Summary
В этом протоколе описывается, как подготовить двумерную смешанную матрицу, состоящую из желатина и коллагена I, и пробку 3D-коллагена I для исследования линейных интрадосом. Эти протоколы позволяют изучать формирование линейной инвадосомы, активность деградации матриц и возможности инвазии первичных клеток и линий раковых клеток.
Abstract
Клеточная адгезия, миграция и инвазия участвуют во многих физиологических и патологических процессах. Например, во время образования метастазов опухолевые клетки должны пересекать анатомические барьеры, чтобы вторгнуться и мигрировать через окружающую ткань, чтобы достичь кровеносных или лимфатических сосудов. Для этого требуется взаимодействие между клетками и внеклеточным матрицей (ECM). На клеточном уровне многие клетки, включая большинство раковых клеток, способны образовывать инвадусомы, которые представляют собой структуры на основе F-актина, способные разрушать ECM. Invadosomes - это протрузивные актиновые структуры, которые рекрутируют и активируют матриксные металлопротеиназы (MMP). Молекулярный состав, плотность, организация и жесткость ECM имеют решающее значение для регулирования образования и активации инвадосом. В пробирке анализ желатина является стандартным анализом, используемым для наблюдения и количественного определения активности деградации инвадосом. Однако желатин, являющийся денатурированным коллагеном I, не является физиологической матрицей element. Был разработан новый анализ с использованием коллагеновых фибрилл I типа, который показал, что эта физиологическая матрица является мощным индуктором интрадосом. Инвадосомы, которые образуются вдоль коллагеновых фибрилл, известны как линейные инвадосомы из-за их линейной организации на волокнах. Более того, молекулярный анализ линейных интрадосом показал, что рецептор домена дискоидина 1 (DDR1) является рецептором, участвующим в их образовании. Эти данные наглядно демонстрируют важность использования физиологически релевантной матрицы для понимания сложных взаимодействий между клетками и ECM.
Introduction
Ремоделирование внеклеточной матрицы (ECM) происходит во время физиологических и патологических процессов, таких как ангиогенез и инвазия опухолевых клеток. В физиологических условиях многие типы клеток, в основном из гематопоэтической линии, способны деградировать элементы ECM. Например, макрофаги способны пересекать анатомические барьеры для достижения тканей, а остеокласты разрушают костный матрикс для обеспечения гомеостаза кальция. Более глобально все матрицы в организме восстанавливаются, сохраняя свои физические и химические свойства. В раковых тканях состав микроокружности опухоли изменяется. Например, при раке груди и легкого коллаген I типа сверхэкспрессируется и накапливается вокруг опухоли. Более того, это накопление связано с повышенным риском развития метастазов 1 , 2 . Раковые метастазы зависят от способности раковых клеток разрушать ECM и вторгаться в смежные ткани.
Инвазивная активность клеток объясняется специализированными актино-богатыми структурами, известными как интрадосомы. Этот термин включает подзомы и инвадоподии, которые присутствуют, соответственно, в нормальных и раковых клетках ( например, макрофагах, эндотелиальных клетках и раковых клетках, таких как клеточная линия рака молочной железы MDA-MB-231). In vitro , интрадосомы могут организовываться в разные формы: точки, агрегаты или розетки 3 . Классически интрадосомы состоят из ядра F-актина, содержащего несколько белков, таких как белок Taff5 и кортатин, окруженный молекулами адгезионной бляшки, такими как интегрины и винкулин 4 . Недавно было показано, что Tks5 и RhoGTPase Cdc42 могут быть использованы как минимальная молекулярная сигнатура для функциональных инвадосом 5 . Эти структуры способны разрушать ECM посредством рекрутирования и активации специфических белков металлопротеазы, таких как MT1-MMP и MMP-2 6, В предыдущем исследовании мы сообщали, что взаимодействие между фибриллами коллагена типа I и рецептором домена discoidin 1 (DDR1), специфическим рецептором фибрилл коллагена I типа, приводит к образованию нового класса инвадосом, называемых линейными инвадосомами. Линейные инвадомости образуются вдоль коллагеновых фибрилл I типа 7 . Эти структуры способны разрушать фибриллы коллагена I типа путем набора и активации MT1-MMP / MMP2. Более того, их образование зависит от Tks5 и Cdc42 5 . В пробирке мы продемонстрировали существование линейных интрадосом и вовлечение DDR1 в их формирование и активность 8, используя различные стратегии, состоящие из комбинации различных матричных элементов, в том числе: i) люминесцентные покрытые желатином покровные стекла, ii) флуоресцентный коллагеновый фибрилл I типа Покрытые покровным покрытием, и iii) вилки с коллагеном типа I. Из-за использования разных матриц мы смогли учиться и характеризоватьсяА также их деградирующей активности 7 , 8 .
