Protocol
1. Preparación de Materiales y Medio de Cultivo
- Para la disección y la disociación de la SCZ, envolver la matriz de cerebro, hoja de doble filo de afeitar, y las pinzas con papel de aluminio y, a continuación, esterilizarlos en autoclave.
- Preparar 50 ml de tampón de PBS fría para lavar todo el cerebro del ratón.
- Establecer un microscopio de disección y preparar las herramientas quirúrgicas requeridas para la disección del cerebro (tijeras y pinzas en autoclave) y el aislamiento de la (jeringa de 1 ml, 30 aguja G, matriz de cerebro, y unas pinzas finas) SCZ.
- Preparación de N2 Medio:
- Preparar F-12 / DMEM (+ L-glutamina, + bicarbonato de sodio) medio con 2% B27, 1% suplementos de N2, y 1% de penicilina-estreptomicina.
Nota: El medio de crecimiento consiste en N2 medianas y factores de crecimiento (20 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico purificada (EGF) y 20 ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF2)).
- Preparar F-12 / DMEM (+ L-glutamina, + bicarbonato de sodio) medio con 2% B27, 1% suplementos de N2, y 1% de penicilina-estreptomicina.
- Preparar un tampón de digestión (40 unidades / ml de papaína, 2,4 unidad / ml dispase II, y 2% de penicilina-estreptomicina en PBS) para la digestión del tejido.
- Preparación de la placa de revestimiento y Coverslip:
- Preparar poli-L-ornitina (OLP; 0,01%) y laminina (10 mg / ml disueltos en DH 2 O). Para revestir placas de 6 pocillos para el mantenimiento de SCZ-aNSCs como una monocapa o cubreobjetos de 18 mm para la inmunotinción, incubarlos con la OLP durante la noche a 4 ° C. Entonces ellos lavar 3 veces con DH 2 O. Dejar que las placas y los cubreobjetos se sequen después del último lavado.
- A continuación, se incuban las placas con laminina durante la noche a 4 ° C. A continuación, lavar 3 veces con DH 2 O.
Precaución: No secar la laminina, lo que afectará a la unión celular.
Nota: Las soluciones de revestimiento se pueden reutilizar 3 veces.
2. Aislamiento y disociación de la SCZ adulto
- Antes de la preparación de cultivo, colocar la matriz cerebro y la maquinilla de afeitar de doble filo en hielo.
Nota: No congelar la matriz cerebral, debido a que el anchoain podría agregar a dicho informe. - Sacrificio un ratón (8 semanas de edad) por asfixia con CO2 o dislocación cervical.
- Cortar la cabeza con unas tijeras afiladas después de rociar 70% de etanol. Para inmovilizar la cabeza, sujete los dos lados de la cabeza con fuerza. Cortar la piel con unas tijeras en la línea media en dirección caudal rostral. Esto promueve la eliminación completa de la piel del cráneo.
- Retire la parte caudal del cráneo (posterior a la lambda) en primer lugar y, a continuación, insertar la pinza entre el cráneo y el cerebro en la posición de la línea media dorsal. Agarrar el hueso parietal izquierda (o derecha) y cuidadosamente pele apagado. Repita este procedimiento para la eliminación del otro hueso parietal.
Nota: La desconexión del nervio óptico y la eliminación de las meninges del cerebro que sea más fácil separar el cerebro del cráneo. - Transferir el cerebro a un tampón de PBS frío (25 ml) y enjuague dos veces para eliminar el exceso de sangre.
- Coloque el cerebro en la matriz cerebral en hielo y make cortes coronales para obtener rodajas de 1 mm de espesor. La transferencia de los cortes de cerebro (1 mM) que contenía las regiones SCZ que se encuentran en la parte posterior del cerebro a un PBS frío en una placa petri de plástico 35 mm.
Precaución: Con el fin de obtener un plano paralelo de secciones coronales, asegúrese de que la fisura cerebro se coloca en la línea media de la matriz de cerebro; es crítico para evitar variaciones innecesarias en las secciones.
