Summary
Canine hjernen er en verdifull modell for å studere voksen neurogenesis. Presenteres her er protokoller for å isolere og utvide voksne canine hippocampus nevrale forløper celler fra primær hjernevev.
Protocol
I henhold til New South Wales, Australia loven, post mortem hjernevev ble kjøpt fra voksne hunder avlives grunner ikke er relatert til studiet.
1. Utarbeidelse av dyrkingsmedium
- Fremstille en 0,1% gelatinoppløsning ved å tilsette 0,1 g gelatinpulver til 100 ml destillert vann og ved omrøring ved 37 ° C inntil oppløsning. Steriliser oppløsningen ved UV-bestråling i 15 min. Dette mediet kan deretter bli lagret ved 4 ° C i opp til 1 måned.
- Fremstille et 3: 1 forhold av Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) og næringsblanding F12 ved å tilsette 167 ml F-12 til 500 ml DMEM (4,5 g / L D-glukose). Legg 6,7 ml penicillin / streptomycin-løsning (for en 1% sluttkonsentrasjon). Dette mediet kan lagres i mørke ved 4 ° C i opp til 1 måned.
- Fremstille 500 ml serum media ved å kombinere 440 ml DMEM (4,5 g / L D-glukose), 5 ml av L-alanyl-L-glutamin dipeptid (200 mM), 5 ml Penicillin / Streptomycin og 50 ml føtalt bovine serum (FBS). Dette mediet kan lagres i mørke ved 4 ° C i opp til 1 måned.
- Komplett vekstmedium består av Neural stamceller (NSC) Basal Medium Proliferation Neural Supplement-A (NS-A), 2% FBS, 2 ug / ml heparin, 20 ng / ml epidermal vekstfaktor (EGF) og 10 ng / ml basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF). Gjør dette mediet friske, umiddelbart før hjernen disseksjon, og varm til 37 ° C i et vannbad.
2. Brain Utvinning
- Begynn utvinning innen seks timer post mortem ved sterilisering dorsalflaten på hundens hode ved hjelp av povidon-jod.
- Ved hjelp av en skalpell, lag et langsgående snitt langs sagittal midtlinjen, over hele dorsalflaten av kraniet, for å avdekke de underliggende tyggemusklene. Lengden av dette kutt vil avhenge av art og alder av hunden.
- På rostral og caudal grenser kraniet, foreta ytterligere 5 - 10 cm vinkelrette kutt på begge sider, passerering bak øynene og ørene henholdsvis å la huden reflekteres fullt ut.
- Ved hjelp av en skalpell, skille tyggemusklene fra deres tilknytning til sagittal crest av skallen og skrape eventuelle gjenværende bindevev fra kraniet.
- Ved hjelp av en oscillerende bein så kuttet hetten av hodeskallen i en omkrets linje. Ved hjelp av en sonde eller skalpell bryte eventuelle gjenværende vedlegg med dura, og deretter fjerne den skull cap nøye for å avdekke dorsal overflaten av hjernen.
Forsiktig: Tykkelsen på benet varierer i ulike regioner i skallen, så man må være forsiktig for å ikke trenge for dypt og skade den underliggende hjernen. - Sever ryggmargen ved å sette inn en skalpell mellom øvre nakkevirvler.
- Med den ene hånden til å løfte hjernen forsiktig, bruk en skalpell til å nøye frigjøre hjernen fra kranie fossae og bryte forbindelses nerver og blodkar som ligger på sin ventral side. Løft forsiktig bregn ut av skallen og inn i en beholder med DPBS.
Forsiktig: De store olfactory pærer av canine hjernen kan strekke seg dypt inn i fremre skallegrop. Hensyn må tas når du fjerner hjernen for å bevare disse strukturene.
3. hippocampus Dissection
- Skyll hjernen i Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS) til å fjerne blod og plassere den ryggsiden ned på en 150 mm petriskål.
- Sakte halvere hjernen på langs gjennom midten av det sagittale plan ved hjelp av en våt hjerne kniv og en enkelt skive som utnytter hele lengden av bladet. Ikke påfør ytterligere press nedover, eller bruk en saging bevegelse, da dette kan skade vevet.