Наконец, чтобы лучше понять биологию инвазивных клеток, была использована комбинация компонентов ECM в системах 2D и 3D культуры, имитирующих сложность состава микроокружения опухоли. Ниже приведены протоколы покрытия покровных стекол желатином / типом I в системах 2D и 3D культуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ. Перед фиксацией все этапы завершаются в стерильном ламинарном вытяжном шкафу.
1. 2D-матрица
ПРИМЕЧАНИЕ. 2D-матрицы используются для определения процента клеток, образующих инвадусомы, и площади деградации матрицы на ячейку.
Рисунок 1: Протокол. Резюме протокола, используемого для приготовления желатиновых и коллагеновых матриц I. Можно сделать только желатиновую матрицу или смешанную матрицу желатина и коллагена I. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Желатиновая матрица
ПРИМЕЧАНИЕ. Флуоресцентные желатиновые матрицы используются для количественного определения деградации матрицы, а для флуоресцентного желатина используется для стимуляции адгезии волокон коллагена I. Флуоресцентный желатиновый матРисы также используются для исследований подзомы и инвадоподии (см . Рис. 1 ).- Под стерильным ламинарным вытяжным потоком поместите кусочек парафильма (20 см x 15 см) на рабочую зону и продезинфицируйте его 70% этанолом.
- Аликвоту 20 мкл капель 1 мг / мл желатина в линии, расположенную на расстоянии примерно 1 см друг от друга; См . Рисунок 1 для организации капель.
- Накройте каждую 20 мкл желатиновой капли стеклянным покровным стеклом (12 мм в диаметре).
- Инкубируйте в течение 20 мин при комнатной температуре. Если желатин является флуоресцентным, защитите его от света.
- Аликвоту 40 мкл капель 0,5% глутарового альдегида в 1х фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) в линии, каждый на расстоянии примерно 1 см ниже линии покровных с этапа 1.1.3.
ОСТОРОЖНО: Глутаральдегид является токсичным фиксатором. Используйте перчатки и не вдыхайте. - Используя драгоценные пинцеты, перенесите каждое покрытое желатином покровное стекло каплей глутаральдегида.
Обратите вниманиеНормально, что небольшая желатиновая капля остается на парафильме. Не используйте его повторно для другого эксперимента. - Инкубируйте в течение 40 мин при комнатной температуре. Для флуоресцентных покровных, защитите их от света.
- Возьмите 24-луночный планшет для культивирования клеток и заполните каждую лунку 500 мкл стерильного 1x PBS. Поместите покровные стекла, желатин вверх, в каждую лунку.
- Промыть дважды в 1х PBS в течение 5 минут каждый.
ПРИМЕЧАНИЕ. На этом этапе покровные стекла можно использовать для экспериментов или хранить в 1x PBS при 4 ° C. Нефлуоресцентные покровные стекла можно хранить в течение одной недели, а флуоресцентные покровные стекла можно хранить в течение 48 часов.
