Protocol
1. Подготовка материалов и среды культивирования
- Для рассечение и диссоциации ЗКН, оберните матрицу мозга, обоюдоострым лезвием бритвы и пинцета с алюминиевой фольгой, а затем стерилизовать их автоклавированием.
- Приготовьте 50 мл холодного буфера PBS, чтобы вымыть весь мозг мыши.
- Настройка рассечение микроскопа и подготовить хирургических инструментов, необходимых для рассечения мозга (автоклавного ножницами и пинцетом) и изоляцию (мл шприца 1, 30 G иглы, матрицы мозга и тонким пинцетом) ЗКН.
- Получение N2 среды:
- Готовят F-12 / DMEM (+ L-глутамин + бикарбонат натрия) среда с 2% B27, 1% N2 добавки и 1% пенициллина-стрептомицина.
Примечание: Питательная среда состоит из N2 среды и факторов роста (20 нг / мл фактора роста очищенного эпидермальный (EGF) и 20 нг / мл основного фактора роста фибробластов (bFGF2)).
- Готовят F-12 / DMEM (+ L-глутамин + бикарбонат натрия) среда с 2% B27, 1% N2 добавки и 1% пенициллина-стрептомицина.
- Приготовьте буфера пищеварения (40 ед / мл папаин, / dispas 2,4 единицы мле II, и 2% пенициллина-стрептомицина в PBS) для переваривания ткани.
- Приготовление покрывающей плиты и покровного:
- Готовят поли-L-орнитин (ПЛО; 0,01%) и ламинин (10 мкг / мл , растворенный в дН 2 O). Для покрытия 6-луночные планшеты для поддержания ЗКН-aNSCs в виде монослоя или 18 мм покровные для иммунологического окрашивания, инкубировать их с ПЛО в течение ночи при температуре 4 ° С. Затем промыть их 3 раза DH 2 O. Разрешить планшеты и покровные высохнуть после последней промывки.
- Затем, инкубировать пластин с ламинин в течение ночи при температуре 4 ° С. Затем промойте их 3 раза DH 2 O.
Предостережение: Не сушите ламинин, которые будут влиять на прикрепление клеток.
Примечание: Растворы для нанесения покрытий могут быть повторно использованы в 3 раза.
2. Выделение и Диссоциация ЗКН взрослых
- До начала подготовки культуры, поместите матрицу мозга и обоюдоострым бритву на льду.
Примечание: Не замораживать матрицу мозга, потому что брайн может прикрепить к нему. - Жертвоприношение мышь (8 недель) с помощью СО 2 удушья или цервикальной дислокации.
- Отрезать голову с острыми ножницами после распыления 70% этанола. Для иммобилизации головы, удерживайте обе стороны головы плотно. Обрежьте кожу с помощью ножниц по срединной линии в хвостовом-ростральной направлении. Это способствует полному удалению кожи от черепа.
- Снимите хвостовую часть черепа (заднего лямбда), а затем вставьте щипцов между черепом и мозгом в положении средней линии спины. Возьмите левый (или правый) теменной кости и тщательно очистить его. Повторите эту процедуру для удаления другой теменной кости.
Примечание: Разъединение зрительного нерва и снятия мозговой оболочки из мозга сделать его легче отделить мозг от черепа. - Перенести мозг холодным буфером PBS (25 мл) и промыть его в два раза, чтобы удалить избыток крови.
- Поместите мозг в матрицу мозга на льду и маKE корональные сокращений, чтобы получить срезы толщиной 1 мм. Перенесите срезы мозга (1 мм), содержащие регионы ЗКН, которые расположены в задней части мозга к холодным PBS в 35 мм пластиковые чашки Петри.
Внимание: Для того чтобы получить параллельную плоскость корональных секций, убедитесь, что Трещина мозг помещается в средней линии матрицы мозга; очень важно, чтобы избежать ненужных изменений в секциях.
Примечание: Получение срезов мозга на 2-3 мм кзади от темени; это позволяет разделение ЗКН от SVZ. - Под микроскопом рассекает с небольшим увеличением, микро-рассекают ЗКН из белой области вещества коры и гиппокампа с изогнутым 30G иглы 6,9. Затем удалите регионы коры над ЗКН. Поместите расчлененный ЗКН область от срезов в 35 мм пластиковые чашки Петри на льду без холодной PBS.
