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Neuroscience

Midbrain संस्कृतियों में रहने वाले डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के विश्वसनीय पहचान आरएनए अनुक्रमण और वें प्रमोटर संचालित EGFP अभिव्यक्ति का उपयोग

Published: February 10, 2017 doi: 10.3791/54981
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology (Caltech)

Summary

पार्किंसंस रोग (पीडी) में, द्रव्य नाइग्रा (एसएनसी) डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स पतित, मोटर रोग के लिए अग्रणी। यहाँ हम एक माउस EGFP व्यक्त एक tyrosine hydroxylase (ध) प्रमोटर अनुक्रम द्वारा संचालित से उदर मध्यमस्तिष्क न्यूरॉन्स संवर्धन, संस्कृतियों से अलग-अलग फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स कटाई, और आरएनए seq का उपयोग कर अपने transcriptome को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट।

Abstract

पार्किंसंस रोग (पीडी) में वहाँ एसएनसी में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की स्पष्ट अध: पतन के साथ मस्तिष्क भर में व्यापक न्यूरोनल घटाने के लिए bradykinesia, कठोरता, और कंपन अग्रणी है। एक फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग प्राथमिक उदर mesencephalic (वीएम) संस्कृतियों में रहने वाले डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की पहचान तय कोशिकाओं के immunostaining पर निर्भर बिना इन न्यूरॉन्स के चुनिंदा असुरक्षा का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करता है। यहाँ, हम अलग, अलग कर देना, और 3 सप्ताह के लिए संस्कृति माउस वीएम न्यूरॉन्स। हम तो EGFP प्रतिदीप्ति (एक tyrosine hydroxylase (ध) प्रमोटर द्वारा संचालित) का उपयोग संस्कृतियों में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की पहचान। व्यक्तिगत न्यूरॉन्स कांच micropipettes का उपयोग कर microcentrifuge ट्यूबों में काटा जाता है। अगला, हम काटा कोशिकाओं lyse, और सीडीएनए संश्लेषण और transposon की मध्यस्थता "tagmentation" का संचालन एकल कक्ष शाही सेना Seq पुस्तकालयों 1, 2 उत्पादन करने के लिए,गधा = "xref"> 3, 4, 5। एक गुणवत्ता नियंत्रण की जांच पारित करने के बाद, एकल कोशिका पुस्तकालयों अनुक्रम कर रहे हैं और बाद के विश्लेषण के जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए किया जाता है। हम व्यक्तिगत डोपामिनर्जिक और मध्यमस्तिष्क संस्कृतियों से अलग GABAergic न्यूरॉन्स के लिए transcriptome परिणाम की रिपोर्ट। हम रिपोर्ट है कि जी वें EGFP कोशिकाओं है कि काटा और अनुक्रम थे की 100% डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स थे। इन तकनीकों में तंत्रिका विज्ञान और आणविक जीव विज्ञान में बड़े पैमाने पर आवेदन करना होगा।

Introduction

पार्किंसंस रोग (पीडी) एक लाइलाज, उम्र से संबंधित neurodegenerative विकार है। इस अपेक्षाकृत आम विकार के कारण समझ खराब रहता है। वहाँ मस्तिष्क भर में व्यापक न्यूरोनल हानि, द्रव्य नाइग्रा (एसएनसी) में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की स्पष्ट neuronal अध: पतन के साथ, bradykinesia, कठोरता और कंपन के नैदानिक ​​नैदानिक ​​सुविधाओं के लिए अग्रणी है।

प्राथमिक मिश्रित एसएनसी डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स युक्त संस्कृतियों पार्किंसंस रोग के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक हैं। उदर tegmental क्षेत्र (VTA) डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स इनाम और लत में फंसाया गया है। उदर mesencephalic (वीएम) प्राथमिक मिश्रित भ्रूण संस्कृतियों एसएनसी और VTA डोपामिनर्जिक (डीए) न्यूरॉन्स और GABAergic न्यूरॉन्स दोनों होते हैं। वीएम प्राथमिक संस्कृतियों neuroprotection assays के लिए उपयोगी हो सकता है और डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के चुनिंदा असुरक्षा को स्पष्ट करने के लिए। संस्कृति में डोपामिनर्जिक कोशिकाओं आकृति विज्ञान के आधार पर पहचान करने के लिए कोई विश्वसनीय तरीका है। वहफिर हम पहचान करने और फसल एकल डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स, और निर्माण एकल कोशिका, उच्च उपज आरएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों तकनीक का विकास।

हम एकल डोपामिनर्जिक और मध्यमस्तिष्क संस्कृतियों से अलग GABAergic न्यूरॉन्स के लिए प्रतिनिधि आरएनए transcriptome डेटा की रिपोर्ट। इस प्रोटोकॉल डीए / गाबा transcriptome पर विभिन्न उपचार के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए neuroprotection, neurodegeneration, और औषधीय assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। क्योंकि डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स प्राथमिक वीएम संस्कृतियों में व्यक्त न्यूरॉन्स के एक छोटे से अल्पसंख्यक प्रतिनिधित्व करते हैं, मज़बूती से रह संस्कृतियों में इन न्यूरॉन्स की पहचान करने की क्षमता एकल कोशिका के अध्ययन के एक बढ़ाया रेंज में सक्षम होगा। ये उपन्यास तकनीक तंत्र सेलुलर स्तर पर जगह लेने को समझने के क्षेत्र में प्रगति की सुविधा होगी और अनुप्रयोगों के तंत्रिका विज्ञान और आणविक जीव विज्ञान के क्षेत्र में कहीं और हो सकता है।

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Protocol

नोट: सभी प्रयोगों देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों, और प्रोटोकॉल द्वारा प्रदान जानवरों के उपयोग के लिए दिशा-निर्देशों के अनुसार आयोजित की गई कैलिफोर्निया प्रौद्योगिकी संस्थान में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. भ्रूण माउस मस्तिष्क से प्राथमिक डोपामिनर्जिक सेल संस्कृतियों की व्युत्पत्ति

