), und die Abbaugeschwindigkeit kann auch unter Verwendung der ImageJ-Software bestimmt werden, wie von Martin et al. Und Diaz et al. 9 , 10 Die gemischte Matrix ermöglicht die Charakterisierung von linearen Invadosomen durch die Definition von DDR1 als Rezeptor, der für die lineare Invadosomenbildung und Funktionalität notwendig ist (Abbildung 6 ).

    Abb. 3 und 7 ). Dieser Assay ermöglicht es uns, die Anzahl der Zellen, die in den Kollagen-I-Stecker eingedrungen sind, sowie die zurückgelegte Strecke zu bestimmen, indem sie z-Stack-Rekonstruktionen verwenden.

    Abbildung 4
    Abbildung 4: Vergleich von Gelatine- und Gelatine-Kollagen-I-Mischmatrizen mittels konfokaler Mikroskopie. Schematische Darstellung, die die Organisation von fluoreszierenden Gelatine-Deckgläschen auf der Oberseite zeigt. ( A ) Die konfokale z-Stapel-Rekonstruktion zeigt, dass die fluoreszierende Gelatine-Matrix eine dünne, gleichmäßige Schicht bildet, die die gesamte Oberfläche des Deckglases bedeckt. ( B ) In der gemischten Matrix, nach der Ablagerung von fluoreszierender Gelatine auf die Deckgläser, Typ I KollagenfibrillenPolymerisieren auf der Oberseite. Die Kollagen-I-Fibrillen sind rot gefärbt. Die Kollagen-I-Matrix ist dick und heterogen auf dem Deckglas. Die Verteilung der Kollagen-I-Fasern hängt von der Polymerisation von Kollagen-I-α-Ketten ab. Maßstab = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Abbildung 5
    Abbildung 5: Einfluss von Gelatine- und Gelatine-Kollagen-I-Matrizen auf Invadosomenbildung und -aktivität Die Zellen, die für diese Assays verwendet werden, sind MDA-MB-231 Brustkrebszellen. ( A ) Eine schematische Darstellung zeigt, dass Zellen auf einem fluoreszierenden Gelatine-Deckglas auf der Oberseite ausgesät werden. Abbaubereiche werden aufgrund der Reduzierung der Fluoreszenz in Schwarz sichtbar gemacht. Tks5-Färbung wurde als Invadosom-Marker verwendet. Auf der GelatineAdosomen, die Form bilden, sind als Punkte organisiert. ( B ) Eine schematische Darstellung zeigt, dass Zellen auf einer gemischten Matrix aus Gelatine und Kollagen I ausgesät werden. Kollagen I ist in rot markiert; Die Zugabe von Kollagenfibrillen vom Typ I erhöht die Fähigkeit der Zelle, Gelatine abzubauen. Interessanterweise wird der Invadosom-Marker Tks5 reorganisiert und die Punkte durch lineare Strukturen ersetzt, die lineare Invadosomen darstellen. Abbaubereiche werden aufgrund der Reduzierung der Fluoreszenz in Schwarz sichtbar gemacht. Maßstab = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Abbildung 6
    Abbildung 6: Konfokale mikroskopische Analyse der molekularen Zusammensetzung und Organisation von Invadosomen sowohl in Gelatine- als auch in Mischmatrix-Bedingungen. ( A ) In der gElatin-Bedingung, Invadosomen sind in Punkten organisiert, und F-Aktin (rot) co-lokalisiert mit Tks5 (grün, Bodenplatte), aber nicht mit DDR1 (grün, obere Platte). Das sind klassische Invadosomen. Maßstäbe = 5 μm. ( B ) In der Gelatine-Kollagen-I-Misch-Matrix-Bedingung kolibriert DDR1 (grün, obere Platte) mit den Kollagen-I-Fibrillen (rot, oberer Tafel), Tks5 (grün, Bodenplatte) und F-Aktin (rot, unten Panel). Die Kollagenfibrillen vom Typ I induzieren die Bildung von linearen Invadosomen. Maßstäbe = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Abbildung 7
    Abbildung 7: Zellinvasions-Assay von MDA-MB-231-Zellen in einem Kollagen-I-Plug. 1 h nach dem Aussaat der Zellen werden Kontrolleinsätze fixiert und gefärbt. ( A ) z-Stapel aDie Erfassung des Kollagen-I-Stifts erfolgt mit konfokaler Mikroskopie. Die Zellen dringen nicht zu dem Kollagen-I-Stecker zu diesem Zeitpunkt; Eher, sie bleiben oben auf dem Kollagen-I-Stecker. So wird dies als Kontrollzeitpunkt verwendet, wenn keine Invasion auftritt. MMP-Aktivierung ist notwendig für die Zellen in ein Kollagen-I-Stecker bei dieser Dichte eindringen. ( B ) Drei Tage nach dem Seeding dringen einige Zellen in den Kollagen-I-Stecker ein. Dieser Assay ermöglicht die Beobachtung und Quantifizierung der Zellinvasion. Darüber hinaus kann es verwendet werden, um die Auswirkungen von verschiedenen Medikamenten oder siRNAs, zum Beispiel zu studieren. Maßstab = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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    Discussion