- Plassere hver halvkule mediale overflaten opp, dissekere ut hippocampus ved hjelp av en skalpell og fin pinsett, og overføre den til en 35 mm vev kultur parabolen.
4. Isolering av Neural forloperceller
- Finhakk tutstede prøver ved hjelp av en skalpell blad i ca 1 mm 3 stk.
- Overfør vevet inn i et 15 ml rør, tilsett 2 ml 0,1% Trypsin EDTA, og inkuber i 7 minutter i et vannbad ved 37 ° C.
- Stanse enzymreaksjonen ved tilsetning av 4 ml serum media til røret. Pellet suspensjonen ved sentrifugering ved 100 x g i 7 minutter og fjerne supernatanten.
- Resuspenderes pelleten i 300 ul DPBS, og mekanisk dissosiert ved forsiktig pipettering opp og ned, ved hjelp av en 1000 ul pipette, inntil en jevn homogenatet former.
- Legg til en 14 ml serum media til røret og passerer cellesuspensjonen gjennom en 40 um celle sil. Pellet suspensjonen ved sentrifugering ved 100 x g i 7 minutter, fjern supernatanten og resuspender i fullstendig vekstmedium.
5. neurosfære Culture
- Fra cellesuspensjonen oppnådd ved isolering, telle antallet levedyktige celler ved hjelp av Trypan blått fargestoff utelukkelse og en hemocytometer.
- Fortynn cellesuspensjonen i fullstendig vekstmedium og frø ved 1 x 10 5 celler / cm 2 til ubelagte brønnene i en 6-brønners plate.
- Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2, og> 95% fuktighet i 14 - 28 dager, erstatte 50% av vekstmedier hver 7. dag. Måle diameteren av neurosfærene regelmessig. Hvis det er tillatt å vokse utover 100 mikrometer i diameter, kan celledød og spontan differensiering forekomme innenfor neurosfærene.
6. neurosfære Passage
- Til passasje som en flytende kultur, når neurosfærene når omtrent 100 mikrometer i diameter, kombinere alle neurosfærene inneholdende medium inn i et enkelt rør. Pellet ved sentrifugering ved 100 x g i 7 minutter og fjerne supernatanten.
- Resuspender pelleten i 1 ml 0,1% Trypsin EDTA og inkuber i 7 minutter i et vannbad ved 37 ° C. Forsiktig pipettere opp og ned 100 ganger ved å bruke en 200 ul pipette for å sikre dissociatiet av de neurosfærer.
- Stanse enzymreaksjonen ved tilsetning av 5 ml serum media til røret og sentrifuger ved 100 xg i 7 min.
- Fjern supernatanten, cellepelleten suspenderes i 1 ml komplett vekstmedium og telle antallet levedyktige celler ved hjelp av Trypan blått fargestoff utelukkelse og et hemocytometer.
- Fortynn cellesuspensjonen i fullstendig vekstmedium og frø ved 1 x 10 5 celler / cm 2 til ubelagte brønnene i en 6-brønners plate. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2, og> 95% fuktighet i 14 - 28 dager, ved å erstatte 50% av vekstmedier hver 7. dag.
7. Heft Culture of Neural forloperceller
- Legg et tilstrekkelig volum av 0,1% gelatinoppløsning for å dekke overflaten av en vevskulturskål og herding i en inkubator ved 37 ° C i 1 time før prosessering neurosfærene for tilhenger kultur.
- Fra den flytende neurosfærer kultur, kombinere alle medier i en enkelt rør. Pellet Neuerospheres ved sentrifugering ved 100 xg for 7 min og fjerne supernatanten.
- Resuspender pelleten i 1 ml 0,1% Trypsin EDTA og inkuber i 7 minutter i et vannbad ved 37 ° C. Forsiktig pipettere opp og ned 100 ganger ved å bruke en 200 ul pipettespiss.
- Tilsett 5 ml serum-mediet for å stanse enzymreaksjonen og sentrifuger ved 100 xg i 7 min. Kast supernatanten og cellepelleten suspenderes i 1 ml komplett vekstmedium og telle antallet levedyktige celler ved hjelp av Trypan blått fargestoff utelukkelse og et hemocytometer.
- Fortynn cellesuspensjonen i fullstendig vekstmedium, fjerne gelatin fra vevsdyrkingskolber og frø celler ved 1 x 10 4 celler / cm2.
- Inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO2, og> 95% fuktighet. Bytt ut media med ferske, varme, komplett vekstmedier hver tredje dag inntil kulturen når omtrent 80% samløpet (etter ca. 7 dager).
8. Neueral Colony Forming analyse
- Kombiner Neural kolonidannende celle (NCFC) Assay mediekomponenter: NCFC serumfritt medium, Proliferation NS-A, og kollagen-løsning (3 mg / ml). Supplere dette mediet med 2 ug / ml heparin, 20 ng / ml EGF, og 10 ng / ml bFGF.
- Etter hippokampalt vev dissosiering resuspender cellene i neuralt kolonidannende analysemedium, pre-oppvarmet til 37 ° C i et vannbad. Seed cellene ved en klonal tetthet på 1,1 x 10 5 celler / ml inn i en 35 mm kulturskål.
- Inkuber cellene i denne halvfast kollagen matriks ved 37 ° C, 5% CO2, og> 95% fuktighet. Kultur i 28 dager, ved å erstatte 50% av det vekstmediet hver 7. dag.
9. Differensiering av Neural forloperceller
- Tilsettes en tilstrekkelig volum på 5 mikrogram / cm 2 laminin-oppløsning for å dekke overflaten av en vevskulturskål og herding i en inkubator ved 37 ° C i 24 timer før behandling av cellene for differentiasjon.
Merk: Fjern laminin løsningen og skyll den belagte overflaten to ganger i DPBS umiddelbart før seeding. - Ved passering, frø cellesuspensjonen på 1 x 10 4 celler / cm2 i DMEM-F12 (3: 1) media (forvarmet til 37 ° C) supplert med 20 ng / ml EGF og 40 ng / ml bFGF på laminin belagt kultur parabolen.
- Inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO2, og> 95% fuktighet og tillate celler å formere seg i 3 dager.
- For å skille de adherente neurale forløperceller, etter 3 dager erstatte mediet med differensiering medier inneholdende DMEM-F12 (3: 1) media forvarmet til 37 ° C, supplert med 10 ng / ml hjerne avledet neurotrofisk faktor (BDNF).
- Under differensiering erstatte 50% av media hver 3 dager. Differensiering skjer gradvis over ca 21-28 dager.
Forsiktig: Når cellene har begynt å skille, bare erstatte 50% av media på en timeg som eksponering til luft kan ha en ødeleggende effekt på helsen til cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gjennom bruk av in vitro neurale forløperceller analyser, nevrogenesen og nevrale forløper-cellepopulasjoner ble karakterisert og sammenlignet på tvers av dorsoventral aksen av den voksne canine hippocampus. Neurale forløperceller avledet fra isolerte hippokampalt vev dannede flytende neurosfærer innen 14 dager etter isolasjon, og nådde en diameter på 100 um etter 28 dagers dyrking. Neurosfærer avledet fra dorsale og ventrale isolatene viste ingen forskjell i gjennomsnittlig størrelse, og etter enzymatisk dissosiasjon inn i enkeltceller, kan bli passaged som flytende neurosfære kulturer. Sekundære flytende neurosfærer fra begge hippocampus-områdene var i stand til å danne i løpet av 5 dager fra passasjen. Når sådd ved 1 x 10 4 celler / cm2 på 0,1% gelatin belagt kulturflasker, nevrale forløper celler var også i stand til å spre seg som tilhenger monolag (Figur 1a). Ingen morfologiske forskjeller ble observert between dorsale og ventrale hippocampus neurale forløperceller, og begge adherente kulturer var i stand til å gjennomgå over 10 populasjonsdoblinger uten noen observert bremse i passasje-tid (figur 1B). Nestin og Sox2 neural stamcelle genekspresjon i vedheftende kulturen var ikke signifikant forskjellig på tvers av hippocampus dorsoventral aksen (figur 2). Mer omfattende karakterisering av genet og protein ekspresjon, noe som bekrefter den nevrale forløper identiteten til disse cellene, er rapportert i vår publiserte data 7.
