Abstract
बेसिलस प्रजातियों मिथाइल शाखा की विभिन्न पदों के साथ श्रृंखला और असंतृप्त वसीय अम्लों (एफएएस) branched होते हैं (आईएसओ या anteiso) और डबल बांड की। एफए संरचना में परिवर्तन अपने पर्यावरण के लिए बैक्टीरिया के अनुकूलन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इन संशोधनों आईएसओ के अनुपात बनाम anteiso फैस branched में एक परिवर्तन करना पड़ेगा, और संतृप्त फैस को असंतृप्त फैस रिश्तेदार, विशिष्ट पदों पर बनाया डबल बांड के साथ के अनुपात में। एफए प्रोफ़ाइल की सटीक पहचान बेसिलस प्रजातियों के अनुकूलन तंत्र को समझने के लिए आवश्यक है।
बेसिलस से फैस से कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। रणनीति के साथ साथ प्रस्तावित पहचानती एफए डेरिवेटिव के तीन प्रकार के जन स्पेक्ट्रा के साथ अवधारण समय पर जानकारी के संयोजन (समकक्ष श्रृंखला लंबाई (ईसीएल) की गणना के द्वारा) द्वारा फैस: (fames) फैटी एसिड मिथाइल एस्टर, 4,4-डाइमिथाइल oxazoline डेरिवेटिव (DMOX), और3-pyridylcarbinyl एस्टर (picolinyl)। इस विधि अज्ञात फैस शुद्ध करने के लिए आवश्यकता के बिना फैस की पहचान कर सकते हैं।
मानकों का एक मिश्रण के साथ वाणिज्यिक बेसिलस cereus से तैयार फेम के chromatographic प्रोफाइल मुकाबले सीधे श्रृंखला की पहचान के अन्य फैस की पहचान पर फैस, ईसीएल की गणना, और परिकल्पना संतृप्त के लिए अनुमति देता है। के fames फैस, आईएसओ या anteiso, ईसीएल में एक निरंतर नकारात्मक बदलाव प्रदर्शित संतृप्त, कार्बन की एक ही नंबर के साथ रैखिक संतृप्त फैस की तुलना में बंट गए। असंतृप्त फैस की fames उनके आणविक आयनों की बड़े पैमाने पर से पता लगाया जा सकता है, और इसी संतृप्त फैस की तुलना में ईसीएल में एक सकारात्मक बदलाव में परिणाम।
एफएएस की शाखाओं में स्थिति और असंतृप्त फैस की डबल बांड स्थिति क्रमश: picolinyl और DMOX डेरिवेटिव के इलेक्ट्रॉन आयनीकरण जन स्पेक्ट्रा से पहचाना जा सकता है। यह दृष्टिकोण सभी अज्ञात संतृप्त शाखा को पहचानतीएड फैस, असंतृप्त सीधे श्रृंखला फैस और बी cereus निकालने से असंतृप्त branched फैस।
Introduction
फैटी एसिड मिथाइल एस्टर (प्रसिद्धि) गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) लिपिड लक्षण वर्णन के लिए एक अनिवार्य विधि है। यह तेजी से अलग करती है और एक छोटी निष्कर्षण कदम के बाद एक नमूना के विभिन्न फैटी एसिड (एफएएस) quantifies। मिथाइल एस्टर की संजात, अत्यधिक अस्थिर स्थिर और chromatographic स्तंभ की ओर से निष्क्रिय हैं जिससे पीछा चोटियों से परहेज। उनकी पहचान नहीं बल्कि सीधा जब नमूना प्रसिद्ध फैस के होते हैं क्योंकि chromatographic प्रोफाइल या तो प्रकाशित कर रहे हैं या मानकों की तुलना में है। इसके अलावा, विभिन्न फैस की मात्रा का ठहराव के लिए अंशांकन मानकों के बार-बार इंजेक्शन की आवश्यकता नहीं है, उनकी लौ आयनीकरण का पता लगाने (खूंटी) 1 करने के लिए लगभग निरंतर प्रतिक्रिया दी।
खूंटी के अलावा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) का पता लगाने fames पुष्टि करने के लिए जानकारी का एक पूरक सेट प्रदान करता है। हालांकि, जब fames इलेक्ट्रॉन आयनीकरण (ईआई) का उपयोग करते हुए आरोप लगाया है, जिसके परिणामस्वरूप स्पेक्ट्रा हमेशा वीं के लिए अनुमति नहीं हैएफए ठीक संरचना के ई पहचान। उदाहरण के लिए, स्थिति शाखाओं में बंटी (यानी, एक branched मिथाइल समूह) भविष्यवाणी करना मुश्किल है क्योंकि नैदानिक आयनों 1 पता लगाने के लिए मुश्किल हो जाता है और लक्ष्य आयन बहुतायत में विशेषता परिवर्तन, मशीन पर निर्भर है जन स्पेक्ट्रा पुस्तकालयों 2 के प्रयोग को रोकने है। एक और चुनौती डबल बांड स्थिति की पहचान क्योंकि ईआई डबल बांड पलायन का कारण बनता है में निहित है। इस प्रकार, डबल बांड पदों पर अलग से एफए isomers उनकी जन स्पेक्ट्रा से भेदभाव नहीं किया जा सकता। सौभाग्य से, अन्य उपकरण एफए पहचान के लिए विकसित किया गया है। उदाहरण के लिए, उपस्थिति और या फैस में डबल बांड की शाखाओं में बंटी की स्थिति बराबर श्रृंखला लंबाई (ईसीएल) 3 की गणना के द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है।