- Фибриллярная матрица коллагена типа I
ПРИМЕЧАНИЕ. Фибриллярная матрица коллагена типа I используется для изучения линейного образования инвадосом и связанной с этим деградации матрицы. Комбинацию флуоресцентного коллагена I и не флуоресцентных желатиновых покровных используют для колокализации инвазивных маркеров с коллагеновыми волокнами ( например, F-actin iN дальний красный канал, коллаген I в красном канале, Tks5 в зеленом канале и краситель Hoechst для ядерного пятна). С другой стороны, комбинация не флуоресцентного коллагена I с не флуоресцентными желатиновыми покровными стеклами используется для максимизации числа окрашенных инвазивных маркеров ( например, F-актин в дальнем красном канале, кортикат в красном канале, Tks5 in Зеленый канал и краситель Hoechst для ядерного пятна). Наконец, комбинация не флуоресцентного коллагена I с флуоресцентными желатиновыми покровными стеклами используется для количественного определения связанного с желатином деградации ( например, F-актина в дальнем красном канале, Tks5 в красном канале, в зеленом канале и красителя Hoechst Для ядерного пятна) (см. Рис. 1). Хехст-краситель используется для окрашивания ядра, а также проверяет загрязнение микоплазмы, в дополнение к тесту на ПЦР, регулярно проводимому на клеточных линиях.- Флуоресцентный коллаген I
- Используйте коммерческий коллаген I, извлеченный из сухожилия крысиного хвоста в 0,02 Н уксусной кислотыд. Изъятие количества коллагена I необходимо для приготовления 500 мкл раствора на покровное стекло при конечной концентрации 0,4 мг / мл коллагена I.
- Добавляют 5-карбокси-х-родамин сукцинимидиловый эфир с конечной концентрацией 10 мкг / мл, рассчитанный для конечного объема раствора коллагена I (nx 500 мкл).
- Смешайте раствор путем пипетирования вверх и вниз и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре, защищенной от света.
- Разбавьте до конечного объема с помощью 1X Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS), содержащего кальций и магний, и используйте непосредственно.
- Фибриллярный коллаген I покровное
- Используйте не флуоресцентные или флуоресцентные желатиновые покровные стекла, предварительно приготовленные на этапе 1.1.
- Подготовьте раствор флуоресцентного или не флуоресцентного коллагена I при конечной концентрации 0,4 мг / мл в 1X DPBS, содержащем кальций и магний.
- Добавьте 500 мкл флуоресцентного или не флуоресцентного раствора коллагена I вПокровное стекло в 24-луночном планшете для культивирования клеток.
- Инкубируйте в течение 4 ч при 37 ° С для полимеризации коллагена I.
- После инкубации удалите избыток коллагена I путем наклона пластины и пипетирования со стороны лунки (не непосредственно на покровное стекло), чтобы не повредить матрицу.
ПРИМЕЧАНИЕ. Эта матрица не может быть сохранена. Высевают клетки сразу после удаления избытка коллагена I.
- Флуоресцентный коллаген I
2. Посев клеток, время культуры и фиксация
- В зависимости от типа клетки, подготовьте клетки в соответствующей культуральной среде и добавьте клетки для конечного объема 500 мкл на лунку.
- Чтобы охарактеризовать способность линии клеток формировать линейные интрадосомы и деградировать матрицу, наклеивают клетки на 4 ч, 12 ч и 24 ч на матрицу коллагена I для определения кинетики формирования линейной инвадосом и связанной с ней деградации.
ПРИМЕЧАНИЕ. В таблице 1 приведены примеры клеточных линийИспытаны в лаборатории.