  1. समाधान और संस्कृति के माध्यम
    1. एस्कॉर्बिक एसिड शेयर समाधान की तैयारी
      1. एस्कॉर्बिक एसिड की 352 मिलीग्राम वजन। 20 एमएल के अंतिम कुल मात्रा के लिए बाँझ एच 2 ओ जोड़े। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें भंग करने के लिए। 0.2 माइक्रोन सिरिंज टिप और -20 डिग्री सेल्सियस पर 500 μL aliquots में स्टोर के माध्यम से फ़िल्टर।
    2. Papain स्टॉक समाधान की तैयारी
      1. 15 इकाइयों / 1x Hanks' संतुलित नमक के घोल में एमएल (HBSS) को papain पतला। ऊपर पिपेट और 5 बार नीचे मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए। विच्छेदन के दिन पर तैयार करें।
    3. DNase स्टॉक समाधान की तैयारी
      1. DNase के 20 मिलीग्राम वजन। 20 एमएल की कुल मात्रा को अंतिम बाँझ एच 2 ओ जोड़े। 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर टिप के साथ बाँझ फिल्टर। 1 एमएल aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    4. बंद करो समाधान की तैयारी
      1. 45 एमएल 1x HBSS में 10% से 5 एमएल दाता घोड़े का घोड़ा सीरम पतला। एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर टिप के साथ बाँझ फिल्टर। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    5. 4% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) शेयर समाधान की तैयारी
      1. वजन बीएसए के 2 जी और 45 एमएल की कुल मात्रा को अंतिम 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) जोड़ें। फ़िल्टर 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर टिप के साथ बाँझ। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    6. चढ़ाना माध्यम की तैयारी
      1. 494 एमएल माध्यम में, कि एल alanyl-एल glutamine (एल glutamine की एक स्थिर स्रोत) और दाता घोड़े का सीरम के 5 मिलीलीटर 1.25 एमएल संस्कृति मीडिया जोड़ें। फ़िल्टर 0.2 माइक्रोन सिरिंज fil के साथ बाँझआतंकवाद टिप। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    7. सेल संस्कृति माध्यम की तैयारी
      1. 196 एमएल चढ़ाना माध्यम में, 4 एमएल B27 और 200 μL एस्कॉर्बिक एसिड जोड़ें। फ़िल्टर 0.2 माइक्रोन फिल्टर के साथ बाँझ। 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान और एक सप्ताह के भीतर का उपयोग करें।
    8. 4% paraformaldehyde (पीएफए) समाधान की तैयारी
      सावधानी: paraformaldehyde उपयोग से संबंधित सामान्य सावधानियों इस प्रकार हैं: एक धूआं हुड का प्रयोग करें, त्वचा और आंख के संपर्क से बचने, वाष्प की साँस लेना से बचने, गर्मी या नग्न आग की लपटों से दूर रखना। उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक कपड़े पहनें। पीएफए ​​संवेदीकरण और जिल्द की सूजन पैदा कर सकता है, इसलिए अच्छी तरह से निपटने के बाद हाथ धो लो।
      1. 16% पीएफए ​​के 10 एमएल 1x पीबीएस, 7.4 पीएच के 30 एमएल में जोड़े।
    9. 0.1% ट्राइटन X-100 की तैयारी
      1. पिपेट 1 एमएल ट्राइटन X-100 9 एमएल 1x पीबीएस में एक 10% समाधान बनाने के लिए। पिपेट धीरे धीरे चिपचिपा समाधान विंदुक टिप को भरने के लिए अनुमति देते हैं। जिले के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्मसमाधान। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10% शेयर की दुकान।
      2. 0.01% (जैसे करने के लिए 10% शेयर पतला, 2 धारावाहिक 1:10 dilutions प्रदर्शन से: 9 एमएल 1x पीबीएस में 1 10 एमएल% समाधान पतला 1% समाधान बनाने के लिए, 9 एमएल 1x पीबीएस में 1% समाधान के 1 एमएल बनाने के लिए 0.1% समाधान)।
    10. 10% की तैयारी और 1% गधा सीरम
      1. एक 10% समाधान के लिए 1x पीबीएस के 9 मिलीलीटर गधा सीरम के 1 एमएल जोड़ें। एक 1% समाधान के लिए 1x पीबीएस, पीएच 7.4 से 49.5 एमएल गधा सीरम के 0.5 एमएल जोड़ें।
    11. 1x पीबीएस की तैयारी
      1. 10x पीबीएस पतला ओ 7.4 पीएच का हल एक पीएच मीटर का उपयोग कर के पीएच को समायोजित एच 2 के 450 एमएल में 50 एमएल जोड़कर 1x करने के लिए।
  2. संस्कृति बर्तन कोटिंग
    1. पाली एल ओर्निथिन कोटिंग
      1. कोट केवल 10 मिमी बाँझ तकनीक का उपयोग कर 120 μL पाली एल ओर्निथिन के साथ सभी 35 मिमी व्यंजन के केंद्र में व्यास गिलास नीचे। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। पाली-लो निकालना एक वैक्यूम Aspirator का प्रयोग करेंrnithine। बाँझ एच 2 ओ के साथ दो बार कुल्ला व्यंजन
    2. Laminin कोटिंग (1 मिलीग्राम के शेयर एकाग्रता / एमएल)
      1. बाँझ एच 2 ओ (अंतिम एकाग्रता 0.01 मिलीग्राम / एमएल) के 2 एमएल के साथ पतला 20 μL laminin।
      2. कोट केवल 10 मिमी 0.01 मिलीग्राम पतला laminin के 120 μL के साथ सभी बर्तन के केंद्र में व्यास गिलास नीचे / एमएल बाँझ तकनीक का उपयोग कर, और उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे या हे / एन लिए सेते हैं।
  3. माउस विच्छेदन
    नोट: इस विच्छेदन में तरीकों, कोशिकाओं के लिए कम से कम जोखिम के लिए तैयार कर रहे हैं के रूप में वे भ्रूण थैलियों से संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। कक्षों की व्यवहार्यता मध्यमस्तिष्क के विच्छेदन के लिए मस्तिष्क के केवल एक हिस्से को हटाने के द्वारा संरक्षित है। मध्यमस्तिष्क आय का अलगाव और अधिक तेजी से आवश्यकता के बिना क्षेत्र का उपयोग करने के लिए पूरे मस्तिष्क टुकड़े करना। माउस इस अध्ययन में इस्तेमाल तनाव के लिए सामग्री की तालिका देखें। सीओ 2 का उपयोग गर्भावधि दिन 14 पर एक समय पर गर्भवती माउस euthanize।