अन्य derivatization तरीकों विभिन्न जन स्पेक्ट्रा, एक डबल बांड या एक branched मिथाइल समूह के स्थान पर निर्भर में परिणाम। 4,4-डाइमिथाइल oxazoline डेरिवेटिव (DMOX) 4 ईएएस के लिए अनुमतिमोनोअनसैचुरेटेड फैटी एसिड डबल बांड की स्थिति के y पहचान। 3-pyridylcarbinyl एस्टर (picolinyl एस्टर) डेरिवेटिव मिथाइल के स्थान की स्पष्ट पहचान के लिए अनुमति फैस 5 branched। शुद्धि के जटिल तरीकों का उपयोग करने की आवश्यकता के बिना chromatographic प्रतिधारण (ईसीएल) और जन स्पेक्ट्रा (DMOX और picolinyl) जानकारी सबसे फैस की पहचान के लिए अनुमति देता है के संयोजन, के रूप में परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रम, संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए 1 uncontestable विधि के लिए आवश्यक ।
जीनस बेसिलस, जो कुछ मानव और पशुओं के रोगजनकों शामिल के बैक्टीरिया, अत्यधिक विविध आलों उपनिवेश स्थापित करने में सक्षम हैं और इसलिए व्यापक रूप से पर्यावरण 6 में वितरित कर रहे हैं। बेसिलस जीनस के अलावा, एफए रचना एफए पैटर्न में modulations के साथ प्रजाति के पारिस्थितिक आला से प्रभावित है पर्यावरण परिवर्तन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूल करने के लिए (जैसे, मध्यम विकास, तापमान,पीएच, आदि) 7-9। मानकीकृत परिस्थितियों में विकास के दौरान जीनस बेसिलस की प्रजातियों भर एफए पैटर्न के रिश्तेदार एकरूपता की वजह से, एफए संरचना के निर्धारण बेसिलस प्रजातियों को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल आवश्यक मानदंडों में से एक है। बेसिलस जीनस की एक अनूठी विशेषता branched श्रृंखला 12-17 कार्बन आईएसओ और anteiso isomers पर्यावरण की स्थिति के लिए अनुकूलन की एक प्रमुख निर्धारक होने के बीच अनुपात के साथ 10-12 युक्त फैस की बहुतायत है। बेसिलस प्रजातियां भी असंतृप्त वसीय अम्लों का अनुपात बदलकर पर्यावरण के उतार चढ़ाव के लिए अनुकूल है। ऐसे बेसिलस cereus के रूप में कुछ प्रजातियों में, दो फैटी एसिड desaturases अनुकूलन 9 में विभिन्न भूमिकाओं के साथ alkyl श्रृंखला 13 के विभिन्न स्थानों में डबल बांड पैदा करते हैं। बेसिलस जीनस का उदाहरण ठीक डबल बांड स्थिति की पहचान करने और एफए शाखाओं में बंटी के महत्व को दिखाता है। लीजिएively, बेसिलस एफए पैटर्न की पहचान के लिए कई उपयोगी आवेदन किया है। इस के साथ साथ, हम बेसिलस एफए पैटर्न की पहचान है कि एक शास्त्रीय जीसी एमएस विश्लेषण के निहित सीमाओं पर काबू के लिए एक उपन्यास जीसी एमएस दृष्टिकोण का प्रस्ताव।
इस नए दृष्टिकोण कच्चे जैविक सामग्री पर सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है और मौजूदा तकनीक का एक संयोजन के होते हैं: प्रतिधारण बार (ईसीएल) और विभिन्न फैस डेरिवेटिव (प्रसिद्धि, DMOX और picolinyl एस्टर) के जन स्पेक्ट्रा के बारे में जानकारी।
हम निम्नलिखित एफए नामकरण का उपयोग करें। मैं एक, और एन आईएसओ संकेत मिलता है, anteiso मिथाइल branched, और सीधे श्रृंखला फैटी एसिड, क्रमशः। असंतृप्त फैस सी द्वारा नामित किया गया: D जहां सी फैटी एसिड में कार्बन परमाणुओं और डी की संख्या है डबल बांड की संख्या है। Δ एक्स डबल बांड, जहां डबल बांड दसवीं कार्बन-कार्बन बांड पर स्थित है, कार्बोक्जिलिक एसिड अंत से गिनती की स्थिति को इंगित करता है।