Таблица 1: Ссылка на посев клеток и инкубацию. В этой таблице представлен неисчерпывающий список клеточных линий, используемых для исследования линейных интрадосом. Он указывает количество клеток, которые высевают на матрице, время, необходимое для наблюдения линейных инвадусом, и время, необходимое для наблюдения за связанной матричной деградацией. Линейные интрадосомы имеют короткий срок службы. Чтобы иметь возможность наблюдать линейные инвадусомы в максимальном количестве клеток, клетки должны находиться в контакте с матрицей коллагена I в течение короткого периода времени. С другой стороны, чтобы иметь возможность визуализировать сообщаемую деградацию желатина, клетки должны находиться в контакте с матрицей коллагена I в течение более длительного периода времени, чем те, которые перечислены выше.Клеточная линия Количество ячеек на покровное стекло Время контакта с матрицей для количественного определения линейной инвадосомы Время контакта с матрицей для количественной оценки активности деградации линейной инвазии MDA MB 231 40000 4 ч 12 ч. HuH7 40000 12 ч. 24 ч HEP 3B 40000 12 ч. 24 ч SNU 398 40000 12 ч. 24 ч NIH 3T3 src 30000 4 ч 12 ч. A431 50000 6 часов 24 ч A549 40000 12 ч. 24 ч &# 160; RAW 40000 12 ч. 12 ч. PAE 40000 12 ч. 12 ч. - После удаления клеточной культуральной среды,Фиксируйте покровные стекла в течение 10 минут в 500 мкл 4% параформальдегида в 1X PBS.
- Промыть дважды с помощью 1x PBS.
- Хранить при температуре 4 ° C, защищенной от света.
3. Иммунофлуоресценция
- Пермеабилизируйте клетки в течение 10 мин свежеприготовленным раствором 0,2% Triton X-100 в 1x PBS. Не используйте это повторно.
- Вымойте покровные стекла дважды с помощью 1x PBS.
- Поместите кусочек парафильма (20 см x 15 см) на скамейку.
- Разбавляют первичное антитело в 4% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 1x PBS, как описано в таблице материалов .
- Аликвоте 50 мкл капель раствора первичного антитела в линии, каждый из которых расположен примерно на расстоянии 1 см друг от друга.
- Поместите каждое покровное стекло на каплю.
- Инкубируйте в течение 40 минут при комнатной температуре, защищенной от света.
- После инкубационного периода дважды промывают 1 × PBS.
- Разбавьте вторичное антитело, фаллоидин и краситель Hoechst в 4% BSA в 1xPBS.
- Аликвота 50 мкл капель смеси, каждая из которых расположена на расстоянии примерно 1 см ниже первой линии покровных, как это было сделано ранее.
- Поместите каждое покровное стекло на каплю.
- Инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре, защищенной от света.
- После инкубации дважды промывают 1 × PBS.
- Промыть один раз дистиллированной водой для удаления солей.
- Установите покровные стекла на стеклянный предмет с полимеризационной монтажной средой.
- Позвольте покровным сухим на ночь при комнатной температуре, защищенном от света, до микроскопии.
4. Количественные оценки
Рисунок 2: Линейная количественная оценка инвадосом. Макрос требует конфокальных изображений окрашивания F-актина и Tks5 (формат: 1024 × 1024). ( A ) Сначала откройте изображение F-actin и сделайте маску. ( B ) Затем, откройтеИзображение Tks5 и пороговое значение. Примените макрос. ( C ) Анализируемые результаты появятся в двух таблицах. Количество линейных инвадомоз на ячейку и другая информация, такая как процентная область, используемая линейными инвадомами в ячейке, будет представлена в Сводной таблице. Размер каждой линейной инвадусомы будет в таблице «Результаты». Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Процент клеток, образующих линейные инвадосомы
- Подсчитайте клетки, образующие линейные интрадосомы, приблизительно 100 клеток на покровное (используйте технические трипликаты). Количественное определение не менее 300 клеток на n, с n = 3.
- Рассчитайте процент клеток, образующих линейные интрадосомы, взяв среднее из трех независимых экспериментов, в результате чего получилось 900 квантованных клеток.
- Линейный размер и количество интрадосом на ячейку
- Используйте ImageJ с дополнительным макросом.
- Используйте три покровных стекла для каждого состояния.