  4. 70% इथेनॉल के साथ euthanized माउस के पेट स्प्रे। 2 एक्स 3 दांत के साथ संदंश का उपयोग पेट के निचले हिस्से की त्वचा समझ और उदर गुहा कुंद ब्लेड शल्य कैंची का उपयोग खुला। प्रत्येक पक्ष पर laterally और proximally चलती दो कटौती करें। उदर गुहा का पर्दाफाश करने के लिए संदंश का उपयोग पेट की दीवार पर मोड़ो।
    नोट: गर्भाशय अब सामने आ रहा है। फुफ्फुस गुहा और वातिलवक्ष के सृजन को उजागर भी सुनिश्चित करता है कि पशु ठीक नहीं है।
  5. गर्भाशय सींग के दोनों सिरों कट गर्भाशय अलग करने के लिए। एक बाँझ हुड में एक पेट्री डिश में रखें।
  6. एक हाथ में सीधे-टिप संदंश का प्रयोग भ्रूण थैली खोलने के लिए और भ्रूण को हटा दें। जल्दी संदंश के साथ गर्दन पर सिर से pinching द्वारा सिर काटना। संदंश मजबूती थूथन पर रखा गया है, ताकि पृष्ठीय सतह पहुँचा जा सकता है के साथ सिर को स्थिर।
  7. अन्य हेक्टेयर में आयोजित संदंश का प्रयोगएन डी, बस mesencephalon के रिज से पहले त्वचा और खोपड़ी की परत चुटकी। त्वचा और खोपड़ी दुमदारी midline के साथ वापस छील। कोर्टेक्स और mesencephalon और सेरिबैलम पर अन्य के बीच एक टिप के साथ रिज के आसपास संदंश रखें।
  8. चुटकी और पूरे मध्यमस्तिष्क हटाने, व्याख्यान चबूतरे वाला पक्ष और दुम पक्ष पर सेरिबैलम पर अग्रमस्तिष्क पीछे छोड़ रहा है। एक विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे ठंड HBSS के साथ एक पेट्री डिश में रखें।
  9. शेष भ्रूण के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ।
  10. विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, मस्तिष्क खंड पर फ्लिप इतना है कि उदर की ओर अब सुलभ है। वहाँ अब 4 quadrants दिखाई दे रहे हैं। धीरे तानिका लोभी और ऊपर मस्तिष्क से दूर खींच कर तानिका और वाहिका के सभी निकालें।
  11. जबकि मध्यमस्तिष्क को अलग मस्तिष्क खंड स्थिर करने के लिए संदंश का प्रयोग करें। लगभग खंड के केंद्र में वेंट्रिकल में संदंश की एक टोंग रखें। पहले चुटकी पीछे की ओर कर, मैं ओर इशारा करते हुएपकवान, तो प्रत्येक पक्ष पर मध्यवर्ती Nto। दोनों पक्षों पर पार्श्व में कटौती करने से कम दो quadrants ले लो।
    नोट: ब्याज की ऊतक उदर अवर खंड है, जो घने प्रतीत होता है। इस क्षेत्र में दोनों VTA और एसएनसी शामिल हैं।
  12. ट्रिम और ऊतक कि कम घना है त्यागने: यह बेहतर और अवर colliculi भी शामिल है। विच्छेदित ऊतक पेट्री डिश के एक अलग क्षेत्र पर ताजा HBSS में दोनों VTA और एसएनसी युक्त रखें।
    नोट: माउस मस्तिष्क विकास के इस स्तर (E14) में, उदर मध्यमस्तिष्क में ब्याज के क्षेत्र Zona incerta और अन्य हाईपोथेलेमिक सेल समूहों से एक वेंट्रिकल से अलग है। विकासशील भ्रूण माउस मस्तिष्क के अधिक लम्बी संरचना इन क्षेत्रों में है, जो करीब एक साथ स्थित हैं वयस्क माउस मस्तिष्क के बीच भेद की अनुमति देता है।
  13. सभी मस्तिष्क क्षेत्रों के शेष के लिए दोहराएँ।
  14. सब के बाद मस्तिष्क खंडों विच्छेदित कर दिया गया है, तिमाही ईए के लिए संदंश और एक छुरी नंबर 11 का उपयोगलगभग बराबर आकार के टुकड़ों में चर्चा मध्यमस्तिष्क अनुभाग।
  • कोशिकाओं को अलग कर
    1. कोशिकाओं के enzymatic उपचार
      1. HBSS में सभी quartered मध्यमस्तिष्क खंडों हाथ में ले लिया और उन्हें एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में जगह के लिए एक विस्तृत बोर P1000 विंदुक टिप का उपयोग करें। खंडों ट्यूब के नीचे बसा है और HBSS कि quartered टुकड़े के साथ उठाया गया है दूर करते हैं।
      2. 15 मिनट के लिए ट्यूब के लिए papain समाधान के 500 μL जोड़ें और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह है। उंगली से Resuspend कोशिकाओं 7.5 मिनट के बाद ट्यूब flicking।
      3. एक विस्तृत बोर P1000 टिप का उपयोग करना, deoxyribonuclease मैं (DNase) समाधान के 1 एमएल विभाज्य में पिपेट केवल मध्यमस्तिष्क खंडों। खंडों ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें।
      4. एक विस्तृत बोर P1000 टिप का उपयोग करना, ठंडे स्थान पर समाधान के 1 एमएल युक्त कुल्ला करने के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को केवल मध्यमस्तिष्क खंडों हस्तांतरण। खंडों ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करते हैं और पर कुल्ला दोहरानेसीई अधिक।
    2. सेल निलंबन के यांत्रिक Trituration
      1. और ताजा स्थान पर समाधान और पिपेट अप के 1 एमएल के साथ पिछले कुल्ला बदलें नीचे 7x एक P1000 विंदुक टिप कोशिकाओं triturate के साथ। सेल को कम से कम करने के लिए अत्यधिक विचूर्णन से बचें।
      2. धीरे-धीरे ट्यूब के नीचे में 4% बीएसए समाधान के 200 μL pipetting द्वारा सेल निलंबन बुनियाद। ध्यान से सेल निलंबन परत में खलल न डालें से बचने के लिए विंदुक टिप वापस ले लें। 6 मिनट के लिए 280 XG पर centrifugation के बाद, P1000 के साथ सतह पर तैरनेवाला aspirate और मध्यम चढ़ाना के 1 एमएल में कोशिकाओं resuspend।
  • गिनती और चढ़ाना कोशिकाओं
    1. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की संख्या को पूरा करें। 1,000 कोशिकाओं / μL करने के लिए सेल निलंबन पतला, मध्यम चढ़ाना के साथ।
    2. एक वैक्यूम Aspirator का उपयोग करना, लेपित व्यंजन से laminin aspirate पर सबसे अधिक तीन व्यंजन के बैच में। प्लेट 120 μL (1.2 x 10 5 कोशिकाओं / पकवान (78.5 मिमी 2
    3. 1 घंटे बाद, ध्यान से कोशिकाओं के विघटन को कम करने के लिए संस्कृति डिश के एक गैरवरीय क्षेत्र के लिए संस्कृति के माध्यम से 3 एमएल जोड़ें।
    4. 3 सप्ताह के लिए 3 डी अंतराल पर सेल संस्कृति बर्तन पर पूरा मध्यम परिवर्तन के लिए एक आधा प्रदर्शन करना।