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Protocol
1. बैक्टीरियल संस्कृतियों
- तनाव पौंड (Luria-Bertani मध्यम) में 30 डिग्री सेल्सियस पर incubated की एक रात संस्कृति के 100 μl फैल रहा लेग अगर माध्यम की एक प्लेट की सतह पर से बैक्टीरिया (बेसिलस cereus तनाव ATCC 14579) के एक लॉन तैयार करें। 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर थाली सेते हैं।
2. ईसीएल: समकक्ष श्रृंखला लंबाई
- ईसीएल की गणना इस प्रकार है:
साथ में:
मैं, ब्याज की घुला हुआ;
n, सीधे श्रृंखला संतृप्त फैटी एसिड मिथाइल एस्टर घुला हुआ पदार्थ से पहले एल्यूटिंग की कार्बन संख्या मैं;
एन 1, घुला हुआ पदार्थ के बाद एल्यूटिंग सीधे श्रृंखला संतृप्त फैटी एसिड मिथाइल एस्टर की कार्बन संख्या मैं;
सूचना का अधिकार, RTN, आर टी (N + 1) ऊपर वर्णित प्रसिद्धि चोटियों की अवधारण बार।
नोट: (मानकों का एक मिश्रण के इंजेक्शन से सीधे श्रृंखला संतृप्त फैटी एसिड मिथाइल एस्टर की अवधारण बार प्राप्त बीएएमई)।
साथ में: 3. प्रसिद्धि तैयार करने और विश्लेषण
- आदेश में अगर थाली से कालोनियों scraping द्वारा लिपिड फैटी एसिड होता है, फसल बैक्टीरियल कोशिकाओं को प्राप्त करने और पेंच टोपी और PTFE जवानों के साथ एक 10 मिलीलीटर ग्लास ट्यूब में बैक्टीरिया की 40 मिलीग्राम (ताजा वजन, 10 9 व्यवहार्य कोशिकाओं के बराबर) हस्तांतरण करने के लिए।
- एस्टर लिंक विधि 14,15 नीचे विस्तृत के माध्यम से transesterification प्रदर्शन करना।
- ताजा बैक्टीरियल कोशिकाओं को मेथनॉल में 0.2 एम KOH के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। यह प्रतिक्रिया क्षारीय methanolysis के होते हैं, लिपिड में एस्टर लिंक टूट गया और फैटी एसिड मिथाइल एस्टर का निर्माण किया।
- 1 एम एसिटिक एसिड के 1 मिलीलीटर 7.0 पीएच कम करने के लिए जोड़ें। पीएच परीक्षण स्ट्रिप्स के साथ पीएच की जाँच करें।
- हेक्सेन के 3 मिलीलीटर fames निकालने के लिए जोड़ें।
- नाइट्रोजन की एक सतत प्रवाह के तहत कमरे के तापमान पर साफ ट्यूबों में सतह पर तैरनेवाला (जैविक चरण) स्थानांतरण और वाष्पीकरण से ध्यान केंद्रित लगभग 200 μl प्राप्त करने के लिएनिकालने की। डालने के साथ एक जीसी शीशी में नमूना हस्तांतरण।
- एक गैस क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी एमएस) प्रणाली में अर्क इंजेक्षन।
4. जीसी / एमएस शर्तें
- एक जीसी एमएस एक केशिका स्तंभ ZB मोम (; व्यास, 0.25 मिमी, फिल्म मोटाई 0.25 माइक्रोन लंबाई 30 मीटर) के साथ सुसज्जित साधन में प्रसिद्धि के नमूने इंजेक्षन।
- इंजेक्शन बंदरगाह (splitless मोड में) 250 डिग्री सेल्सियस के तापमान सेट करें। एक वाहक गैस के रूप में हीलियम का प्रयोग करें, 37 सेमी / सेकंड की एक रेखीय वेग के साथ। 1 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर ओवन के तापमान को पकड़ो, 20 डिग्री सेल्सियस / मिनट की दर से 190 डिग्री सेल्सियस तक की वृद्धि, और 2 डिग्री सेल्सियस / मिनट की दर से 230 डिग्री सेल्सियस के तापमान फाइनल के लिए आगे बढ़ा सकते हैं।
- एमएस के लिए, 70 eV पर इलेक्ट्रॉन आयनीकरण (ईआई) द्वारा जन स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड, और 50 और 400 परमाणु जन इकाइयों (एएमयू) (2 स्कैन / सेक) के बीच कुल आयन वर्तमान के अधिग्रहण की स्थापना की।
- जब आवश्यक है, उसी हालत अपवाद के तहत DMOX और picolinyl डेरिवेटिव इंजेक्षनइस प्रकार के रूप तापमान कार्यक्रम ओवन टी:
DMOX: 50 डिग्री सेल्सियस (1 मिनट), 20 डिग्री सेल्सियस / जब तक 210 डिग्री सेल्सियस न्यूनतम और 2 डिग्री सेल्सियस / मिनट तक 240 डिग्री सेल्सियस (5 मिनट);