Ved hjelp av en tilpasset Neural Colony Forming analyse 4,6 vurderte vi nevrale forløper celle frekvens for å kvantifisere potensielle forskjeller i nevrale forløper celle populasjoner over hele rygg og ventral underregioner av hjørnetann hippocampus. Celler ble sådd ut ved klonal tetthet i en halvfast kollagen matriks som utelukker cellefusjon, og dyrket i 28 dager (figur 3A F = 96,8; p = 0,001; Figur 3B ).
Under differensiering forhold, tilhenger canine nevrale forløper celler viste progressive endringer i brutto morfologi, utvikle lengre og mer forseggjorte prosesser. Protein uttrykk for neuronal (SIII-tubulin) og glial (Glial fibrillary surt protein, GFAP) markører økte også følgende differensiering (figur 4). Ingen signifikant forskjell ble observert i antallet positivt merkede celler mellom dorsale og ventrale isolater. Vår tidligere publiserte data bekrefter disse proteinekspresjon endringer, og dette demonstrerer oppregulering av deres tilhørende gener sammen med nedregulering av neural forløper gener over 28 dagers differensiering periode 7.
Fig. 1: In vitro Utvidelse av voksen Canine hippocampus Neural forløperceller Voksen canine hippocampus neurale forløperceller isolert fra de dorsale og ventrale hippocampus regioner er utvidet som (A) som flyter i neurosfærer eller som (B) en fastsittende enkeltlag (C) Som et. tilhenger enkeltlag disse nevrale forløper celler kan gjennomgå passasje over 10 ganger uten betydelig nedgang i dobling hastighet. n = 5; skala = 50 um. Modifisert fra publiserte figur 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
/ftp_upload/54953/54953fig2.jpg "/>
Fig. 2: Gene Expression i prolifererende voksen hippocampus Canine Neural forløperceller Ekspresjon av neural stamcelle-gener (A) nestin og (B) Sox2 ble bekreftet i voksen hippocampus canine neurale forløperceller i henhold til adherente proliferative dyrkningsbetingelser. Ekspresjonen av disse genene var tilsvarende i både dorsale og ventrale hippocampus avledede celler. Voksen canine fibroblaster ble anvendt som en styrelinje for å sammenligne forskjeller i relativ genekspresjon. n = 5; feilfelt = SEM. Modifisert fra publiserte figur 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3: Neural Colony Forming Assay (A)Voksen canine neurale forløperceller, sådd ut ved klonal tetthet til en halvfast kollagen matriks, danner neurosfærer i løpet av 28 dagers dyrking. (B) neurale forløperceller avledet fra dorsal hippocampus generere signifikant større antall neurosfærer per arealenhet enn de som er avledet fra ventral hippocampus. n = 5; feilfelt = SEM; skala = 50 um. Modifisert fra publiserte figur 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Immunocytochemistry av Differensiert Adult Canine hippocampus Neural forløper celler Når dyrket i BDNF i 28 dager, voksen hund nevrale forløpere fra både dorsal og ventral hippocampus differensieres til modne neuronal (SIII-tubulin pomerksomme) og gliaceller (GFAP positive) celletyper. n = 5; skala = 50 um. Modifisert fra publiserte figur 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollene er beskrevet her er optimalisert for å opprettholde gode dyrkningsforhold for å maksimere celle levedyktighet. Hastigheten og omsorg tatt under utvinning, isolasjon og utvidelse er av avgjørende betydning. Et kritisk trinn for å etablere heftende monolag ekspansjon er den effektive dissosiasjon av de primære neurosfærer. Etter passering, utilstrekkelig dissosiert neurosfærer kan generere sekundære flytende neurosfærer. Under media endring, kan disse neurosfærer fjernes, skilt og reseeded for tilhenger mono passasje. Motsatt, hvis post-dissosiasjon cellenes levedyktighet er under 80%, kan dette være en indikasjon på overdreven pipettering under dissosiasjon. Neural forløperceller, og i særdeleshet deres differensierte motstykker, er følsomme for endringer i pH-verdi utenfor det fysiologiske området, og eksponering for luft. Observasjonen av plutselige utbredt celledød kan skyldes disse faktorene. Derfor et kritisk punkt under medie changene er for media til å bli gjort frisk hver gang, og for bare 50% av volumet som skal erstattes. Til slutt, mens mitogene faktorer EGF og bFGF understøtte overlevelse og proliferasjon av hippocampus neural forløpere under serumfrie betingelser in vitro 22,23, er den cellulære respons på disse mitogener meget avhengig av celle utviklings alder og mitogen konsentrasjon 24,25. Derfor sikrer minimal eksperimentell variasjon i disse komponentene er avgjørende for å generere konsekvent, reproduserbare cellekulturer.