- Возьмите 30 изображений на покровное стекло флуоресцентного желатина и ядра, окрашенные Hoechst.
- Используйте программное обеспечение ImageJ, как описано в Martin KH et al. 9 .
5. Анализ 3D-коллагеновых инвазий
Рисунок 3: Схема анализа вторжения. Резюме протокола анализа вторжения. Коллаген I сшивают с сукцинимидиловым сложным эфиром и полимеризуют в течение 1 часа при 37 ° С. Клетки добавляют в среду, не содержащую сыворотки, поверх вилки коллагена I. Вставка помещается в среду wiГо 10% FBS. Замки коллагена I фиксируются через 1 час после посева клеток в контроле и через 3 дня после посева клеток в экспериментальном состоянии для определения способности к всасыванию клеток. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Подготовка коллагена I
- Проведите курс времени 4 ч, 12 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч для первого эксперимента, чтобы определить кинетику инвазии в гель в соответствии с типом клетки. Для каждого эксперимента добавьте 1-часовую точку времени в качестве опорного момента времени, когда не происходит вторжения.
- Подготовьте раствор коллагена I на льду под стерильным ламинарным капотом. Подготовьте 500 мкл раствора для 3 вкладышей камеры Boyden.
- Аспирируйте 1 мг коммерческого коллагена I крысиного хвоста I для приготовления раствора с конечной концентрацией 2 мг / мл коллагена I.
- Добавить 5-карбокси-х-родамин-сукцинимидиловый эфир приКонечная концентрация 1 мкг / мл, рассчитанная для конечного объема раствора коллагена I (в данном случае 500 мкл).
- Хорошо перемешать и инкубировать в течение 5 мин на льду под стерильным ламинарным вытяжным потолком, защищенным от света.
- Добавить 50 мкл ледяного, фильтрованного 10X PBS и 6,25 мкл ледяного 1 М гидроксида натрия (NaOH).
- Добавить стерильную воду по формуле 443,75 - х мкл коллагена I.
- Добавьте 100 мкл раствора на вставку камеры Boyden.
- Инкубируйте в течение 1 часа при 37 ° C, чтобы обеспечить полимеризацию.
- Добавить клеточную культуральную среду, обогащенную фетальной бычьей сывороткой (FBS) в новые лунки; Помещают в эти колодцы.
- Семя 30 000 клеток на вершине коллагена I подключают к среде, свободной от FBS.
- После культивирования клеток при 37 ° C зафиксируйте пробку коллагена I в течение 30 минут в 4% параформальдегиде в 1x PBS.
- Полная иммунофлюоресценция, как на этапе 3, за исключением следующих этапов: пермеабилиZe с 0,2% Triton X-100 в 1x PBS в течение 30 мин, а не 10 мин; Инкубируют с первичными и вторичными растворами антител в течение 1,5 ч каждый, а не через 40 мин и 30 мин соответственно. Пятно для F-актина или ядер для локализации клеток.
- После иммунофлюоресценции используйте скальпель для обрезания мембраны вставки и осторожно переносите коллагеновую пробку I на тарелку со стеклянным дном. Убедитесь, что верхняя часть штекера коллагена I находится в контакте со стеклом. Держите вставную мембрану, прикрепленную к нижней части штекера коллагена I, чтобы поддерживать целостность вилки.
ПРИМЕЧАНИЕ. Коллагеновая вилка остается неповрежденной в тарелке со стеклянным дном. Глубина между дном стекла и пластиком, окружающим стекло, эквивалентна толщине вилки. - Поместите покровное стекло на пробку коллагена I и смонтируйте с помощью полимеризующей монтажной среды, чтобы предотвратить высыхание вилки.
- Используйте инвертированный конфокальный микроскоп для изображения пробки коллагена I; вершинаВилка находится в контакте со стеклянным дном блюда.