Nota: Obtener cortes de cerebro a 2-3 mm posterior al bregma; esto permite la separación de la SCZ de la SVZ. - Bajo el microscopio de disección con un aumento bajo, micro-diseccionar el SCZ desde el área de materia blanca de la corteza y el hipocampo con un 6,9 aguja 30G doblada. A continuación, retire las regiones de la corteza por encima de la SCZ. Coloque la región SCZ disecados de las rebanadas en una placa petri de plástico de 35 mm en el hielo sin PBS frío.
Nota: La contaminación de las regiones adicionales que contienen las neuronas maduras podría afectar a la viabilidad de aNSCs y la formación de neuroesferas bebido a que se someten a la muerte celular en condiciones de cultivo ANSC. - Usando una aguja doblada 30 G, cortar inmediatamente los tejidos disecados en trozos pequeños.
Nota: Si se requiere más tiempo para diseccionar el tejido SCZ, sumerja los tejidos disecados en PBS frío antes de cortar. - Vuelva a suspender el tejido picado con 1 ml de tampón de digestión, la transferencia de tejido a un tubo de 15 ml que contiene 2 ml de tampón de digestión, y se incuba durante 30 min en un baño de agua a 37 °.
Nota: Agitar el tubo cada 10 minutos para mezclar bien.
3. derivados de Zona subcallosal Cultura adulto Neural Stem Cell
- Toque suavemente el tubo para disociar el tejido digerido, y centrifugar el tubo a 145 g durante 5 min. Descartar el sobrenadante, se resuspendió el tejido digerido con 1 ml de medio precalentado N2 para lavar el tampón de digestión, y la pipeta suavemente la solución de muestra un máximo de 5 veces usando una pipeta P1000.
Nota: El exceso de trituración con una estrechapunta de la pipeta puede disminuir la viabilidad celular y el crecimiento subsiguiente. - Centrifugar el tubo a 145 xg durante 5 min. Después de desechar el sobrenadante, volver a suspender el sedimento celular en 1 ml de medio N2.
- Preparar 1 ml de medio N2 en una placa no recubierta 6 pocillos y añadir 1 ml de las células suspendidas para hacer un volumen final de 2 ml.
- Añadir EGF (20 ng / ml) y bFGF (20 ng / ml) en cada pocillo. Agitar suavemente la placa de cultivo de 6 pocillos con la mano para mezclar los factores de crecimiento añadidos a las células sembradas. Mantenga la placa de 6 pocillos en un incubador de CO2 al 37 ° C y 5%.
- Añadir EGF (20 ng / ml) y bFGF (20 ng / ml) a cada pocillo cada día durante 8 días. Cada tercera día, añadir 200 l de los medios de comunicación N2 para mantener el volumen aproximado 2 ml del medio.
4. pases de células madre neurales como neuroesferas y para los cultivos en monocapa
- Reunir las neuroesferas y transferirlos a un nuevo tubo cónico de 15 ml.
Nota: El número de neuroesferas (> 50 micras de diámetro) per bien desde el SCZ de un solo cerebro de ratón era de 64,3 ± 7,31, que era menor que la de la SVZ (190,5 ± 6,33) 9. - Incubar las neuroesferas con 0,5 ml de tampón de disociación de 5 minutos en un baño de agua a 37 ° para disociar las neuroesferas en células individuales. neuroesferas primarias pueden disociarse en células individuales y se mantuvieron durante varios pasajes como los cultivos de neuroesferas o monocapa.
Nota: La expansión de SCZ-aNSCs como una monocapa es superior a neuroesferas porque SCZ-aNSCs pueden ser pasados> 10 veces en un formato de cultivo en monocapa, pero <5 veces en un formato de la cultura neurosphere.
Precaución: SCZ-aNSCs exhiben una fuerte agregación, y es difícil de disociar en células individuales. Por lo tanto, el formato de la cultura neurosphere no se recomienda para la expansión de células de rutina. - pipetear suavemente la solución de la muestra de arriba abajo con una pipeta P1000 menos de 5 veces y se centrifuga el tubo a 145 g durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y volver a supasar las neuroesferas con 1 ml de medio N2.