Примечание: Заражение дополнительных областей, содержащих зрелые нейроны могут повлиять на жизнеспособность aNSCs и нейросфера пласта боскольку они подвергаются клеточной гибели в условиях культивирования aNSC. - Используя согнутую 30 G иглы, немедленно прервите рассеченные ткани на мелкие кусочки.
Примечание: Если требуется больше времени для рассечения тканей ЗКН, погрузить рассеченные ткани в холодной PBS, прежде чем измельчать. - Повторное приостановить нарезанную ткань с 1 мл буфера пищеварения, переноса ткани в 15 мл пробирку, содержащую 2 мл буфера пищеварения, и инкубировать ее в течение 30 мин на водяной бане 37 ° C.
Примечание: встряхивать пробирку каждые 10 минут, чтобы хорошо перемешать.
3. Зона-расположенный под мозолистым телом полученных для взрослых Neural стволовых клеток культуры
- Нажмите на трубку слегка диссоциировать переваренной ткани, а затем отцентрифугировать пробирку при 145 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант, ресуспендируют переваренной ткани с 1 мл подогретого среды N2 промыть буфера пищеварения, и осторожно пипеткой раствор образца максимум 5 раз с использованием P1000 пипетки.
Примечание: Over-растиранием с узкимпипетку наконечник может уменьшить жизнеспособность клеток и последующего роста. - Отцентрифугировать пробирку при 145 х г в течение 5 мин. После удаления надосадочной жидкости, повторно приостанавливать осадок клеток в 1 мл среды N2.
- Подготовить 1 мл N2 среды в непокрытой 6-луночного планшета и добавляют 1 мл взвешенных клеток, чтобы сделать окончательный объем 2 мл.
- Добавить EGF (20 нг / мл) и bFGF (20 нг / мл) в каждую лунку. Осторожно встряхните 6-луночного культуры блюдо вручную, чтобы смешать добавленные факторы роста с посеянных клеток. Держите 6-луночного планшета в 37 ° C и 5% CO 2 инкубаторе.
- Добавить EGF (20 нг / мл) и bFGF (20 нг / мл) в каждую лунку, каждый день в течение 8 дней. Каждый третий день, добавьте 200 мкл N2 сред для поддержания ориентировочный объем 2 мл среды.
4. пассажи NSCs в нейросферах и однослойные культуры
- Соберите нейросферы и перенести их в новый 15 мл коническую трубку.
Примечание: Количество нейросферах (диаметром> 50 мкм) PER также от ЗКН одного мозга мыши составляет 64,3 ± 7,31, что было меньше , чем у СВЗ (190,5 ± 6,33) 9. - Инкубируйте нейросферы 0,5 мл диссоциации буфера в течение 5 мин на водяной бане 37 ° C, чтобы диссоциировать нейросферы на отдельные клетки. Первичные нейросферы могут быть диссоциированы на отдельные клетки и сохраняется в течение нескольких пассажей, как нейросфера или однослойных культур.
Примечание: Расширение ЗКН-aNSCs в виде монослоя превосходит нейросферах, потому что ЗКН-aNSCs можно пассировать> 10 раз в формате монослой культуры, но <5 раз в формате нейросфера культуры.
Внимание: ЗКН-aNSCs демонстрируют сильную агрегацию, и его трудно отделить их в отдельные клетки. Таким образом, формат культуры нейросфера не рекомендуется для расширения рутинного клеток. - Аккуратно пипеткой раствор образца вверх и вниз с P1000 пипетки менее чем в 5 раз и отцентрифугировать пробирку при 145 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно-супровести нейросферы с 1 мл N2 среды.
Примечание: Над растиранием с узким кончиком пипетки может уменьшить жизнеспособность клеток и последующего роста. - Для подсчета клеток, сделать смесь 1: 1 клеточной суспензии (10 мкл) и 0,4% -ным раствором трипанового синего, а затем подсчитывают количество живых клеток на гематоцитометр. После нанесения покрытия на 6-луночный планшет с ПЛО / ламинин, высевания клеток при 2,5 х 10 5 клеток / мл с помощью 2 мл N2 среды для каждой лунки.
Примечание: Изменения в плотности клеток может повлиять на их состояние и дифференциации потенциал. - Поддерживать ЗКН-aNSCs с ежедневной обработкой факторов роста (2 мл, 20 нг / мл) в течение 5 дней, и их прохождение их.