- Приобретайте z-стопку сверху вниз коллагена I, чтобы визуализировать вторжение клеток. Определите толщину z-стека, исследуя, насколько глубоко клетки вторгаются в область визуализации. Выполняйте приобретения с масляным объективом 40X в формате 512 x 512 с шагом z-шаг 0,25 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для справки средний z-стек для клеток MDA-MB-231 через 3 дня после посева составляет 30 мкм.
- Приобретайте z-стопку сверху вниз коллагена I, чтобы визуализировать вторжение клеток. Определите толщину z-стека, исследуя, насколько глубоко клетки вторгаются в область визуализации. Выполняйте приобретения с масляным объективом 40X в формате 512 x 512 с шагом z-шаг 0,25 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя комбинацию двух типов матриц, желатина и коллагена I типа ( рис. 1 и 4 ), мы выделили новый тип инвадомоз, известный как линейные интрадосомы. Маркировка этих матриц позволяет наблюдать формирование линейной инвадосомы вдоль волокон коллагена I и их возможностей деградации ( рис. 5 ). Затем число инвазивных структур может быть количественно определено макросом, описанным ранее (этап 4.2), и активность деградации также может быть определена с использованием программного обеспечения ImageJ, как описано Martin et al. И Diaz et al. 9 , 10 . Смешанная матрица позволяет характеризовать линейные инвадомости, определяя DDR1 как рецептор, необходимый для формирования линейной инвадосом и функциональности ( рис. 6 ).
рис. 3 и 7 ). Этот анализ позволяет определить количество клеток, которые вторглись в штекер коллагена I, а также пройденное расстояние, используя реконструкцию z-стека.
Рисунок 4: Сравнение смешанных матриц желатина и желатина-коллагена I с использованием конфокальной микроскопии. Схематическое изображение, показывающее организацию флуоресцентных желатиновых покровных на верхней панели. ( A ) Конфокальная реконструкция z-столов показывает, что флуоресцентная желатиновая матрица образует тонкий однородный слой, покрывающий всю поверхность покровного стекла. ( B ) В смешанной матрице после осаждения флуоресцентного желатина на покровные, фибриллы коллагена I типаПолимеризуют сверху. Фибриллы коллагена I окрашиваются в красный цвет. Матрица коллагена I толстая и неоднородная на покровном. Распределение волокон коллагена I зависит от полимеризации цепей коллагена I α. Шкала шкалы = 10 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Влияние матриц желатина и желатина-коллагена I на формирование и активность инвадосом. Клетки, используемые для этих анализов, являются клетками рака молочной железы MDA-MB-231. ( A ) На схематическом изображении показаны ячейки, высеваемые на люминесцентном желатином покровным стеклом на верхней панели. Области деградации визуализируются черным из-за уменьшения флуоресценции. Окрашивание Tks5 использовалось в качестве инвазивного маркера. На желатине invАдомы, которые формируются, организованы в виде точек. ( B ) Схематическое изображение показывает клетки, высеваемые на смешанной матрице желатина и коллагена I. Коллаген I маркирован красным; Добавление фибрилл коллагена I типа увеличивает способность клетки к деградации желатина. Интересно, что инвазивный маркер Tks5 реорганизуется, а точки заменяются линейными структурами, представляющими линейные инвадусомы. Области деградации визуализируются черным из-за уменьшения флуоресценции. Шкала шкалы = 5 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Конфокальный микроскопический анализ молекулярного состава и организации интрадосом как в желатиновых, так и в смешанных матричных условиях. ( A ) В gElatin, интрадосомы организованы в точках, а F-actin (красный) совместно локализуется с Tks5 (зеленый, нижняя панель), но не с DDR1 (зеленый, верхняя панель). Это классические инвадусомы. Шкала шкалы = 5 мкм. ( B ) В состоянии