For maksimal levedyktighet, bør cellene bli seedet for kultur innen 6 timer post mortem. Imidlertid kan ekstraheres hjerne lagres midlertidig i PBS ved 4 ° C. Denne modifikasjon kan gi rom for isolasjon for å bli forsinket med opptil 24 timer med minimal reduksjon i celle utbytte 26,27. Vekstfaktor supplering av dyrkningsmedier kan også bli modifisert for å forbedre spredning eller å oppmuntre til differentiation av spesifikke nervecelletyper. Insulin-lignende vekstfaktor 1 (ved 100 ng / ml) er vist å ha en støttende virkning på gnagere nevrale stamceller in vitro 28,29, mens under differensiering betingelser pro-neuronal faktor BDNF 30 kan brukes i forbindelse med slike faktorer som interleukin 7 (ved 500 ng / ml) eller retinsyre (ved 0,1 mm) for å indusere en skjevhet mot neuronal subtype eller glial differensiering 31,32.
Beslutningen om å utvide nevrale forløper celler som flyter Neurosfærene eller som en tilhenger enkeltlag avhenger i stor grad på de ønskede nedstrøms applikasjoner og kultur egenskaper. Mens neurosfærene kultursystem er enkelt og meget reproduserbar, er det begrenset i sin evne til å generere homogene populasjoner av celler. Komplekset mikromiljøet innenfor hver sfære kan fremme apoptose og spontan differensiering, oppmuntre en heterogen befolkning 33, mens reported fusjon neurosfærer som kan forvirre kvantifisering av nevrale forløper cellepopulasjoner 34. Videre kan den gjentatte mekaniske dissosiasjon som kreves for neurosfære passasje også føre til skadelig belastning, begynnende alderdom eller til og med celledød. Bruken av alternativ dissosiasjon enzym, slik som papain, kan påvirke den resulterende celleviabilitet 16. Derimot er heftende monolagskultur system, med mer ensartet eksponering for miljømessige mitogener, råder større homogenitet i celletype og mer symmetrisk fordeling. Dette system har vist seg å fremstille en nisje uavhengig populasjon av celler, basert på ekspresjon av nøkkelstammen cellemarkører 35,36. Dette systemet krever bruk av pre-belagte kultur fartøy som fremmer celle tilslutning. Valget av kultur underlaget bør vurderes nøye, da det kan ha vesentlige virkninger for differensiering profilen til de dyrkede nevrale forløpere 25,37.
Here presenterer vi effektive protokoller for isolering, utvidelse og differensiering av voksne canine hippocampus nevrale forløper celler fra friske post mortem vev. Voksen canine nevrale forløpere er underrepresentert i litteraturen 18; med komplette protokoller for sin isolasjon og ekspansjon, enda mindre så 17. Våre protokoller kan da tjene til å øke bevisstheten om dette verdifulle dyremodell og representerer et betydelig tillegg til dette beskjedne antall studier. Av betydning, ved hjelp av vår unike metode, voksen canine hippocampus nevrale forløpere kan med hell utvides mer enn 10 populasjonsdoblinger. En lignende studie ved hjelp av voksen hund hippocampus nevrale forløper rapportert at større Neurosfærene, passeres ved 100-150 mikrometer i diameter, opphørte spredning utover femte generasjon 17. Som nevnt i vår protokoll, kan overdreven neurosfære vekst oppmuntre spontan differensiering og apoptose, som over serie passasjen kan ha led til dette redusert proliferativ evne. Vi har også en protokoll for vedhengende monolag utvidelse av denne cellepopulasjonen, som et alternativ til de klassiske neurosfære ekspansjonssystemet 17-21. Denne alternative system gir brukeren bedre kontroll over den cellulære miljø, og i betydelig grad utvider rekkevidden av nedstrøms applikasjoner for disse cellene, med potensiale for fenotypisk homogenisering og rettet neuronal differensiering 35,38.