    • आरएनए अनुक्रमण के लिए 2. फसल काटने वाले संवर्धित-डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स

    नोट: सेल कटाई और एकल कोशिका शाही सेना अनुक्रमण प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्रा 1 में दी गई है।

    1. कदम प्रयोग के दिन से पहले प्रदर्शन
      1. आसुत एच 2 15 मिनट के लिए हे में 15 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में sonicating और उसके बाद फिर से स्वच्छ borosilicate ग्लास केशिका ट्यूबिंग। ट्यूबिंग नाली और RNase निष्क्रिय करने के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में रात भर सेंकना।
      2. हौसले से खोला प्रयोग करेंRNase मुक्त पिपेट सुझावों का एक microcentrifuge ट्यूब में RNase अवरोध समाधान के 1 μL (20 μL कुल मात्रा) के साथ अनुक्रमण किट से 10x lysis बफर के 19 μL मिश्रण से 10x प्रतिक्रिया बफर के एक शेयर समाधान तैयार करने के लिए। संक्षेप में एक सूक्ष्म सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर मिश्रण स्पिन और बर्फ पर रहते हैं।
      3. 10x प्रतिक्रिया बफर के 2 μL व्यक्ति 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब (काटा न्यूरॉन्स इकट्ठा करने के लिए प्रयोग किया जाता है) में से प्रत्येक में जोड़े। साथ न्यूरॉन्स की पहचान उचित टैग काटा जा रहा है और 4 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए दुकान नलियों लेबल।
    2. कदम प्रयोग के दिन पर प्रदर्शन
      1. कटाई pipettes के निर्माण।
        1. एक microelectrode खींचने और एक microforge के कांच लेपित हीटिंग फिलामेंट का उपयोग कर बेक्ड केशिका टयूबिंग से - (8 माइक्रोन 2) बड़े टिप व्यास micropipettes खींचो। एक लंबे शंकु के साथ micropipettes के लिए फार्म डांड़ी सेट करें। एक calibrated आईपीस रेखाजाल और एक उच्च शक्ति ओबी के साथ सुसज्जित एक microforge का प्रयोग करें(- 20 माइक्रोन 10) वांछित टिप आकार के लिए micropipette की नोक तोड़ने के लिए jective।
        2. microforge पिपेट धारक में micropipette जकड़ना और microforge पर धारक माउंट। रेशा को microforge और वर्तमान पर स्विच के यांत्रिक जोड़तोड़ का उपयोग कर इसे गर्म करने के लिए कांच लेपित हीटिंग रेशा ऊपर ध्यान में micropipette की नोक लाओ। गर्म रेशा विंदुक टिप स्पर्श करें। वर्तमान बंद कर जब विंदुक टिप उचित व्यास के पिघल गया है।
          ध्यान दें। वर्तमान बंद रेशा अचानक नीचे ले जाते हैं और विंदुक टिप से अलग, वांछित व्यास के साथ एक बड़े, खुले इत्तला दे दी पिपेट का निर्माण करने के लिए प्रेरित करेगा।
        3. एक बंद बॉक्स में पूरा micropipettes स्टोर जब तक जरूरत है।
      2. न्यूरॉन्स संचयन।
        ध्यान दें। सभ्य न्यूरॉन्स एक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 6 का एक संशोधित संस्करण निम्न काटा गया।
        1. अच्छी तरह से सीएलकि संस्कृतियों व्यंजन और संग्रह ट्यूबों तरल कीटाणुनाशक और पानी एक पानी से कुल्ला द्वारा पीछा उपयोग करने के साथ संपर्क में आने के सेल-कटाई कमरे के सभी सतहों ean। 80% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित सतहों के नीचे साफ कर लें और फिर एक RNase अवरोध-संचार पोंछे।
        2. बर्फ के साथ दो अछूता कंटेनर, नियमित रूप से (पानी) बर्फ के साथ एक और सूखी बर्फ के साथ एक और भरें। जगह 0.2 एमएल पीसीआर संग्रह नियमित रूप से बर्फ पर 10x प्रतिक्रिया बफर के 2 μL के साथ पहले से भरे ट्यूब।
        3. इनक्यूबेटर से न्यूरॉन्स युक्त संस्कृति पकवान निकालें, पकवान से संस्कृति के माध्यम से नाली, RNase मुक्त Dulbecco के पीबीएस (DPBS) के 2 एमएल के साथ कुल्ला और कटाई के लिए DPBS के 1 एमएल के साथ बदलें।
        4. फ्लोरोसेंट, गु पॉजिटिव एक औंधा, epifluorescence एक 40x चरण उद्देश्य, एक पारा दीपक, और एक GFP फिल्टर सेट के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग प्राथमिक मध्यमस्तिष्क संस्कृतियों में न्यूरॉन्स को पहचानें।
        5. एक मोटर या मैनुअल मील का उपयोग कर सेल सोम खत्म पिपेट स्थितिcromanipulator। कोमल चूषण प्लास्टिक micropipette धारक की ओर बंदरगाह से जुड़ी ट्यूबिंग के माध्यम से मुंह द्वारा लागू उपयोग करते हुए कांच micropipette में न्यूरॉन aspirate। इसके तत्काल बाद स्नान समाधान से सेल युक्त micropipette को हटा दें।
        6. एक 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब संग्रह युक्त प्रतिक्रिया बफर अंदर विंदुक टिप प्लेस, और, ट्यूब के पक्ष के खिलाफ टिप तोड़ने के नीचे के पास। micropipette की पीठ में एक बाँझ 21 जी सिरिंज सुई रखने और जावक दबाव लागू करने से micropipette के टूटे सिरे से - (1.5 μL 0.5) शेष तरल पदार्थ निष्कासित।
        7. 5 एक डेस्कटॉप सूक्ष्म सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करते हुए एस के लिए अपकेंद्रित्र संग्रह ट्यूब और सूखी बर्फ में यह फ्रीज। स्टोर संग्रह -80 डिग्री सेल्सियस पर एकल कक्षों युक्त ट्यूबों। आमतौर पर, 5 कोशिकाओं परिवेश के तापमान पर एक 1 घंटे की अवधि में पकवान प्रति काटा जाता है।