смешанной матрицы желатин-коллаген I DDR1 (зеленый, верхняя панель) колокализуется с фибриллами коллагена I (красный, верхняя панель), Tks5 (зеленый, нижняя панель) и F-актином (красный, нижний панель). Фибриллы коллагена I типа вызывают образование линейных интрадосом. Шкала шкалы = 10 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Анализ инвазии клеток клеток MDA-MB-231 в коллагеновом ящике. Через 1 ч после посева клеток контрольные вставки фиксированы и окрашены. ( A ) z-stack aПолучение коллагеновой пробки выполняется с использованием конфокальной микроскопии. Ячейки не вторгаются в коллагеновый ящик в этот момент времени; Скорее, они остаются на вершине коллагена I. Таким образом, это используется как контрольная точка времени, когда не происходит вторжения. MMP-активация необходима для того, чтобы клетки вторглись в коллаген I с этой плотностью. ( B ) Через три дня после посева некоторые клетки вторгаются в коллаген I. Этот анализ позволяет наблюдать и количественно определять клеточную инвазию. Кроме того, его можно использовать для изучения влияния различных лекарств или сиРНК, например. Шкала шкалы = 20 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Классически интрадосомы изучаются in vitro без учета микроокружения и матрицы, на которой покрыты клетки. В настоящее время используются несколько типов матриц, включая желатин, фибронектин, витронектин или фибриллярный коллаген высокой плотности (HDFC) 7 , 11 ; Однако они часто не представляют собой микроокружение, в котором клетки находятся и не являются физиологически релевантными. Здесь был использован новый тип матрицы, который состоит из ассоциации между желатином и фибриллярным коллагеном I типа. Использование коллагеновых фибрилл I типа позволяет выделить новый класс интрадосом, известных как линейные инвадосомы, которые специфически формируются на коллагене I в его физиологической архитектуре 7 . Маркировка коллагена I позволяет нам наблюдать линейные интрадосомы вдоль волокон и количественно определять их образование с использованием клеточных маркеров, таких как Tks5 и кортатин. Используя miXed, мы идентифицировали новый рецептор, рецептор домена discoidin 1 (DDR1), участвующий в образовании линейных интрадосом 8 .
Двумерная смешанная матрица позволяет нам количественно оценивать активность деградации матриц линейных интрадосом методом зимографии in situ . Этот анализ сообщает о протеолитической активности ММР путем анализа присутствия черных дыр в флуоресцентном желатиновном слое. Интересно, что организация F-актина в линейные инвадусомы увеличивает активность деградации матрицы по сравнению с только желатином 7 . Одно из ограничений этого анализа состоит в том, что желатин является нефизиологической матрицей, и было продемонстрировано, что более физиологическая матрица меняет клеточный ответ на микроокружение. Дополнительное ограничение существует в способе количественного определения активности ММР в смешанных матрицах желатин-коллаген I. Только деградация желатина, которая локализуется под коллагеном I fiСлой bril можно количественно определить; Поэтому это косвенный метод количественной деградации матрицы коллагена I. Альтернативным методом визуализации активности деградации линейных интрадосом является маркировка волокон коллагена I конкретным антителом против сайтов расщепления коллагена (Col1-3 /4 C, иммуноглобулин). Это позволяет визуализировать расщепленные волокна иммунофлуоресценцией. Однако из-за миграции клеток это антитело не очень специфично в 2D для деградации из-за линейного образования инвадосом. Другой способ визуализации и количественной оценки деградации активности волокон коллагена I заключается в использовании многофотонной микроскопии и генерации второй гармоники 8 . Этот метод позволяет визуализировать волокна коллагена I без какого-либо окрашивания.