Picolinyl: 6 डिग्री सेल्सियस (1 मिनट), जब तक 220 डिग्री सेल्सियस से 20 डिग्री सेल्सियस / मिनट और 2 डिग्री सेल्सियस / मिनट तक 250 डिग्री सेल्सियस (20 मिनट)।
प्रसिद्धि 16 से 5. Picolinyl एस्टर तैयारी
- नाइट्रोजन का एक प्रवाह (कम से कम 10 मिलीग्राम सूखी सामग्री) के साथ धारा 3 से प्रसिद्धि निकालने लुप्त हो जाना और सूखी क्लोराइड के 1 मिलीलीटर में भंग।
- एक 1.0 एम tetrahydrofuran में पोटेशियम आतंकवाद टी butoxide का समाधान तैयार है।
- प्रसिद्धि निकालने और कदम 5.2 में किए गए समाधान के 0.2 मिलीलीटर 3-pyridinemethanol 0.1 मिलीलीटर जोड़ें।
- एक बंद शीशी में 30 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर समाधान हीट।
- कमरे के तापमान को ठंडा करने के बाद, शुद्ध विआयनीकृत पानी (2 मिलीलीटर, वहाँ सामग्री तालिका) जोड़ने और हेक्सेन (4 एमएल)। एक भंवर के साथ मिक्स, चरण अलग करने के लिए अनुमति देते हैं, और जैविक चरण इकट्ठा।
- डॉजैविक चरण तक निर्जल सोडियम सल्फेट जोड़कर Y यह पूरी तरह से स्पष्ट है। एक साफ ट्यूब में हस्तांतरण। तो 200 μl के लिए लुप्त हो जाना। डालने के साथ एक जीसी शीशी में नमूना हस्तांतरण।
6. प्रसिद्धि 17 से DMOX तैयारी
- नाइट्रोजन (कम से कम 10 मिलीग्राम सूखी सामग्री) के एक प्रवाह के साथ धारा 3 से प्रसिद्धि निकालने लुप्त हो जाना।
- प्रसिद्धि सूखी निकालने के लिए, 2 अमीनो-2-मिथाइल-1- propanol के 250 मिलीग्राम जोड़ें। नाइट्रोजन के साथ पोत फ्लश, एक डाट जोड़ने के लिए, और 190 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक हीटिंग ब्लॉक में जगह है।
- कमरे के तापमान को ठंडा करने के बाद, ट्यूब के लिए 3 मिलीग्राम क्लोराइड जोड़ने के लिए, और 5 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी (सामग्री तालिका देखें) शुद्ध।
- चरण जुदाई के लिए हिला और फिर जलीय चरण को हटा दें।
- 5 मिलीलीटर पानी के साथ जैविक चरण धो लें। चरण जुदाई के लिए हिला और फिर जलीय चरण को हटा दें।
- जैविक चरण तक निर्जल सोडियम सल्फेट जोड़कर सूखी पूरी तरह से स्पष्ट है औरयह एक साफ ट्यूब में हस्तांतरण। 200 μl की एक मात्रा तक पहुँचने तक नाइट्रोजन की एक धारा के तहत लुप्त हो जाना। डालने के साथ एक जीसी शीशी में नमूना हस्तांतरण।
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Representative Results
बैक्टीरियल कोशिकाओं से एफए पहचान की रणनीति चित्र 1 में प्रस्तुत किया है। हर कदम पूरक वर्णक्रम जानकारी या chromatographic प्रतिधारण के बारे में जानकारी प्रदान करता है। चरण 1 एक मानक समाधान का उपयोग प्रारंभिक एफए पहचान के होते हैं। चरण 2 क्रम में अंतरिम रूप से उत्पादों की पहचान, प्रसिद्धि ईआई स्पेक्ट्रा और उनके ईसीएल की व्याख्या के लिए अनुमति देता है। चरण 3 branched श्रृंखला-फैस में सटीक शाखाओं में बंटी स्थान को पहचानती है। अंत में, चरण 4 असंतृप्त फैस में डबल बांड की सटीक स्थिति को दिखाता है।
प्रसिद्धि और ईसीएल
BAME मिश्रण हमें एक (N17 पर N12) सीधे श्रृंखला संतृप्त फैटी एसिड की श्रृंखला की पहचान करने की अनुमति दी है और कुछ मिथाइल फैटी एसिड (i15, A15, i16, i17) branched। हालांकि, बी cereus करने के लिए बहुत कुछ फैस विशिष्ट हमारे नमूने में पता चला रहे थे, विकास को न्यायोचित ठहरापहचान विधि के pment नीचे वर्णित है।