    3. एकल कोशिका शाही सेना Seq लाइब्रेरी जनरेशन

      <li> सबसे पहले कतरा सीडीएनए की पीढ़ी
      नोट: निम्न चरणों में वाणिज्यिक अनुक्रमण किट से अभिकर्मकों का उपयोग करें।
      1. पीसीआर कैबिनेट को बर्फ पर नीचे अभिकर्मकों लाओ। पहली बार एक कतरा मास्टर मिश्रण से अधिक 10% एक पीसीआर कैबिनेट में कमरे के तापमान पर निम्नलिखित अभिकर्मकों के संयोजन से तैयार: 2 μL 5x पहली कतरा बफर, 0.25 μL डीटीटी (100 मिमी), 1 μL dNTP मिश्रण (10 मिमी), 1 μL oligonucleotide ( 12 माइक्रोन), 0.25 μL RNase अवरोध करनेवाला, और 1 μL ट्रांसक्रिप्टेज (100 इकाइयों) रिवर्स। यह रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस मास्टर मिश्रण (प्रतिक्रिया प्रति 5.5 μL कुल मात्रा) है।
      2. सूखी बर्फ पर -80 सी से नमूने ले लो और पीसीआर कैबिनेट को लाने के लिए। एकल कोशिका नमूना के लिए निम्न जोड़ें: 1 μL 3 'प्राइमर 1 और 1 μL मात्रा निर्धारित आरएनए spikes। 72 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म ढक्कन thermocycler पूर्व निर्धारित करने के लिए एक चिलर ब्लॉक पर नमूने ले आओ।
      3. 72 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए thermocycler में ट्यूबों सेते हैं, और फिर एक पीसीआर कूलर रैक पर नमूने डाल दिया।मास्टर मिश्रण (कदम 3.1.1 से) का 5.5 μL प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब को जोड़ने और धीरे pipetting द्वारा मिश्रण। 5 एस के लिए 0.2 μL नलियों स्पिन और एक thermocycler में सेते हैं इस प्रकार है: 90 मिनट, 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस। 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
    1. प्रवर्धित पहले Strand सीडीएनए की शुद्धि।
      ध्यान दें: पीसीआर प्रवर्धित सीडीएनए स्थिरीकरण द्वारा चुंबकीय मनकों पर शुद्ध होता है। 0.2 एमएल ट्यूब के लिए एक चुंबकीय जुदाई डिवाइस का उपयोग करें।
      1. 1.5 एमएल ट्यूबों में चुंबकीय मोती विभाज्य। प्रत्येक का उपयोग करने से पहले, कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान को मनका aliquots लाने के लिए और अच्छी तरह से मिश्रण को फैलाने के लिए। भंवर चुंबकीय मोती जब तक समान रूप से मिलाया।
      2. चुंबकीय मोतियों की 25 μL प्रत्येक नमूने के लिए जोड़ें। नीचे कम से कम 10x पूरी मात्रा ऊपर pipetting और मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए से मिलाएं। आरटी पर सेते 8 मिनट मोती सीडीएनए बाँध जाने के लिए।
    2. पीसीआर मास्टर मिक्स की तैयारी
      1. एक addit के साथ सभी प्रतिक्रियाओं के लिए DS-सीडीएनए प्रवर्धन पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार5 μL 10x पीसीआर बफर, 2 μL dNTP मिश्रण (10 मिमी), 2 μL पीसीआर प्राइमर 2 (12 माइक्रोन), 2 μL 50x 2 पोलीमर्स मिश्रण है, और 39 μL nuclease मुफ्त पानी के मिश्रण से ional 10% (50 μL कुल मात्रा / प्रतिक्रिया)।
    3. पहले Strand का प्रवर्धन
      1. चुंबकीय जुदाई डिवाइस ≥5 मिनट पर नमूने और चुंबकीय मोतियों की जगह जब तक तरल पूरी तरह से स्पष्ट प्रतीत होता है, और वहाँ कोई मोती सतह पर तैरनेवाला में छोड़ दिया जाता है।
      2. जुदाई डिवाइस पर नमूने रखते हुए, तैरनेवाला पिपेट और त्यागें। 5 एस के लिए नमूने स्पिन ट्यूब की ओर से तरल इकट्ठा करने के लिए। चुंबकीय जुदाई डिवाइस पर नमूने 30 एस के लिए जगह है, तो एक P10 pipettor के साथ सभी शेष सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
      3. पीसीआर मास्टर मिश्रण के 50 μL प्रत्येक ट्यूब युक्त डीएनए पिछले चरण से मोती के लिए बाध्य करने के लिए जोड़ें। एक preheated थर्मल साइक्लर (95 डिग्री सेल्सियस) एक गर्म ढक्कन के साथ में ट्यूब रखें। निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग कर थर्मल साइकिल शुरूM: 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 26 चक्र, 30 एस के लिए 65 डिग्री सेल्सियस, 6 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस। फिर 72 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट। 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