Наш метод полимеризации коллагена I типа отличается от других методов, используемых в литературе 12 , 13 . Например, гостиницы Чтобы изучить участие линейных инвадомоз в клеточной инвазии, использовался 3D-анализ коллагена I. Ядро 3D-коллагена I уже используется научным сообществом для изучения инвазивных структур или участия металлопротеиназ в процессе вторжения 14 , 15 , 16 . Эти типы трехмерных матриц имеют ограничения относительноR жесткость, например, трехмерная коллагеновая оболочка I менее жесткая, чем 2D-матрица. Более того, тип и происхождение коллагена I также важны для различной организации коллагеновых волокон in vivo 17 . Наконец, в отношении состава микроокружения in vivo основное внимание уделялось только одному элементу внеклеточной матрицы - коллагена I типа. Дальнейшее исследование необходимо для определения значимости линейных интрадосом in vivo . В дополнение к изучению линейных интрадосом смешанная матрица, описанная здесь, может быть использована с другими типами матричных компонентов, такими как фибронектин, витронектин и другие типы коллагенов ( например, коллаген типа IV). Этот протокол может быть адаптирован в зависимости от типов интересующих матричных элементов и процессов, подлежащих изучению. Однако ясно, что генерирование комплексных и физиологических матриц позволит идентифицировать neW, связанных с адгезией клеток, миграцией и инвазией.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
JDM поддерживалась стипендией PhD от INSERM / Région Aquitaine и в настоящее время поддерживается последипломным отделением ARC и Институтом рака Tisch в Медицинской школе горы Синай. EH поддерживается доктором философии от Министерства обороны и де ла Recherche. ZE поддерживается пост-докторской стипендией от Agence Nationale de la Recherche (ANR). CM поддерживается Институтом рака Тиша в Медицинской школе горы Синай, а JJBC поддерживается грантом NIH / NCI K22CA196750, Фондом JJR Фонда исследований рака молочной железы TCI и Институтом рака Tisch в Медицинской школе горы Синай. Эта работа была поддержана грантом ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS поддерживается «Национальной лигой борьбы с раком». VM и FS поддерживаются при финансовой поддержке «Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016» и Национального института рака, INCA_8036 и PLBio2012.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin solution | Sigma | G1393 | Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml |
| Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate | Molecular probe life technologies | G13186 | 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water |
| Microscope cover glasses | Marlenfeld GmbH & Co | 111520 | Ø12mm No.1 |
| 2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 | Electron microscopy science | 15960 | Dilute at 0.5 % in sterile water |
| 1x PBS pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010-015 | Use this PBS in all steps before fixation |
| Collagen I Rat tail | Corning | 354236 | |
| 5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester | Life technologies | C-6125 | |
| DPBS 1x + calcium + magnesium | Gibco by life technologies | 14040-091 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron microscopy science | 15710 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 10x PBS buffer pH 7.4 | Ambion | AM9625 | Dilute at 1X in water Use in steps after fixation |
| Tks5 antibody | Santa Cruz | sc-30122 | Invadosome markers Dilution : 1/100 |
| Cortactin 4F11 antibody | Millipore | 5180 | Invadosome markers Dilution :1/100 |
| DDR1 antibody | Cell signaling | 5583 | Linear invadosome receptor |
| Dilution :1/100 | |||
| Phalloidin FluoProbes | Interchim | FT-AZ0330 | Fibrillary actin marker Dilution :1/200 |
| Hoechst | Sigma | 33258 | Nucleus marker Dilution :1/200 |
| Secondary antibodies FluoProbes | Interchim | FP-488 FP-547H or FP-647H | |
| Albumin from bovine serum | Sigma | A2153 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Fluoromount G mounting medium | Interchim | FP 483331 | |
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| Cell culture insert | Corning | 353097 | 8.0µm pore size / 24 wells |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 221465 |
References
- Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).
- Gilkes, D. M., et al. Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Di Martino, J., et al. Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes. Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).
- Juin, A., et al. Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes. Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).
- Juin, A., et al. Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway. J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).
- Martin, K. H., et al. Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts. J. Vis. Exp. , e4119 (2012).
- Diaz, B. Invadopodia detection and gelatin degradation assay. Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).
- Artym, V. V., et al. Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network. J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).
- Schachtner, H., et al. Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane. Blood. 121, 2542-2552 (2013).
- Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay. Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).
- Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102, 3262-3269 (2003).
- Geraldo, S., et al. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo? Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).
- Monteiro, P., et al. Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia. J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).