श्रृंखला लंबाई की परवाह किए बिना, branched संतृप्त फैस एक मुताबिक़ श्रृंखला की (आईएसओ या anteiso) (यानी, एक ही सामान्य सूत्र के साथ यौगिकों की एक श्रृंखला) सीधे संतृप्त एफए में कार्बन की एक ही नंबर होने की तुलना में ईसीएल में एक निरंतर पारी प्रदर्शित उनकी कार्बन श्रृंखला। यह बदलाव, कहा जाता आंशिक श्रृंखला लंबाई (एफसीएल), एक मुताबिक़ श्रृंखला में फैस की पहचान के लिए अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, आईएसओ फैस (उपसर्ग के साथ चिह्नित "मैं") -0.48 की एक एफसीएल मूल्य, जबकि anteiso फैस (उपसर्ग 'ए' के साथ चिह्नित) -0.33 की एक एफसीएल किया है। यह 13.52 और 12.52 क्रमश: एक ईसीएल के साथ एक I14 और i13 की पहचान करने में तो आसान है, और एक A13 और A15 12.67 और 14.66 क्रमश: एक ईसीएल के साथ।
तालिका 1 फैस से प्रत्येक के लिए प्रदर्शित करता है ECLs हमारे नमूने में पता चला। अवधारण बार की भविष्यवाणीआईएसओ और anteiso श्रृंखला के लिए एड, एमएस स्पेक्ट्रा के साथ एक साथ fames के साथ प्राप्त की, हमारे नमूना से branched श्रृंखला-एफए के सभी की पहचान करने की अनुमति दी। इस कदम पर इस तरह की पहचान अस्थायी था, लेकिन बाद में ईआई स्पेक्ट्रा picolinyl फैस डेरिवेटिव से प्राप्त द्वारा की पुष्टि की।
आईएसओ के लिए इसी नहीं ECLs या anteiso बदलाव के साथ fames असंतृप्त कर रहे हैं, सीधे या branched श्रृंखला फैस, के रूप में उनके आणविक आयन के द्रव्यमान से संकेत दिया। असंतृप्त फैस ईसीएल में एक सकारात्मक बदलाव दिखा इसी संतृप्त एफए की तुलना में। DMOX डेरिवेटिव, शाखायुक्त फैस के लिए picolinyl व्युत्पन्न से स्पेक्ट्रा के साथ संयुक्त रूप से स्पेक्ट्रा, डबल बांड स्थिति की पहचान के लिए अनुमति देते हैं।
इस तरह के तरीकों derivatization एफए पहचान के लिए उचित ही है जब क्षालन आदेश को बरकरार रखा है, के रूप में चित्रा में तीन व्युत्पन्न मिश्रण (यानी, प्रसिद्धि, DMOX और picolinyl) के लिए दिखाए जाते1 फैस: कई 16 के लिए 2। यह दृष्टिकोण 3 derivatization तरीकों जो एफए संरचना की पहचान करने के लिए जोड़ा जा सकता है का उपयोग कर एक चोटी के पूरक वर्णक्रम जानकारी के संग्रह के लिए परमिट। क्षालन क्रम में कोई मतभेद, 3 डेरिवेटिव के बीच मनाया गया, हालांकि प्रतिधारण बार और ओवन तापमान अलग थे।
आईएसओ के Picolinyl एस्टर और anteiso मिथाइल branched श्रृंखला संतृप्त फैटी एसिड
स्पेक्ट्रा ईआई द्वारा प्राप्त मिथाइल branched श्रृंखला फैस की उपस्थिति की पुष्टि करें। दरअसल, आणविक आयनों मी / z संतृप्त फैस करने के लिए इसी राशि। हम इस मुद्दे पर जहां शाखा आयन प्रतिस्थापित कार्बन परमाणु के लिए इसी याद आ रही है की इस क्षेत्र में छोड़कर 14 जन इकाइयों (एएमयू) एक methylene समूह का एक नुकसान के लिए इसी के अंतराल के साथ एक आयन श्रृंखला मनाया। हम तो पहले बनाया टुकड़े करने के लिए इसी दो आयनों के बीच 28 एएमयू के अंतराल के निरीक्षण औरशाखायुक्त कार्बन के बाद। चित्रा 3 नैदानिक आयनों (304 और 332) शाखाओं में बंटी स्थान दिखाने के साथ i16 के स्पेक्ट्रम से पता चलता है।
सीधे श्रृंखला असंतृप्त वसीय अम्लों की DMOX
1 फैटी एसिड: चित्रा 2 पाँच अलग अलग 16 के साथ जुड़े चोटियों प्रस्तुत करता है। पहले दो चोटियों ईसीएल मूल्यों 16 <है। हम निष्कर्ष है कि उनकी संरचना निश्चित रूप से branched है। इन यौगिकों की पहचान के लिए बड़े पैमाने पर DMOX और picolinyl एस्टर डेरिवेटिव द्वारा उत्पादित स्पेक्ट्रा की व्याख्या की आवश्यकता है। जिनके पास ईसीएल> 16 मैच तीन चोटियों सीधे श्रृंखला फैटी एसिड मोनोअनसैचुरेटेड। DMOX व्युत्पन्न जन स्पेक्ट्रा इन यौगिकों की डबल बांड की स्थिति की पहचान करने नैदानिक आयनों दिखा। 1 Δ: चित्रा 4 में हम N16 के कार्बन 8 के साथ डबल बांड की उपस्थिति का संकेत 196 और 208 के बीच 12 एएमयू आयन के अंतराल देख सकते हैं
DMOX और picolinyl बड़े पैमाने पर मिथाइल branched श्रृंखला के स्पेक्ट्रा फैटी एसिड monounsatured