Nota: Durante trituración con una pipeta de punta estrecha puede disminuir la viabilidad celular y el crecimiento subsiguiente. - Para contar las células, hacer una mezcla 1: 1 de la suspensión celular (10 l) y la solución de azul de tripano al 0,4%, y luego contar el número de células vivas en un hematocitómetro. Después de recubrir una placa de 6 pocillos con PLO / laminina, la placa de las células a 2,5 x 10 5 células / ml con 2 ml de medio de N2 para cada pocillo.
Nota: Los cambios en la densidad celular pueden afectar su condición y potencial de diferenciación. - Mantener los SCZ-aNSCs con un tratamiento diario de factores de crecimiento (2 ml, 20 ng / ml) durante 5 días, y los pasaje ellos.
5. Diferenciación de los derivados de Zona subcallosal células madre adultas Neuronales
- ANSCs placa sobre un cubreobjetos de 18 mm recubiertos de laminina PLO / con 1 x 10 5 células / ml en 1 ml N2 con factores de crecimiento (20 ng / ml) para la diferenciación de los SCZ-aNSCs.
- El día siguiente,cuando las células están firmemente unidos al cubreobjetos, intercambiar el medio de crecimiento con N2 para eliminar los factores de crecimiento.
- Después de 6 días, se lavan las células diferenciadas con 1 ml de PBS para eliminar los restos celulares y fijarlos para inmunotinción.
Nota: BrdU se puede incorporar en el ADN recién sintetizadas de las células proliferantes. Por lo tanto, si se desea, BrdU (10 mg / ml) puede ser añadido a las células vivas antes de la fijación de las células.
6. Las células madre neurales adultas inmunotinción y diferenciada Progenitores
- Para la inmunotinción, se lavan las células con PBS y fijarlas con 4% PFA durante 20 min a temperatura ambiente.
Precaución: PFA es altamente tóxico; evitar el contacto con la piel y los ojos. - Retire el 4% PFA, lavar las células fijadas con PBS 3 veces, y luego almacenarlos a 4 ° Cuntil que son necesarios para la inmunotinción.
- Se incuban las células en cubreobjetos con solución de bloqueo (3% de albúmina de suero bovino y 0,1% de Triton X-100 en 1 x PBS) durante al menos 30 min a temperatura ambiente.
- Preparar los anticuerpos primarios en solución de bloqueo fresco y se incuban las muestras durante la noche a 4 ° C.
- La inmunotinción los aNSCs
- Tinción de las aNSCs utilizando anticuerpos anti-BrdU anti-nestina y. Antes de la fijación, añadir 20 g de BrdU a las aNSCs y incubarlos durante 2 h. Realizar la etapa de desnaturalización usando HCl 2 N durante 20 minutos a 37 ° CAntes la realización de la etapa de bloqueo.
- La inmunotinción los progenitores diferenciadas:
- Utilizar anticuerpos anti-glial fibrilar ácida de la proteína (GFA) anti-O4, anti-bIII-tubulina, y para etiquetar los progenitores diferenciadas.
- La inmunotinción los aNSCs
- Lavar las muestras con PBS 3 veces y se incuban con anticuerpos secundarios conjugados con colorantes fluorescentes (1: 500) en solución de bloqueo durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, lavar las muestras 3 veces con PBS.
Nota: Use anticuerpos secundarios que responden a los anfitriones de la primariaanticuerpos. Hoechest33343 (1: 2000) se utiliza para la tinción nuclear. - Añadir la solución de montaje a un portaobjetos de vidrio y proceder con el montaje. Observe y la imagen de muestra en un microscopio confocal en múltiples longitudes de onda: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm), y Hoechest33343 (405 nm).
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Representative Results
Definir el sistema de cultivo de aNSCs de la región neurogénica desconocido es esencial para la comprensión de estas células y para el desarrollo de su potencial uso en la reparación del cerebro 12. Se sabe que NSCs en diferentes etapas de desarrollo o en diferentes regiones comportan de manera diferente 3,4. Recientemente, se informó de que las células derivadas-SCZ exhiben potenciales diferenciales para la diferenciación neuronal in vivo e in vitro en comparación con las células derivadas de la SVZ 7-9. Por lo tanto, para aislar precisamente cada región neurogénica, rodajas de cerebro, que incluyen la SCZ se diseccionaron usando una matriz de cerebro 1 mm (Figura 1A). Después de 8 días de cultivo con factores de crecimiento, derivados de la aNSCs SCZ pueden formar neuroesferas, en los que las células pueden ser posteriormente mantenidas (Figura 1B).