        नोट: अधिक जानकारी के लिए इस अनुक्रमण उपयोगकर्ता पुस्तिका और नमूना सेटिंग्स को अनुकूलित करने के लिए।
    4. प्रवर्धित डबल असहाय सीडीएनए की शुद्धि
      1. मोतियों की 90 μL प्रत्येक नमूने के लिए जोड़ें। नीचे कम से कम 10x पूरी मात्रा ऊपर pipetting और मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए से मिलाएं। आरटी पर सेते 8 मिनट मोती सीडीएनए बाँध जाने के लिए। , ≥5 मिनट के लिए नमूने प्लस चुंबकीय जुदाई डिवाइस पर मोतियों की जगह जब तक तरल पूरी तरह से स्पष्ट प्रतीत होता है, और वहाँ कोई मोती सतह पर तैरनेवाला में छोड़ दिया जाता है।
      2. नमूने चुंबकीय जुदाई डिवाइस पर कर रहे हैं, सतह पर तैरनेवाला हटाने और त्यागें। चुंबकीय जुदाई डिवाइस पर नमूने रखें। मोती परेशान बिना प्रत्येक नमूने के लिए 85% इथेनॉल ताजा बना के 140 μL जोड़ें। 30 एस के लिए प्रतीक्षा करें। बंद सतह पर तैरनेवाला पिपेट। सीडीएनए बिया के लिए बाध्य रहेगाकपड़े धोने की प्रक्रिया के दौरान डी एस।
      3. एक बार और अधिक इथेनॉल धोने दोहराएँ।
      4. संक्षेप में नमूने स्पिन ट्यूब की ओर से तरल इकट्ठा करने के लिए। चुंबकीय जुदाई डिवाइस पर नमूने 30 एस के लिए जगह है, तो एक विंदुक के साथ सभी शेष इथेनॉल को हटा दें। कमरे के तापमान पर नमूने 2 के लिए जगह - 2.5 मिनट तक गोली सूखी और अब चमकदार है (यानी पहले एक दरार दिखाई देता है)।
        नोट: गोली सूखी केवल जब तक यह सिर्फ सूखी है। गोली कोई चमक के साथ मैट दिखेगा। गोली सूखी नहीं है, तो इथेनॉल नमूना कुओं में रहेगा, जो प्रवर्धित सीडीएनए वसूली दर और उपज कम हो जाएगा। अगर गोली ओवर-सूखी है, वहाँ गोली में दरारें होगा। यह अब से 2 मिनट rehydrate करने के लिए ले जाएगा और प्रवर्धित सीडीएनए वसूली और उपज कम हो सकता है।
      5. एक बार मोती सूख रहे हैं, मनका गोली कवर करने के लिए क्षालन बफर के 22.5 μL जोड़ें। चुंबकीय जुदाई डिवाइस से नमूने निकालें और मिश्रण अच्छी तरह से मोती resuspend। में10 मिनट के लिए आरटी पर cubate rehydrate करने के लिए।
      6. 5 एस के लिए नमूने स्पिन ट्यूब की ओर से तरल इकट्ठा करने के लिए। , ≥1 मिनट के लिए चुंबकीय जुदाई डिवाइस पर वापस नमूने रखें जब तक समाधान पूरी तरह से स्पष्ट है।
        ध्यान दें: मोतियों की एक छोटी सी आबादी ऊष्मायन के दौरान चुंबक के खिलाफ गोली नहीं हो सकता। इन unpelleted मोती पिपेट और नीचे उन्हें सतह पर तैरनेवाला के साथ resuspend, और फिर चुंबक जहां मोतियों की बाकी पहले से ही pelleted है ओर उन्हें विंदुक (मौजूदा गोली बाधा पहुँचा के बिना) के लिए।
      7. ऊष्मायन जारी रखें जब तक कोई मोती सतह पर तैरनेवाला में रहते हैं। एक nuclease मुक्त, कम आसंजन ट्यूब के लिए प्रत्येक ट्यूब से स्पष्ट शुद्ध सीडीएनए युक्त सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण। -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना जानकारी और दुकान के साथ प्रत्येक ट्यूब लेबल। नमूने अनिश्चित काल के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
    5. डीएनए एकाग्रता और टुकड़ा आकार का मापन
      1. एक 1 μL अल बढ़ाता द्वारा एक गुणवत्ता नियंत्रण की जाँच का संचालनएक fluorometer पर सीडीएनए के iquot। एक वैद्युतकणसंचलन प्रणाली (के रूप में 1 में वर्णित) का उपयोग करते हुए डी एस सीडीएनए के 1 μL (3 एनजी) का आकलन करें।
    6. डीएनए के विखंडन
      नोट: एक डीएनए नमूने तैयारी किट का प्रयोग करें।
      1. सीडीएनए के 20 μL (35 एनजी कुल) एक ट्यूब में जोड़े। Tagment डीएनए के 25 μL (टीडी) सीडीएनए युक्त ट्यूब बफर जोड़ें।
      2. TDE1 (Tagment डीएनए एंजाइम) के 5 μL ट्यूब को जोड़ने। पिपेट और नीचे 10x मिश्रण करने के लिए। प्रत्येक नमूने के लिए एक ताजा टिप का उपयोग करें। 1 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 280 XG पर अपकेंद्रित्र।
      3. एक गर्म ढक्कन के साथ एक thermocycler में नमूने की जगह और कम से इसे चलाने: 55 डिग्री सेल्सियस, 5.5 मिनट। जल्दी 50 μL QG समाधान (जेल निकासी किट) जोड़ें। पिपेट और नीचे 10x मिश्रण करने के लिए। अगले कदम के लिए सीधे आगे बढ़ें।
    7. खंडित डीएनए की शुद्धि