5. Разграничение зон-расположенный под мозолистым телом стволовых клеток, полученных для взрослых Neural
- Пластинчатые aNSCs на в ПЛО / Laminin покрытием 18 мм покровное с 1 × 10 5 клеток / мл в 1 мл N2 с факторами роста (20 нг / мл) для дифференциации ЗКН-aNSCs.
- Следующий день,когда клетки прочно прикреплены к покровным, обменивать ростовой среды с N 2 для удаления факторов роста.
- Через 6 дней, моют дифференцированных клеток с 1 мл PBS для удаления остатков клеток и закрепить их за иммунным окрашиванием.
Примечание: BrdU, могут быть включены в состав вновь синтезированной ДНК пролиферирующих клеток. Поэтому, при желании, BrdU (10 мкг / мл) могут быть добавлены в живые клетки перед фиксацией клеток.
6. Иммунологическое взрослых нервные стволовые клетки и дифференцированные Предшественники
- Для иммунным окрашиванием, мыть клетки с PBS и исправить их с 4% PFA в течение 20 мин при комнатной температуре.
Внимание: PFA является высокотоксичным; избегать контакта с кожей и глазами. - Удалите 4% PFA, ополоснуть неподвижные клетки с PBS 3 раза, а затем хранить их при температуре 4 ° Cuntil они необходимы для иммунной окраски.
- Инкубируйте клетки на покровное с блокирующим раствором (3% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% Тритон Х-100 в 1x РБС) в течение по крайней мере 30 мин при комнатной температуре.
- Подготовка первичных антител в свежем блокирующем растворе и инкубируют образцы в течение ночи при температуре 4 ° С.
- Иммуноокрашивание в aNSCs
- Пятно aNSCs с использованием анти-Nestin и анти-BrdU антител. Перед фиксацией, добавьте 20 мкг BrdU к aNSCs и инкубировать их в течение 2 ч. Выполните шаг денатурирующих с использованием 2 N HCl в течение 20 мин при 37 ° CBefore проведения стадии блокировки.
- Иммуноокрашивание дифференцированные клетки-предшественники:
- Используйте анти-O4, анти-BIII-тубулина, а также анти-глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) антител к маркировать дифференцированные клетки-предшественники.
- Иммуноокрашивание в aNSCs
- Промыть образцы с PBS 3 раза и инкубировать их с вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентными красителями (1: 500) в блокирующем растворе в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем промыть образцы 3 раза PBS.
Примечание: Используйте вторичные антитела, которые соответствуют хозяев первичногоантитела. Hoechest33343 (1: 2000) используется для ядерного окрашивания. - Добавить решение для монтажа на предметное стекло и приступить к монтажу. Обратите внимание и изображение образца на конфокальной микроскопии на нескольких длинах волн: FITC (488 нм), Су3 (543 нм), Су5 (647 нм) и Hoechest33343 (405 нм).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Определение системы культуры для aNSCs от неизвестного нейрогенной области имеет важное значение для понимания этих клеток и для развития их потенциального использования в ремонте мозга 12. Известно , что NSCs в разных стадиях развития или в разных регионах по- разному ведут себя 3,4. Недавно было сообщено о том, что ЗКН-производные клетки обладают дифференциальные потенциалы для дифференцировки нейронов в естественных условиях и в пробирке по сравнению с СВЗ-клеток , полученных 7-9. Поэтому, чтобы точно изолировать каждую нейрогенный область, срезы мозга , которые включают ЗКН препарировали с использованием матрицы мозга толщиной 1 мм (Рис . 1А) После 8 дней культивирования с факторами роста, aNSCs , полученные из ЗКН могут образовывать нейросферы, в которой клетки могут быть впоследствии сохраняется (Фигура 1В).