Desde un subconjunto de NSCs en las neuroesferas puede ser spontaneously diferenciado 13, un sistema de cultivo monocapa también es útil para el mantenimiento de la población relativamente homogénea de SCZ-aNSCs. Los factores de crecimiento y enzimas de disociación tales como la tripsina no penetran fácilmente en el interior de de la neurosphere 14,15. Los cultivos monocapa ofrecen condiciones más uniformes para la expansión de las células madre neurales. De neuroesferas primarias, SCZ-aNSCs se disociaron en células individuales mediante un tratamiento de tampón de digestión. Un día después de la siembra de células, aNSCs se adjunta a la placa recubierta y la proliferación celular exhibido (Figura 2A). Para confirmar su potencia de proliferación, se añadió BrdU en los medios de comunicación. Después de la incubación con BrdU durante 2 horas, las células se tiñeron fácilmente con anti-BrdU (un marcador para la proliferación) y anti-nestina (un marcador de células madre neurales) anticuerpos, lo que indica que SCZ-aNSCs están proliferando y el mantenimiento de las propiedades clave de activamente Las células madre (Figura 2b). De acuerdo con ello, no lo hicieron exhIBIT marcadores de células diferenciadas, tales como EGFR (expresados en las células transitoriamente de amplificación) y DCX (expresado en neuroblastos) (Figura 2C).
Para confirmar el potencial de diferenciación de múltiples SCZ-aNSCs, factores de crecimiento se eliminaron de los medios de cultivo. Después de 6 días, las células fueron immunostained con varios fabricantes de células diferenciadas. Para exponer las diferentes progenies de aNSCs, marcadores para neuronas (TuJ1), astrocitos (GFAP) y oligodendrocitos (O4) fueron empleadas; todos estos tipos de células se generaron a partir de la SCZ-aNSCs (Figura 3).
Figura 1: Aislamiento de la región SCZ y formación de la neuroesfera. (A) Procedimiento para la disección de la región SCZ desde el cerebro de ratón adulto. Para la cultura del SCZ-ANSCs, un 8 semanas de edad, de cerebro de ratón se coloca en una matriz de cerebro (intervalos de 1 mm). Después de seccionar, 1 mm rodajas de cerebro que incluían la región SCZ (2-3 mm del bregma) fueron disecados (indicado por la línea de puntos de color rojo). Formación (B) Neurosphere. Se formaron y se pasaron ocho días después del cultivo in vitro, neuroesferas primarias (pase 0). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Mantenimiento de los SCZ-aNSCs como un cultivo en monocapa. (A) Un día después de la siembra de las células disecadas, SCZ-aNSCs se adjunta y se expandió en una placa recubierta de una manera monocapa (izquierda). Tres días después del mantenimiento, se incrementó el número de SCZ-aNSCs (derecha). (B) Inmunotinción con BrdU (rojo, un marcador de la proliferación de células), nestina (verde, un marcador de células madre neurales), y Hoechest33343 (azul, un marcador de núcleos). (C) La inmunotinción con tallo neural / marcadores de células progenitoras nestina (rojo, un marcador de células madre de tipo B neural), EGFR (verde, un marcador de células transitorias de amplificación de tipo C), y DCX (azul, un marcador para el tipo A neuroblastos). Los núcleos se counterstained con Hoechest33343 (blanco). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La inmunotinción de las células diferenciadas a partir de las SCZ-aNSCs. La inmunotinción con marcadores de diferenciación Tuj1 (verde, un marcador de neuronas inmaduras), O4 (rojo, un marcador de oligodendrocitos) y GFAP (gritarow, un marcador de astrocitos). imágenes ampliadas se muestran como inserciones. Hoechest33343 (azul) se utilizó para la contra-tinción de los núcleos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este documento describe un protocolo detallado para generar células madre neurales de la SCZ ratón adulto y mantenerlas para diversas aplicaciones. Hay tres pasos críticos para el establecimiento del sistema de cultivo in vitro necesaria para purificar y expandir SCZ-NSC. En primer lugar, es importante asegurarse de que la región SCZ se diseca precisamente hacia fuera de otras regiones neurogénicas potenciales (Figura 1B). Secciones gruesas y precisos que contienen las regiones SCZ se obtuvieron con una matriz de cerebro intervalo de 1 mm, y a continuación, se utilizó una aguja fina para la micro-disección de la SCZ de otras regiones corticales (Figura 1A). Cuando no NSCs de los tejidos adyacentes, tales como la corteza cerebral, se cultivan con SCZ-aNSCs, la muerte se produce catastrófica, que afecta negativamente a la viabilidad y la esfera-formación de SCZ-NSCs 16-18,22. El SCZ caudal (2-3 mm posterior al bregma) se confirmó como la mejor región para generar distintas SCZ-aNSCs. En segundo lugar, la approptratamiento enzimático piados en las etapas de cosecha y de los pases es fundamental para lograr un alto rendimiento de las células. Dispasa II y papaína fueron más efectivos para aislar aNSCs de tripsina. La disociación de las células para pases con tampón de disociación en lugar de tripsina mejora su viabilidad 19. disociación mecánica y trituración con una pipeta debe ser mínimo. En tercer lugar, un filtro de células se utiliza generalmente en los sistemas de cultivo primario para eliminar los restos celulares después de la digestión del tejido. Sin embargo, debido a la localización de SCZ-aNSCs, estas células se obtienen después de la rotura de la sustancia blanca mediante digestión con enzimas y la trituración mecánica. Durante la filtración con un filtro de células, una cantidad sustancial de células se perdería. Por lo tanto, el cultivo de SCZ-aNSCs sin usar un filtro de células es una mejor manera de obtener un alto rendimiento de las células.
Mientras que ambos cultivos de neuroesferas y cultivos monocapa pueden aplicarse al mantenimiento de NSCs, una limitación de la neurocultura esfera es que NSCs individuales disocian después de la división se puede agregar al azar. Los resultados de la agregación de diferentes tamaños de neuroesferas. Cuando el tamaño de un neurosphere alcanza un cierto valor crítico, el neurosphere crece como una estructura heterogénea, debido a la falta de nutrientes, factores de crecimiento, y el oxígeno en el núcleo 20. Por otra parte, neuroesferas con tamaños grandes no se disocian fácilmente con tampón de disociación y requieren tiempos de tratamiento más largo enzimáticos con amplia trituración mecánica, lo que lleva a una menor viabilidad celular. Por lo tanto, se recomienda el sistema de cultivo monocapa para mantener SCZ-aNSCs a través de múltiples pasajes. En un sistema de cultivo monocapa, aNSCs se mantienen de manera estable como NSCs (tipo B) sin diferenciación espontánea en células específicas, tales como progenitores (tipos C y A) (Figura 3A). SCZ-aNSCs se pasaron por períodos prolongados, <5 pasajes en un formato neurosphere y> 10 pases como una monocapa. Esto es contrasiStent con los resultados previos que sugieren que el sistema de cultivo monocapa de células madre neurales mantiene in vitro en cultivos a largo plazo 21. Sin embargo, la velocidad de proliferación disminuye, y la porción de las células que mueren aumentó más de 5 pasajes. Pases Extended afecta a la multipotencia y la diferenciación neuronal con el aumento de aberraciones cromosómicas 22. Por lo tanto, para evitar los efectos pases prolongado, se recomienda el uso de pasaje temprano (<paso 5) las células para la proliferación y el análisis de la diferenciación. Aunque el potencial de auto-renovación de SCZ-aNSCs es similar a la SVZ-aNSCs, la diferenciación neuronal menos se muestra en SCZ-aNSCs 9.