      1. मोती, पिपेट के 170 μL जोड़ें और नीचे 10x मिश्रण करने के लिए। यह 10 मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति दें। चुंबक पर ट्यूबों रखो। ट्यूबों के 10 मिनट के लिए चुंबक पर बैठते हैं।नमूने चुंबकीय जुदाई डिवाइस पर कर रहे हैं, सतह पर तैरनेवाला पिपेट और त्यागें।
      2. चुंबक पर ट्यूब को छोड़ दें और 85% इथेनॉल के 200 μL जोड़ें। 30 एस के लिए बैठते हैं, तो इथेनॉल दूर करते हैं। इथेनॉल धोने दोहराएँ। आरटी पर ट्यूब 1,000 XG स्पिन।
      3. ट्यूब चुंबक पर वापस रख दिया। किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल बंद पिपेट। नमूने 15 मिनट के लिए आरटी पर सूखे।
      4. क्षालन बफर के 21 μL जेल निकालना किट से जोड़ें। ट्यूब चुंबक, पिपेट बंद बैठते हैं और नीचे 10x मिश्रण करने के लिए। ट्यूब 15 मिनट के लिए आरटी पर बैठते हैं।
      5. 5 मिनट के लिए चुंबक के लिए ट्यूब लौटें। समाधान (शुद्ध डीएनए) एक नया ट्यूब में पिपेट 20 μL।
    8. खंडित डीएनए की टैगिंग और पीसीआर प्रवर्धन
      नोट: इस चरण में शुद्ध डीएनए एक सीमित चक्र पीसीआर कार्यक्रम के माध्यम से परिलक्षित होता है। पीसीआर कदम भी सूचकांक 1 (i7) और सूचकांक 2 (i5) के साथ ही आम एडाप्टर (पी -5 और P7) (क्लस्टर पीढ़ी और अनुक्रमण के लिए आवश्यक) कहते हैं। डीएनए रों का संदर्भ लेंअधिक जानकारी के लिए पर्याप्त तैयारी गाइड।
      1. एक नया ट्यूब में (सफेद टोपी) सूचकांक 2 प्राइमरों के 5 μL जोड़ें। एक नया विंदुक टिप का उपयोग सूचकांक 1 प्राइमर (ऑरेंज कैप) के 5 μL जोड़ें। पीसीआर मास्टर मिश्रण के 15 μL प्रत्येक ट्यूब में जोड़े।
      2. प्रत्येक ट्यूब पीसीआर प्राइमर कॉकटेल के 5 μl जोड़ें। शुद्ध डीएनए के 20 μL ट्यूब को जोड़ने। 5 बार - धीरे 3 विंदुक ऊपर और नीचे।
      3. 98 डिग्री सेल्सियस 30 एस, 10 एस, 30 एस के लिए 63 डिग्री सेल्सियस, 3 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 5 चक्रों के लिए 3 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस: पीसीआर एक thermocycler पर निम्नलिखित प्रोग्राम का उपयोग कर प्रदर्शन करना। 10 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो। पीसीआर साफ-अप करने के लिए तुरंत आगे बढ़ें या के लिए साइन अप करने के लिए 2 डी 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना संग्रहीत करते हैं।
    9. प्रवर्धित डीएनए टुकड़े की शुद्धि
      1. आरटी के लिए मोती लाओ। ताजा 85% इथेनॉल तैयार करें। पीसीआर मशीन से बाहर नमूने ले लो और नीचे संक्षेप में स्पिन।
      2. मोतियों की 30 μL ट्यूब को जोड़ने। धीरे पिपेट ऊपर और नीचे 10x मिश्रण। ट्यूब 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं। प्लेस बीएसी5 मिनट के लिए चुंबक पर कश्मीर। चुंबक पर ट्यूब के साथ एक पिपेट का उपयोग सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
      3. 85% इथेनॉल के 200 μL प्रत्येक ट्यूब में जोड़े। पिपेट 30 एस के बाद बंद इथेनॉल। 85% इथेनॉल धोने दोहराएँ। पिपेट 30 एस के बाद बंद इथेनॉल।
      4. चुंबक पर अब भी नलियों और टोपी के साथ खुला, 15 मिनट के लिए शुष्क हवा मोती अनुमति देते हैं। चुंबक से ट्यूबों निकालें।
      5. क्षालन बफर के 32.5 μL जोड़ें। धीरे विंदुक ऊपर और नीचे 10x। 15 मिनट - 10 के लिए चुंबक बंद सेते हैं।
      6. 2 मिनट के लिए चुंबक के लिए ट्यूब के बदले, या जब तक सतह पर तैरनेवाला मंजूरी दे दी है। ध्यान से एक नया ट्यूब सतह पर तैरनेवाला के 30 μL हस्तांतरण।
    10. डीएनए एकाग्रता और टुकड़ा आकार का मापन
      1. एक fluorometer पर सीडीएनए के 1 μL के डीएनए एकाग्रता बढ़ाता द्वारा एक गुणवत्ता नियंत्रण की जाँच का संचालन। वैद्युतकणसंचलन द्वारा डीएनए का टुकड़ा आकार का निर्धारण करते हैं। डी एस सीडीएनए के 1 μL (3 एनजी) का आकलन करें।
    11. अनुक्रमण
      1. एक अनुक्रमण की सुविधा के लिए एकल कक्ष शाही सेना Seq पुस्तकालयों लाओ। उत्पन्न 100 बीपी अनुक्रमण एक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 4 के बाद एक sequencer पर पढ़ता है।
        नोट: प्रत्येक अनुक्रमण पुस्तकालय उत्पन्न> 20 मिलियन अनोखे मानचित्रण पढ़ता है।