Так как подмножество NSCs в нейросферах может быть SPOntaneously дифференцированы 13, система культуры монослоя также полезно для поддержания относительно однородной популяции ЗКН-aNSCs. Факторы роста и диссоциации ферментов , таких как трипсин , не легко проникают глубоко внутрь в нейросфера 14,15. Однослойные культуры обеспечивают более равномерное условия для расширения NSCs. Из первичных нейросферах, ЗКН-aNSCs диссоциируют на отдельные клетки путем обработки переваривания буфера. Через один день после посева клеток, aNSCs были прикреплены к пластине с покрытием и выставлены пролиферации клеток (Фигура 2А). Для того, чтобы подтвердить их эффективность пролиферации, BrdU добавляли в среду. После инкубации с BrdU в течение 2 ч, клетки легко окрашивали антителами к BrdU (маркера пролиферации) и анти-Nestin (маркера для нервных стволовых клеток) антител, что свидетельствует о том, что ЗКН-aNSCs активно пролиферирующие и сохранение ключевых свойств стволовые клетки (рис. 2 , б) Соответственно, они не делали EXHibit маркеры для дифференцированных клеток, таких как EGFR (в скоротечно-усилительных клетках) и DCX (выраженное в нейробластов) (фиг.2с).
Для подтверждения многократного дифференцирования потенциала ЗКН-aNSCs, факторы роста, были удалены из культуральной среды. Через 6 дней клетки подвергали иммунному окрашиванию с различными производителями для дифференцированных клеток. Для того, чтобы демонстрировать различные потомствах aNSCs, маркеры для нейронов (Tuj1), астроциты (GFAP) и олигодендроциты (O4) использовали; все эти типы клеток были получены из ЗКН-aNSCs (рисунок 3).
Рисунок 1: Выделение области ЗКН и формирования нейросфера. (A) Процедура вскрытия ЗКН области от мозга взрослых мышей. К культуре ЗКН-АnСтволовые, 8-недельных мозг мыши помещается на матрицу мозга (с интервалом 1 мм). После секционирования 1 мм срезах мозга, которые включали область ЗКН (2-3 мм от темени) рассекали (обозначено красной пунктирной линией). Образование (B) нейросфера. Через восемь дней после культивирования в пробирке, первичные нейросферах (пассаж 0) были сформированы и пассируют. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Техническое обслуживание ЗКН-aNSCs в качестве однослойной культуры. (А) Через день после посева расчлененный клетки, ЗКН-aNSCs были прикреплены и расширена на чашку с покрытием в однослойной образом (слева). Через три дня после того, как техническое обслуживание, было увеличено количество ЗКН-aNSCs (справа). (В) Иммуноокрашивание с BrdU (красный, маркер пролиферирующих клеток), Nestin (зеленый, маркер нервных стволовых клеток), и Hoechest33343 (синий, маркер для ядер). (C) Иммуноокрашивание с нервных стволовых / маркеры клеток - предшественников Nestin (красный, маркер для типа В нервных стволовых клеток), EGFR (зеленый, маркер для типа С переходных-усилительных ячеек) и DCX (синий, маркер для типа А нейробласты). Ядра контрастно с Hoechest33343 (белый). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Иммунологическое дифференцированных клеток из ЗКН-aNSCs. Иммуноокрашивание с маркерами дифференцировки Tuj1 (зеленый, маркер для незрелых нейронов), O4 (красный, маркер для олигодендроцитов) и GFAP (оратьвл, маркер астроцитов). Увеличенные изображения показаны как вставках. Hoechest33343 (синий) использовали для борьбы с окрашиванием ядер. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данной статье описывается подробный протокол для генерации NSCs из ЗКН взрослых мышей и поддерживать их для различных применений. Есть три важных шагов для создания пробирке системы культуры в необходимой для очистки и расширения ЗКН-NSCs. Во- первых, важно обеспечить, чтобы ЗКН область точно иссекают из других потенциальных нейрогенных областей (Фигура 1В). Толстые и точные разделы , содержащие участки ЗКН были получены с интервальной матрицы мозга на 1 мм, а затем тонкая игла была использована для микро-рассечение ЗКН из других корковых областей (Рис . 1А) Когда не-NSC , от соседних тканей, таких как коре головного мозга, культивируют с ЗКН-aNSCs, происходит катастрофическое смерть, которая отрицательно влияет на жизнеспособность и сфера-образование ЗКН-NSC , 16-18,22. Хвостовой ЗКН (2-3 мм позади темени) был утвержден в качестве лучшего региона для создания различных ЗКН-aNSCs. Во-вторых, appropетел ферментативную обработку в уборочных и пассирования шагов имеет решающее значение для достижения высокого выхода клеток. Диспаза II и папаин были более эффективны для изоляции aNSCs чем трипсин. Разобщение клеток для пересева с буфером диссоциации вместо трипсина повысили свою жизнеспособность 19. Механические диссоциации и растирания с помощью пипетки должно быть минимальным. В-третьих, клеточный фильтр, как правило, используется в системах первичной культуре, чтобы удалить остатки клеток после расщепления ткани. Тем не менее, из-за локализации ЗКН-aNSCs, эти клетки получают после поломки белого вещества путем ферментативного расщепления и механического растирания. В процессе фильтрации с сотовым фильтром, значительное количество клеток будет потеряна. Таким образом, культивирование ЗКН-aNSCs без использования ячейки фильтра является лучшим способом, чтобы получить высокий выход клеток.