Cultured voksne canine hippocampus nevrale forløper celler har applikasjoner på tvers av et bredt spekter av mobilnettet og nevrobiologiske forskningsfelt. Canine hjernen besitter en nærmere homologi til den menneskelige hjerne enn eksisterende gnagermodeller. Som sådan, voksen canine nevrale forløper celler er en viktig, men studerte, ressurs. Disse cellene kan brukes til å få ytterligere innsikt i mekanismene bak voksen neurogenesis i mennesker, og for utvikling av regenerative behandlinger som Target denne prosessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 μl filtered pipette tip | Axygen | TF1000 | |
| 150 mm Petri dish | BD Biosciences | 351058 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 200 μl filtered pipette tip | Axygen | TF200 | |
| 24 well culture plate | Greiner Bio One | 662160 | |
| 35 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353001 | |
| 40 µm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 6 well culture plate | BD Biosciences | 351146 | |
| B-27 Supplement (50x) serum free | Life Technologies | 17504044 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | 13256029 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Millipore | GF029 | |
| Collagen solution | Stem Cell Technologies | 04902 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| DMEM (4.5 g/L, D-glucose) 500 ml | Life Technologies | 11960044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | BD Biosciences | 354001 | |
| F-12 nutrient mixture (Ham) (1x) Liquid | Life Technologies | 31765035 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 16141079 | |
| Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide (GlutaMAX) | Life Technologies | 35050061 | |
| Heparin sodium salt from (porcine) | Sigma-Aldrich | H314950KU | |
| Laminin (mouse) | Life Technologies | 23017015 | |
| NCFC serum free medium (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5720 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| Proliferation NS-A (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 05773 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit Cat: 05740, and NS-A Prolieration Kit (Rat) Cat: 05771 from Stem Cell Technologies. |
| NSC basal medium (Rat; NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5770 | Also available in the Neurocult NS-A Prolieration Kit (Rat) from Stem Cell Technologies. Cat: 05771 |
| Penicillin/Streptomycin (5,000 U/ml) | Life Technologies | 15070063 | |
| Povidone-iodine | Munipharma | Betadine | |
| Trypan blue (0.4%) | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| Class II biological safety cabinet | ThermoFisher Scientific | Safe 2020 1.2 | |
| Brain knife (disposable) | Macroknife | ||
| Cell culture incubator | ThermoFisher Scientific | HERAcell 150i | |
| Centrifuge | Hettich | Universal 320R | |
| Dumont #5 Forceps | Dumont | ||
| Easypet Electric pipette | Eppindorf | ||
| Hemocytometer | Boeco | Bright-Line Improved Neubauer | |
| Manual pipettes | Eppindorf research | ||
| Oscillating bone saw | |||
| Scalpel blades (No.21) | Paramount | ||
| Scissors | Delta | ||
| Water bath | Grant | JB Aqua 18 plus |
References
- Kheirbek, M. A., Hen, R. Dorsal vs ventral hippocampal neurogenesis: implications for cognition and mood. Neuropharmacol. 36 (1), 373 (2011).
- Tanti, A., Rainer, Q., Minier, F., Surget, A., Belzung, C. Differential environmental regulation of neurogenesis along the septo-temporal axis of the hippocampus. Neuropharmacol. 63 (3), 374-384 (2012).
- Eriksson, P. S., et al.
- Bull, N. D., Bartlett, P. F. The adult mouse hippocampal progenitor is neurogenic but not a stem cell. J Neurosci. 25 (47), 10815-10821 (2005).
- Kempermann, G., et al. Why and how physical activity promotes experience-induced brain plasticity. Front Neurosci. 4 (189), 1-9 (2010).
- Golmohammadi, M. G., et al. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26 (4), 979-987 (2008).
- Lowe, A., et al. Neurogenesis and precursor cell differences in the dorsal and ventral adult canine hippocampus. Neurosc. Lett. 593, 107-113 (2015).
- Sasaki, M., et al. MRI identification of dorsal hippocampus homologue in human brain. Neuroreport. 15 (14), 2173-2176 (2004).
- Powell, E. W., Hines, G. The Hippocampus. , Springer. 41-59 (1975).
- Jung, M. -A., et al. Canine hippocampal formation composited into three-dimensional structure using MPRAGE. J Vet Med Sci. 72 (7), 853-860 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system. Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).