    Klassisch werden Invadosomen in vitro ohne Rücksicht auf die Mikroumgebung und die Matrix untersucht, auf der die Zellen plattiert werden. Mehrere Matrixarten werden derzeit verwendet, einschließlich Gelatine, Fibronectin, Vitronectin oder hochdichtes fibrilläres Kollagen (HDFC) 7 , 11 ; Diese sind jedoch oft nicht repräsentativ für die Mikroumgebung, in der sich Zellen befinden und nicht physiologisch relevant sind. Hier wurde ein neuartiger Matrixtyp verwendet, der aus einer Assoziation zwischen Gelatine und fibrillärem Typ I Kollagen besteht. Die Verwendung von Kollagenfibrillen vom Typ I erlaubt es uns, eine neuartige Klasse von Invadosomen, die als lineare Invadosomen bekannt ist, hervorzuheben, die sich spezifisch auf Kollagen I in ihrer physiologischen Architektur ausbilden 7 . Die Markierung des Kollagens erlaubt es uns, lineare Invadosomen entlang der Fasern zu beobachten und ihre Bildung unter Verwendung von zellulären Markern wie Tks5 und Cortactin zu quantifizieren. Mit dem miXed Matrix, haben wir einen neuen Rezeptor, den discoidin Domänenrezeptor 1 (DDR1) identifiziert, der an der Bildung von linearen Invadosomen beteiligt ist 8 .

    Die 2D-Mischmatrix ermöglicht es uns, die Matrixabbauaktivität linearer Invadosomen über den Zymographie- In-situ- Assay zu quantifizieren. Dieser Assay berichtet über die Proteolyseaktivität von MMPs durch Analysieren der Anwesenheit von Schwarzen Löchern in der fluoreszierenden Gelatineschicht. Interessanterweise erhöht die Organisation von F-Aktin in lineare Invadosomen die Matrixabbauaktivität im Vergleich zu Gelatine-nur 7 . Eine Einschränkung dieses Assays ist, dass die Gelatine eine nicht-physiologische Matrix ist, und es wurde gezeigt, dass eine physiologische Matrix die zelluläre Antwort auf die Mikroumgebung verändert. Eine zusätzliche Einschränkung besteht in der Art und Weise, in der die MMP-Aktivität auf den Gelatine-Kollagen-I-Mischmatrizen quantifiziert wird. Nur der Gelatineabbau, der sich unter dem Kollagen I fi befindetBrillschicht kann quantifiziert werden; Daher ist dies eine indirekte Methode zur Quantifizierung des Kollagen-I-Matrixabbaus. Ein alternatives Verfahren zur Visualisierung der Degradationsaktivität von linearen Invadosomen besteht darin, die Kollagen-I-Fasern mit einem spezifischen Antikörper gegen Kollagenspaltungsstellen (Col1-3 /4 C, Immunglobulin) zu markieren. Dies ermöglicht die Visualisierung von gespaltenen Fasern durch Immunfluoreszenz. Aufgrund der Zellmigration ist dieser Antikörper jedoch nicht sehr spezifisch in 2D für den Abbau aufgrund der linearen Invadosomenbildung. Eine weitere Möglichkeit zur Visualisierung und Quantifizierung der Abbauaktivität der Kollagen-I-Fasern besteht darin, die Multiphotonenmikroskopie und die zweite harmonische Generation 8 zu verwenden. Diese Methode ermöglicht die Abbildung von Kollagen-I-Fasern ohne Färbung.

    Unsere Methode der Polymerisation von Kollagen Typ I ist im Vergleich zu anderen Methoden, die in der Literatur 12 , 13 verwendet werden, verschieden. Zum Beispiel, Artym

    Um die Beteiligung von linearen Invadosomen bei der Zellinvasion zu untersuchen, wurde der 3D-Kollagen-I-Plug-Assay verwendet. Der 3D-Kollagen-I-Stecker wird bereits von der wissenschaftlichen Gemeinschaft verwendet, um invasive Strukturen oder die Beteiligung von Metalloproteinasen im Invasionsprozess 14 , 15 , 16 zu untersuchen. Diese Arten von 3D-Matrizen haben Grenzen in Bezug auf theiR Steifigkeit - zum Beispiel ist der 3D-Kollagen-I-Stecker weniger starr als die 2D-Matrix. Darüber hinaus ist die Art und Herkunft des Kollagens I auch wichtig für die unterschiedliche Organisation von Kollagenfasern in vivo 17 . Schließlich wurde in Bezug auf die Mikroumgebungszusammensetzung in vivo nur ein Element der extrazellulären Matrix, der Typ I Kollagen, konzentriert. Eine weitere Untersuchung ist notwendig, um die Relevanz von linearen Invadosomen in vivo zu bestimmen.