В то время как оба нейросфера культур и однослойные культуры могут быть применены к поддержанию NSC, одно ограничение нейросфера культуры является то, что одиночный NSCs диссоциируют после расщепления может быть случайным образом агрегируются. Результаты агрегации в различных размеров нейросферах. Когда размер нейросфера достигает определенного критического значения, то нейросфера растет как гетерогенную структуру, из - за недостатка питательных веществ, факторов роста и кислорода в ядре 20. Кроме того, нейросферы с большими размерами не легко диссоциируют с диссоциации буфера и требуют больше времени обработки ферментативных с обширным механическим растиранием, что приводит к снижению жизнеспособности клеток. Таким образом, система монослойной культуры рекомендуется поддерживать ЗКН-aNSCs через несколько проходов. В системе монослойной культуры, aNSCs стабильно поддерживается как NSCs (тип В) без спонтанной дифференцировки в указанных клетках, таких как предшественниках (типов С и А) (фиг.3А). ЗКН-aNSCs были пассировать в течение длительных периодов, <5 пассажей в формате нейросфера и> 10 проходов в виде монослоя. Это минусынесуществующих с предыдущими результатами, которые свидетельствуют о том , что система культуры монослоя поддерживает NSCs в пробирке в долгосрочных культурах 21. Тем не менее, скорость пролиферирующих уменьшилась, а доля умирающих клеток увеличивалось в течение 5 ходов. Расширенная пассажи влияет на мультипотентность и дифференцировку нейронов с увеличенной хромосомных аберраций 22. Поэтому, чтобы избежать расширенных эффектов пассажей, рекомендуется использовать ранний проход (<5) прохождение клеток для пролиферации и дифференцировки анализа. Хотя потенциал для самообновления ЗКН-aNSCs похож на СВЗ-aNSCs, менее дифференцировка нейронов было показано в ЗКН-aNSCs 9.
Способы выделения aNSCs из нейрогенных областей мозга взрослого человека, в том числе СВЗ и зубчатой извилине (DG), были созданы 22. Хотя такие протоколы способствовали выделению и культивированию aNSCs в лабораторных условиях, существует несколько ограничений на получение большого числаклетки. Многие протоколы используют измельчитель ткани головного мозга, что может привести к потере мозговой ткани во время процедуры измельчения. Другой подход, чтобы изолировать aNSCs из нейрогенных регионов использует корональной разрез через мозг с помощью скальпеля. За этим следует микро-диссекции SVZ или ГД вдоль продольной щели 23. Присутствие других областей головного мозга может вызвать другие типы клеток , чтобы загрязнять культуру aNSC, которые могут повлиять на жизнеспособность клеток в пробирке. С помощью текущего протокола, много различных образцов можно управлять в одном эксперименте, в том числе по сравнению с контролем различных экспериментальных групп. Кроме того, нарезка с использованием матрицы мозга превосходит инструмент мозга разделочной, так как она позволяет для достижения NSCs из различных областей головного мозга с высоким выходом клеток. Она также позволяет сравнивать aNSCs из различных регионов одного и того же мозга.