1 Δ 9 एफए: चित्रा 6 DMOX की स्पेक्ट्रा और picolinyl एस्टर डेरिवेटिव, i16 की संरचना निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है प्रस्तुत करता है। की स्थितिशाखाओं में बंटी दोनों डेरिवेटिव के लिए 28 एएमयू के अंतराल ने संकेत दिया है। के रूप में 6 चित्र में दिखाया DMOX के लिए 12 एएमयू के अंतराल और 26 picolinyl एस्टर के लिए डबल बांड स्थिति को दिखाता है।
फैटी एसिड और नैदानिक आयनों की पहचान
तालिका 1 की पहचान की विभिन्न फैटी एसिड होता है, इसी नैदानिक आयनों के साथ, बेसिलस cereus ATCC 14579 में 30 डिग्री सेल्सियस से बढ़ी पता चलता है। ये नैदानिक आयनों DMOX और picolinyl एस्टर डेरिवेटिव, जो पूरक संरचनात्मक जानकारी उपलब्ध कराने के लिए कार्बन श्रृंखला पर मिथाइल शाखाओं में बंटी के पदों और डबल बांड की पहचान। के रूप में नैदानिक आयनों कभी कभी DMOX डेरिवेटिव के साथ निरीक्षण करने के लिए आसान है, और दूसरी बार में आसान picolinyl डेरिवेटिव के साथ निरीक्षण कर रहे हैं दो दृष्टिकोण, सही मायने में पूरक हैं।
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चित्रा 1: बेसिलस cereus में फैटी एसिड की पहचान के लिए रणनीति।
प्रतिधारण बार (ईसीएल) के बारे में जानकारी, प्रसिद्धि की जन स्पेक्ट्रा, DMOX की पर पैदा लगातार कदम है, और picolinyl एस्टर के दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: 1 फैटी एसिड बेसिलस cereus में पता चला: विभिन्न 16 के लिए chromatographic प्रोफाइल की तुलना।
(ए) प्रसिद्धि डेरिवेटिव (आणविक आयन मीटर पर निकाले / z 268); (बी) DMOX डेरिवेटिव (आणविक आयन मीटर पर निकाले / z 307); (सी) picolinyl डेरिवेटिव (आणविक आयन मी / z 345 पर निकाले)।Iles / ftp_upload / 54960 / 54960fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: i16 picolinyl व्युत्पन्न बड़े पैमाने पर इलेक्ट्रॉन आयनीकरण द्वारा उत्पन्न स्पेक्ट्रम।
मी / z 151 और मी / z 164 पर आयनों उपस्थिति फैटी एसिड का एक picolinyl व्युत्पन्न संकेत मिलता है। मी / z 347 पर आणविक आयन पामिटिक एसिड की एक isomer के रूप में पहचान की है। मीटर की ऊंचाई पर आयन के बीच 28 एएमयू के अंतराल की उपस्थिति / Z 304 और मी / z 332 i16 का संकेत है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: N16: 1 Δ 8 DMOX व्युत्पन्न जन स्पेक्ट्रम इलेक्ट्रॉन द्वारा उत्पन्नआयनीकरण।
मीटर की ऊंचाई पर आयन / z 126 इंगित करता है एक DMOX व्युत्पन्न, मी / z 307 16 की आणविक आयन है: 1 DMOX और मी / z 196 और एम / Z 208 पर आयनों के बीच 12 एएमयू के अंतराल की उपस्थिति स्थान पहचानती कार्बन 8. पर डबल बांड की यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: N16: 1 Δ 5 DMOX व्युत्पन्न बड़े पैमाने पर इलेक्ट्रॉन आयनीकरण द्वारा उत्पन्न स्पेक्ट्रम।
1 DMOX: मीटर की ऊंचाई पर आयन / Z 126 एक DMOX व्युत्पन्न और मीटर का संकेत है / z 307 16 की आणविक आयन है। तीव्र मी / z 153 आयन एक डबल कार्बन 5 पर स्थित बांड की विशेषता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: DMOX (ऊपर) और picolinyl (नीचे) i16 की तुलना: 1Δ 9 स्पेक्ट्रा।
दोनों ही मामलों में 28 एएमयू के अंतराल मिथाइल शाखाओं की स्थिति का संकेत। डबल बांड स्थान क्रमश: DMOX और picolinyl डेरिवेटिव के लिए 12 एएमयू के अंतराल और 26 एएमयू द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| ख्यात यौगिकों | आण्विक आयन (मी / z) प्रसिद्धि; DMOX; picolinyl | आरटी | ईसीएल | पुष्टि की पहचान | नैदानिक आयनों DMOX | नैदानिक आयनों picolinyl |
| I12 | 214; 253; 291 | 7.93 | कोई संदर्भ | I12 | [276 (15), 262 (0); 248 (15)] एमबी | |