- Oliver-Dela Cruz, J., Ayuso-Sacido, A. Neural stem cells from mammalian brain: isolation protocols and maintenance conditions. INTECH Open Access Publisher. , (2012).
- Pacey, L., Stead, S., Gleave, J., Tomczyk, K., Doering, L. Neural stem cell culture: neurosphere generation, microscopical analysis and cryopreservation. Nat Protoc. , (2006).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), e2393 (2010).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225 (2014).
- Lim, J. -H., Koh, S., Olby, N. J., Piedrahita, J., Mariani, C. L. Isolation and characterization of neural progenitor cells from adult canine brains. Am J Vet Res. 73 (12), 1963-1968 (2012).
- Herranz, C., et al. Spontaneously Arising Canine Glioma as a Potential Model for Human Glioma. J Comp Pathol. 154 (2), 169-179 (2016).
- Walton, R. M., Parmentier, T., Wolfe, J. H. Postnatal neural precursor cell regions in the rostral subventricular zone, hippocampal subgranular zone and cerebellum of the dog (Canis lupus familiaris). Histochem Cell Biol. 139 (3), 415-429 (2013).
- Walton, R. M., Wolfe, J. H. Abnormalities in neural progenitor cells in a dog model of lysosomal storage disease. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (8), 760-769 (2007).
- Milward, E. A., et al. Isolation and transplantation of multipotential populations of epidermal growth factor-responsive, neural progenitor cells from the canine brain. J Neurosci Res. 50 (5), 862-871 (1997).
- Ray, J., Peterson, D. A., Schinstine, M., Gage, F. H. Proliferation, differentiation, and long-term culture of primary hippocampal neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. 90 (8), 3602-3606 (1993).
- Palmer, T., Ray, J., Gage, F. FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain. Mol Cell Neurosci. 6 (5), 474-486 (1995).
- Zhu, G., Mehler, M., Mabie, P., Kessler, J. Developmental changes in progenitor cell responsiveness to cytokines. J. Neurosci. Res. 56 (2), 131-145 (1999).
- Whittemore, S. R., Morassutti, D. J., Walters, W. M., Liu, R. -H., Magnuson, D. S. Mitogen and substrate differentially affect the lineage restriction of adult rat subventricular zone neural precursor cell populations. Exp. Cell. Res. 252 (1), 75-95 (1999).
- Kennedy, P. Postmortem survival characteristics of rat glial cells in culture. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 50 (6), 798-800 (1987).
- Viel, J. J., McManus, D. Q., Cady, C., Evans, M. S., Brewer, G. J. Temperature and time interval for culture of postmortem neurons from adult rat cortex. J. Neurosci. Res. 64 (4), 311-321 (2001).
- Huat, T. J., et al. IGF-1 enhances cell proliferation and survival during early differentiation of mesenchymal stem cells to neural progenitor-like cells. BMC Neurosci. 15 (91), 1-13 (2014).
- Supeno, N. E., et al. IGF-1 acts as controlling switch for long-term proliferation and maintenance of EGF/FGF-responsive striatal neural stem cells. Int. J. Med. Sci. 10 (5), 522-531 (2013).
- Ahmed, S., Reynolds, B. A., Weiss, S. BDNF enhances the differentiation but not the survival of CNS stem cell-derived neuronal precursors. J Neurosci. 15 (8), 5765-5778 (1995).
- Wohl, C. A., Weiss, S. Retinoic acid enhances neuronal proliferation and astroglial differentiation in cultures of CNS stem cell-derived precursors. J Neurobiol. 37 (2), 281-290 (1998).
- Araujo, D. M., Cotman, C. W. Trophic effects of interleukin-4,-7 and-8 on hippocampal neuronal cultures: potential involvement of glial-derived factors. Brain Res. 600 (1), 49-55 (1993).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), 283 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1 112-120 (2006).
- Ma, W., et al. Cell-extracellular matrix interactions regulate neural differentiation of human embryonic stem cells. BMC Dev Biol. 8 (90), 1-13 (2008).
- Goffredo, D., et al. Setting the conditions for efficient, robust and reproducible generation of functionally active neurons from adult subventricular zone-derived neural stem cells. Cell Death Differ. 15 (12), 1847-1856 (2008).