Трансплантация и инженерных эндогенных NSCs были considered в качестве возможных стратегий терапии стволовых клеток. Для этого, в пробирке исследования о характеристиках aNSCs также должны быть всесторонне изучены. Таким образом, создание хорошо охарактеризованный в системе культуры пробирке будет полезно для дальнейшего применения NSCs. В этой системе культуры, свойства стволовых клеток из ЗКН-aNSCs были в хорошем состоянии, о чем свидетельствует самообновлению и множественным клонального дифференциации при соответствующих условиях. Таким образом, эта система культуры можно использовать для расширения ЗКН-aNSCs для биологических исследований и терапевтических применений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium components | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | +L-glutamin, +Sodium bicarbonate |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Growth factor | |||
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Buffer | |||
| PBS (10x) | BIOSOLUTION | BP007a | 1x dilution |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dissociattion buffer | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Tool | |||
| Fine forceps | WPI | 555229F | |
| Scissors | Storz | E3321-C | |
| Brain matrix (1 mm) | RWD | 68707 | |
| Double-edged razor | DORCO | ST-300 | |
| 30 G needle | SUNGSHIM | N1300 | |
| Materials | |||
| 15 ml tubes | SPL | 50015 | |
| 50 ml tubes | SPL | 50050 | |
| 35 mm dish | SPL | 10035 | Petri dish |
| 100 mm dish | SPL | 10090 | Petri dish |
| Cover slip (18 mm) | Deckglaser | 111580 | |
| 12 well dish | SPL | 32012 | non-coating |
| 6 well dish | SPL | 32006 | non-coating |
| Coating materials | |||
| PLO | Sigma | P4957 | 0.01% |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | 10 mg/ml |
| Primary antibodies | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | mouse (1:1,000) |
| EGFR | Abcam | ab2430 | rabbit (1:1,000) |
| DCX | Santa Cruz | SC8066 | goat (1:500) |
| Tuj1 | Sigma | T2200 | rabbit (1:2,000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | rat (1:1,000) |
| O4 | Millipore | MAB345 | mouse (1:500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | Rat (1:500) |
| Secondary antibodies | |||
| anti-mouse 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| anti-mouse cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| anti-mouse 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| anti-rabbit 488 | Alexa | A21206 | |
| anti-rabbit cy3 | Jackson | 711-165-152 | |
| anti-rabbit 647 | Jackson | 711-605-152 | |
| anti-goat 488 | Alexa | A11055 | |
| anti-goat cy3 | Jackson | 705-165-147 | |
| anti-goat 647 | Invitrogen | A21447 | |
| anti-rat 488 | Invitrogen | A21208 | |
| anti-rat cy3 | Jackson | 712-166-150 | |
| anti-rat 647 | Jackson | 712-605-153 | |
| Immunostaining materials | |||
| BSA | Millipore | 82-100-6 | 3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS |
| Triton X-100 | usb | 22686 | |
| 4% PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Life Technology | H3570 | Dye for staining nuclei |
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Developmental biology. 175, 1-3 (1996).
- Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PloS one. 2, e388 (2007).
- Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M.
- Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Hippocampus. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, a018812 (2015).
- Gage, F. H.
- Seri, B., et al. Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain. Cereb Cortex. 16 Suppl 1, i103-i111 (2006).
- Kim, W. R., et al. Evidence for the spontaneous production but massive programmed cell death of new neurons in the subcallosal zone of the postnatal mouse brain. The European journal of neuroscience. 33, 599-611 (2011).
- Kim, H. J., Kim, J. Y., Sun, W. Age-dependent changes in the subcallosal zone neurogenesis of mice. Neurochemistry international. 61, 879-884 (2012).
- Kim, J. Y., et al. Promotion of Cortical Neurogenesis from the Neural Stem Cells in the Adult Mouse Subcallosal Zone. Stem Cells. , (2015).
- Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature medicine. 9, 439-447 (2003).
- Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals? Nature reviews. Neuroscience. 8, 481-488 (2007).
- Gage, F. H., Temple, S. Neural stem cells: generating and regenerating the brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
- Shaker, M. R., Kim, J. Y., Kim, H., Sun, W. Identification and characterization of secondary neural tube-derived embryonic neural stem cells in vitro. Stem cells and development. 24, 1171-1181 (2015).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular neurobiology. 34, 153-161 (2006).
- Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14506-14511 (2002).
- Richards, L. J., Kilpatrick, T. J., Bartlett, P. F. De novo generation of neuronal cells from the adult mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 8591-8595 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 3287-3297 (1999).
- Wachs, F. P., et al. High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 949-962 (2003).
- Xiong, F., et al. Optimal time for passaging neurospheres based on primary neural stem cell cultures. Cytotechnology. 63, 621-631 (2011).
- Lee, S. W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19, 175-180 (2015).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature protocols. 7, 2005-2012 (2012).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. JoVE (Journal of Visualized Experiments). , e51225 (2014).