| N12 | 214; 253; 291 | 8.21 | 12.00 | N12 | [276 (10), 262 (20); 248 (20)] एमबी | |
| i13 | 228; 267; 305 | 8.53 | 12.5 | i13 | [290 (15), 276 (0); 262 (48)] एमबी | |
| A13 | 228; 267; 305 | 8.64 | 12.67 | A13 | [276 (48), 262 (0); 248 (65)] एमबी | |
| I14 | 242; 281; 319 | 9.24 | 13.52 | I14 | [304 (20); 276 (45) 290 (0)] एमबी | |
| N14 | 242; 281; 319 | 9.60 | 14.00 | N14 | [304 (7), 290 (17); 276 (17)] एमबी | |
| i15 | 256, 295, 333 | 10.06 | 14.51 | i15 | [318 (20), 314 (0); 290 (50)] एमबी | |
| A15 | 256, 295, 333 | 10.19 | 14.66 | A15 | [304 (30), 290 (टीआर); 276 (62)] एमबी | |
| N15 | 256, 295, 333 | 10.49 | 15.00 | N15 | [318 (5), 304 (13); 290 (18)] एमबी | |
| i16 | 270; 309; 347 | 11.04 | 15.5 | i16 | [332 (18), 318 (टीआर); 304 (42)] एमबी | |
| 1: मिथाइल 16 branched | 268; 307; 345 | 11.19 | 15.64 | i16: 1Δ 5 | [152 (2), 153 (10)] डीबी [292 (3), 278 (टीआर); 264 (2)] एमबी | |
| 1: मिथाइल 16 branched | 268; 307; 345 | 11.40 | 15.83 | i16: 1 9 Δ | [210 (3), 222 (3)] डीबी [292 (12), 278 (टीआर); 264 (40)] एमबी | |
| N16 | 270; 309; 347 | 11.59 | 16.00 | N16 | [332 (5), 318 (15); 304 (15)] एमबी | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.78 | 16.14 | N16: 1 Δ 5 | [152 (2), 153 (10)] डीबी | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.94 | 16.24 | N16: 1 Δ 8 | [196 (5), 208 (3)] डीबी | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 12.00 | 16.31 | N16: 1Δ 9 | [210 (3), 222 (3)] डीबी | |
| 16: 2 | 266; 305; 343 | 12.18 | 16.44 | N16: 2 Δ 5, 9 Δ | [152 (2), 153 (12)] डीबी [208 (1), 220 (2)] डीबी | |
| i17 | 284; 323; 361 | 12.25 | 16.5 | i17 | [346 (20), 332 (टीआर); 318 (35)] एमबी | |
| मिथाइल branched 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.43 | 16.64 | i17: 1Δ 5 | [152 (2), 153 (10)] डीबी | [344 (10), 316 (5)] एमबी |
| A17 | 284; 323; 361 | 12.47 | 16.66 | A17 | [332 (30), 318 (0); 304 (52)] एमबी | |
| मिथाइल branched 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.57 | 16.74 | i17: 1Δ 8 | [196 (2), 208 (2)] डीबी | [344 (10), 316 (5)] एमबी |
| मिथाइल branched 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.64 | 16.79 | i17: 1Δ 9 | [210 (3), 222 (3)] डीबी | |
| मिथाइल branched 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.70 | 16.84 | i17: 1Δ 10 | [224 (1), 236 (1)] डीबी | |
| मिथाइल branched 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.84 | 16.94 | A17: 1Δ 9 | [210 (3), 222 (4)] डीबी | [330 (10), 316 (0); (90)] एमबी |
तालिका 1: बेसिलस cereus ATCC 14,579 से फैटी एसिड की पहचान।
अवधारण बार, बराबर श्रृंखला लंबाई (ईसीएल) मूल्यों, और फैटी एसिड मिथाइल एस्टर (fames) के लिए आणविक आयनों दिखाए जाते हैं, एक साथ आणविक आयनों और DMOX के लिए नैदानिक आयनों और picolinyl डेरिवेटिव के साथ।
[] एमबी नैदानिक आयन जोड़ी 28 एएमयू के पहले और कार्बन शाखाओं में बंटी के बाद टुकड़ा करने के लिए इसी का एक नुकसान का संकेत है।
[] डीबी नैदानिक आयन जोड़ी को एक डबल बांड की दरार को इसी 12 एएमयू का एक नुकसान का संकेत है।
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Discussion