    Zusätzlich zu der Untersuchung von linearen Invadosomen könnte die hier beschriebene gemischte Matrix mit anderen Typen von Matrixkomponenten wie Fibronectin, Vitronectin und anderen Arten von Kollagenen ( z. B. Typ-IV-Kollagen) verwendet werden. Dieses Protokoll könnte je nach Art der Matrixelemente, die von Interesse sind, und den zu untersuchenden Prozessen angepasst werden. Es ist jedoch klar, dass die Erzeugung komplexer und physiologischer Matrizen die Identifizierung von ne ermöglichtW-Pfade, die an Zelladhäsion, Migration und Invasion beteiligt sind.

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    Disclosures

    Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

    Acknowledgments

    JDM wurde von einem Doktorandenstipendium von INSERM / Région Aquitaine unterstützt und wird nun von einem Post-Doktoranden-ARC-Stipendium und dem Tisch-Krebs-Institut am Berg Sinai School of Medicine unterstützt. EH wird von einem Doktorat des Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche unterstützt. ZE wird von einem Postdoc-Stipendium von Agence Nationale de la Recherche (ANR) unterstützt. CM wird vom Tisch-Krebs-Institut am Berg Sinai School of Medicine unterstützt und JJBC wird von der NIH / NCI Grant K22CA196750, dem TCI Young Scientist Cancer Research Award JJR Fund und dem Tisch Cancer Institute an der Mount Sinai School of Medicine unterstützt. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von ANR-13-JJC-JSV1-0005 unterstützt. FS wird von der "Ligue nationale contre le cancer" unterstützt. VM und FS werden durch die Finanzierung von "Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016" und Institut National du Cancer, INCA_8036 und PLBio2012 unterstützt.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Gelatin solution Sigma G1393 Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml
    Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate Molecular probe life technologies G13186 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water
    Microscope cover glasses Marlenfeld GmbH & Co 111520 Ø12mm No.1
    2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 Electron microscopy science 15960 Dilute at 0.5 % in sterile water
    1x PBS pH 7.4 Gibco by life technologies 10010-015 Use this PBS in all steps before fixation
    Collagen I Rat tail Corning 354236
    5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester Life technologies C-6125
    DPBS 1x + calcium + magnesium Gibco by life technologies 14040-091
    Paraformaldehyde 16% solution Electron microscopy science 15710 Dilute at 4% in 1X PBS
    Triton X 100 Sigma T9284
    10x PBS buffer pH 7.4 Ambion AM9625 Dilute at 1X in water Use in steps after fixation
    Tks5 antibody Santa Cruz sc-30122 Invadosome markers Dilution : 1/100
    Cortactin 4F11 antibody Millipore 5180 Invadosome markers Dilution :1/100
    DDR1 antibody Cell signaling 5583 Linear invadosome receptor
    Dilution :1/100
    Phalloidin FluoProbes Interchim FT-AZ0330 Fibrillary actin marker Dilution :1/200
    Hoechst Sigma 33258 Nucleus marker Dilution :1/200
    Secondary antibodies FluoProbes Interchim FP-488 FP-547H or FP-647H
    Albumin from bovine serum Sigma A2153 Dilute at 4% in 1X PBS
    Fluoromount G mounting medium Interchim FP 483331
    ImageJ software Public domain http://www.macbiophotonics.ca/imagej/
    Cell culture insert Corning 353097 8.0µm pore size / 24 wells
    Sodium hydroxide (NaOH) Sigma 221465

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    References

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    3. Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).
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    17. Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).

    Tags

    Bioengineering Ausgabe 124 Lineares Invadosom extrazelluläre Matrix Degradationsaktivität Kollagen I 3D Invasion
    2D- und 3D-Matrizen zur Untersuchung der linearen Invadosomenbildung und -aktivität
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    Di Martino, J., Henriet, E.,… More

    Di Martino, J., Henriet, E., Ezzoukhry, Z., Mondal, C., Bravo-Cordero, J. J., Moreau, V., Saltel, F. 2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity. J. Vis. Exp. (124), e54911, doi:10.3791/54911 (2017).

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