Los métodos para aislar aNSCs de las regiones neurogénicas del cerebro adulto, incluyendo la SVZ y giro dentado (DG), se han establecido 22. Aunque tales protocolos han promovido el aislamiento y cultivo de aNSCs in vitro, existen varias limitaciones a la obtención de un alto número deCélulas. Muchos protocolos utilizan un cortador de tejidos cerebro que pueden causar la pérdida de tejido cerebral durante el procedimiento de cortar. Otro enfoque para aislar aNSCs de las regiones neurogénicas utiliza un corte coronal a través del cerebro usando un bisturí. Esto es seguido por la micro-disección de la SVZ o de la DG a lo largo de la fisura longitudinal 23. La presencia de otras regiones del cerebro puede causar otros tipos de células que contaminan la cultura ANSC, lo que podría afectar a la viabilidad de las células in vitro. Con el protocolo actual, muchas muestras diferentes se pueden manejar en un solo experimento, incluyendo controles frente a una variedad de grupos experimentales. Además, cortar usando una matriz de cerebro es superior a una herramienta de cortar de cerebro, ya que permite la consecución de NSCs de varias regiones del cerebro con un rendimiento celular de alta. También permite la comparación de aNSCs de diferentes regiones del mismo cerebro.
Trasplante y la ingeniería de células madre neurales endógenas han sido considéréd como posibles estrategias para la terapia de células madre. Para ello, los estudios in vitro sobre las características de aNSCs también deben ser exploradas exhaustivamente. Por lo tanto, el establecimiento de un bien caracterizado en el sistema de cultivo in vitro será útil para la promoción de la aplicación de NSCs. En este sistema de cultivo, las propiedades de las células madre de SCZ-aNSCs estaban bien cuidadas, como lo demuestra la auto-renovación y diferenciación de linaje múltiple en las condiciones apropiadas. Por lo tanto, este sistema de cultivo puede ser utilizado para la expansión de SCZ-aNSCs para estudios biológicos y aplicaciones terapéuticas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium components | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | +L-glutamin, +Sodium bicarbonate |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Growth factor | |||
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Buffer | |||
| PBS (10x) | BIOSOLUTION | BP007a | 1x dilution |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dissociattion buffer | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Tool | |||
| Fine forceps | WPI | 555229F | |
| Scissors | Storz | E3321-C | |
| Brain matrix (1 mm) | RWD | 68707 | |
| Double-edged razor | DORCO | ST-300 | |
| 30 G needle | SUNGSHIM | N1300 | |
| Materials | |||
| 15 ml tubes | SPL | 50015 | |
| 50 ml tubes | SPL | 50050 | |
| 35 mm dish | SPL | 10035 | Petri dish |
| 100 mm dish | SPL | 10090 | Petri dish |
| Cover slip (18 mm) | Deckglaser | 111580 | |
| 12 well dish | SPL | 32012 | non-coating |
| 6 well dish | SPL | 32006 | non-coating |
| Coating materials | |||
| PLO | Sigma | P4957 | 0.01% |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | 10 mg/ml |
| Primary antibodies | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | mouse (1:1,000) |
| EGFR | Abcam | ab2430 | rabbit (1:1,000) |
| DCX | Santa Cruz | SC8066 | goat (1:500) |
| Tuj1 | Sigma | T2200 | rabbit (1:2,000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | rat (1:1,000) |
| O4 | Millipore | MAB345 | mouse (1:500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | Rat (1:500) |
| Secondary antibodies | |||
| anti-mouse 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| anti-mouse cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| anti-mouse 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| anti-rabbit 488 | Alexa | A21206 | |
| anti-rabbit cy3 | Jackson | 711-165-152 | |
| anti-rabbit 647 | Jackson | 711-605-152 | |
| anti-goat 488 | Alexa | A11055 | |
| anti-goat cy3 | Jackson | 705-165-147 | |
| anti-goat 647 | Invitrogen | A21447 | |
| anti-rat 488 | Invitrogen | A21208 | |
| anti-rat cy3 | Jackson | 712-166-150 | |
| anti-rat 647 | Jackson | 712-605-153 | |
| Immunostaining materials | |||
| BSA | Millipore | 82-100-6 | 3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS |
| Triton X-100 | usb | 22686 | |
| 4% PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Life Technology | H3570 | Dye for staining nuclei |
References
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