फैस वर्णलेख तालिका 1 में दिखाया गया प्रोफाइल बी cereus ATCC 14,579 एक अगर प्लेट की सतह पर हो के अनुरूप हैं। इसी प्रोफाइल प्राप्त किया गया जब जीवाणु ही तापमान 8 बजे पदार्थो तरल मीडिया में हो गया था। तरल मीडिया में उगाई बैक्टीरिया के मामले में, बैक्टीरियल बायोमास मध्यम विकास के centrifugation द्वारा एकत्र किया जाता है और विकास की स्थिति 8,19 के आधार पर पहले से वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार धोया जा सकता है। बी cereus द्वारा उत्पादित विभिन्न फैस की पहचान फैस के अनुपात में ठीक परिवर्तन कम तापमान 7.9 पर विकास के लिए आवश्यक कुछ जीन पर उत्परिवर्तित उपभेदों में पता लगाया जा करने की अनुमति दी।
आमतौर पर, ईसीएल एक निश्चित तापमान पर निर्धारित समायोजित अवधारण समय की लॉग मूल्यों उपयोग कर की गणना की जाती है 20 (इज़ोटेर्माल तापमान नियंत्रण के साथ एक ओवन का उपयोग)। इधर, क्योंकि पी करने के लिए एक गैर इज़ोटेर्माल ओवन के उपयोग केब्याज की प्रसिद्धि के एक अनुकूलित जुदाई ermit, गणना पद्धति का इस्तेमाल किया गया है कि पहले से रेखीय प्रतिधारण सूचकांकों 3,21 के लिए वर्णित है।
इस काम का उद्देश्य साहित्य में वर्णित उन लोगों के साथ गणना ईसीएल मूल्यों की तुलना करने के लिए नहीं है, लेकिन इन प्रतिधारण डेटा और स्पेक्ट्रा जानकारी के आधार पर एफए संरचना भविष्यवाणी करने के लिए, एक ही वर्णलेख प्रोफाइल के भीतर था। दरअसल, संतृप्त फैस के लिए, एक दिया शाखाओं में बंटी (आईएसओ या anteiso) हमेशा की तरह, ईसीएल में ही बदलाव का कारण बनता बराबर सीधे श्रृंखला एफए की तुलना में। इसके अलावा, ईसीएल बराबर polarity के एक स्तंभ पर Stransky 22 से मापा मूल्यों के साथ मिलान वर्तमान अध्ययन में गणना की थी। पहले से सूचना दी मूल्यों के साथ इस सहमति का संकेत है कि ईसीएल मानों इस प्रकार बी cereus के बी cereus का फैस वर्णलेख प्रोफाइल अन्य की स्थिति, या अन्य नस्लों के में उगाया (जैसे।, म्यूटेंट) से चोटियों के एक तेजी से पहचान के लिए बहुत उपयोगी होते हैं।
Picolinyl डेरिवेटिव, अधिक विशेषता DMOX डेरिवेटिव द्वारा उत्पन्न आयनों से शाखाओं में बंटी स्थान का संकेत आयनों प्रदान करते हुए डबल बांड की स्थिति को और अधिक आसानी से DMOX डेरिवेटिव के साथ सौंपा है। वर्तमान अध्ययन दोनों डेरिवेटिव से जानकारी के संयोजन मिथाइल branched श्रृंखला बी cereus है, जो अब तक खराब साहित्य में वर्णित किया गया है से असंतृप्त फैस की पहचान करने की उपयोगिता से पता चलता है।
jove_content "> प्रस्तावित दृष्टिकोण 2 दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है। एक तुलना, एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए के रूप में, प्रत्येक एफए, शुद्ध होना चाहिए काम और जैविक सामग्री की एक बड़ी राशि के कई हफ्तों का प्रतिनिधित्व। हालांकि, दृष्टिकोण ज्यामिति अंतर नहीं है ( सीआईएस, डबल सीमा से पार) एक बार प्रत्येक एफए की पहचान की है।, वे नियमित तौर पर उनकी प्रसिद्धि डेरिवेटिव, जैसे द्वारा छोटे रूप में 8 मिलीग्राम के रूप में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जीवाणु उपभेदों और म्यूटेंट तुलना करने के लिए या विकास की स्थिति के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए। हमारे हाथ में, की ताजा बैक्टीरियल कोशिकाओं फैस की मात्रा का ठहराव, जो विधि विकसित करने के लिए मुश्किल बैक्टीरिया के लिए लागू करता है। पहचान फैस से प्रत्येक के लिए मात्रा का ठहराव सीमा 1 एनजी / समाधान के μl जीसी / एमएस में इंजेक्ट किया है के लिए पर्याप्त थे।Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
लेखकों को अपने तकनीकी सहायता के लिए थॉमस Mison के आभारी हैं, और पांडुलिपि में संशोधन के लिए राहेल Kopec करने के लिए।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
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