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    Representative Results

    यहाँ हम एक माउस EGFP एक tyrosine hydroxylase प्रमोटर अनुक्रम द्वारा संचालित व्यक्त करने से उदर मध्यमस्तिष्क न्यूरॉन्स संवर्धन, संस्कृतियों से अलग-अलग फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स कटाई, और आरएनए seq (चित्रा 1) का उपयोग कर अपने आरएनए transcriptome को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट। आंकड़ों से पता चला है कि वें-EGFP पॉजिटिव कोशिकाओं है कि काटा और अनुक्रम थे की 100% निम्नलिखित तीन महंगाई भत्ते से संबंधित जीन टेप की उपस्थिति वें, रासायनिक पदार्थ decarboxylase (डीडीसी), और डोपामाइन ट्रांसपोर्टर डैट के आधार पर डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स थे, (slc6a3)। TH-EGFP सकारात्मक कोशिकाओं के सभी इन तीन जीनों के रूप में शाही सेना Seq द्वारा मूल्यांकन व्यक्त किया। प्रत्येक एकल कोशिका शाही सेना Seq पुस्तकालय में 6,000 - 8,000 प्रोटीन जीन कोडिंग (चित्रा 2) पाया गया। डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स मजबूती के साथ कई निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर (nAChR) सब यूनिटों (तालिका 1) के अलावा डोपामाइन से संबंधित टेप व्यक्त करते हैं। हमने देखा है कि कोईटी कोशिकाओं है कि वें थे GABAergic के लिए नकारात्मक रहे थे के सभी; इसलिए हम Gad1 प्रतिलेख की उपस्थिति के आधार पर GABAergic के रूप में कोशिकाओं के रूप में शाही सेना seq द्वारा मूल्यांकन में परिभाषित किया। कोशिकाओं है कि हम GABAergic न्यूरॉन्स डोपामाइन से संबंधित टेप व्यक्त नहीं करते के रूप में परिभाषित लेकिन गाबा संश्लेषण, Gad1 के लिए एक प्रमुख जीन व्यक्त करते उल्लेख किया है। एकल कोशिका पुस्तकालयों भी लंबे समय से गैर-कोडिंग आरएनए, साथ ही टेप चैनल, रिसेप्टर्स, परमाणु प्रोटीन, histones, organellar प्रोटीन, और प्रतिलेखन कारक एन्कोडिंग का पता चला।

    आकृति 1
    व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में यह आंकड़ा 1. शाही सेना Seq, के रूप में प्राथमिक वें EGFP माउस Midbrain संस्कृतियों पर हमारे प्रयोगों में प्रदर्शन किया। (1) संस्कृति वें EGFP माउस 3 सप्ताह के लिए उदर न्यूरॉन्स। (2) एक पारा प्रकाश स्रोत और FITC / GFP फिल्टर का उपयोग रोमांचक GFP द्वारा फ्लोरोसेंट एकल न्यूरॉन्स को पहचानें। (3) वाई, चरण प्रकाशिकी के तहत एक ही 40x उद्देश्य वें एकल न्यूरॉन्स कल्पना और सही ढंग से पिपेट स्थिति। (4 - 5) कांच micropipette में महाप्राण एकल कक्ष। छवियाँ फसल कटाई के बाद एक सेल दिखाने: (4) चरण 40X; (5) EGFP प्रतिदीप्ति। (6) 72 डिग्री सेल्सियस पर oligo-dt प्राइमर के साथ lysis बफर के साथ कोशिकाओं lyse। (7) सीडीएनए संश्लेषण; 26 चक्र प्रवर्धन। (8) transposon की मध्यस्थता सीडीएनए के "tagmentation"। (9) सीडीएनए गुणवत्ता नियंत्रण की जांच और मल्टिप्लेक्स अनुक्रमण। (10) इसके बाद कम्प्यूटेशनल विश्लेषण Tophat, कफ़लिंक और Cuffdiff 7 का उपयोग कर। व्यक्त जीनों के रिश्तेदार बहुतायत लाख मैप किया प्रति प्रतिलेख के kilobase प्रति टुकड़े की इकाइयों में मापा गया था पढ़ता (FPKM)। शाही सेना seq के लक्ष्य के लिए एक सेल और उनके रिश्तेदार बहुतायत में व्यक्त जीनों की एक सूची प्रदान करने के लिए है। छवियाँ (2 - 4) वर्तमान Wor से कर रहे हैंकश्मीर, (6 - 10) पिछले एक रिपोर्ट 1 से संशोधित कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    चित्रा 2। प्रोटीन जीन कोडिंग वें EGFP पॉजिटिव कोशिकाओं से उत्पन्न एकल डोपामिनर्जिक शाही सेना Seq पुस्तकालय में पता चला की संख्या। 6000 - 8000 प्रोटीन जीन एकल कक्ष पुस्तकालयों में पाया गया। FPKM: लाख मैप किया प्रति प्रतिलेख के kilobase प्रति टुकड़े पढ़ता (FPKM)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    जीन डीए एकल कक्षों N = 10 GABAergic एकल कक्षों एन = 7
    FPKM (मतलब ± SEM)
    गु 4714 ± 764 1.2 ± 0.14
    डीडीसी 779 ± 167 0.8 ± 0.1
    slc6a3 / डैट 506 ± 144 0.5 ± 0.04
    Drd2 14 ± 8 0.1 ± 0.004
    chrna6 (α6) 174 ± 57 0.0
    chrna4 (α4) 17 ± 5 26.4 ± 2.3
    chrnb2 (β2) 9 ± 3 17.3 ± 1.2
    chrnb3 (β3) 38 ± 13 0.0
    Gad1 0.0 959.0 ± 70.0
    Htr3a 0.0 0.6 ± 0.01
    Htr3b 0.0 0.0

    तालिका 1 डोपामाइन से संबंधित और डोपामिनर्जिक और GABAergic न्यूरॉन्स में nAChR जीन टेप 21 दिन में VentrMidbrain संस्कृतियों में। TH-EGFP सकारात्मक और नकारात्मक न्यूरॉन्स के लिए शाही सेना Seq डेटा दिखाए जाते हैं। एकल कक्षों संस्कृति दिवस पर काटा गया 21. शाही सेना Seq आंकड़ों से पता चलता है कि वें-EGFP सकारात्मक न्यूरॉन्स tyrosine hydroxylase (ध), रासायनिक पदार्थ decarboxylase (डीडीसी), डोपामाइन ट्रांसपोर्टर डैट (slc6a3) सहित महंगाई भत्ते से संबंधित जीन टेप के उच्च स्तर पर था, और निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर (nAChR) α6, α4, β2 और β3 सहित सब यूनिटों। हालांकि, इन कोशिकाओं GABAergic मार्कर जीन glutamic एसिड decarboxylase 1 (Gad1) और सेरोटोनिन 5-HT3 रिसेप्टर ए और बी सब यूनिटों (Htr3A और Htr3B) के निम्न स्तर था। GABAergic न्यूरॉन्स कोई स्तर तक कम किया हैमहंगाई भत्ते से संबंधित जीन टेप, chrna6, chrnb3, और Htr3A / बी, लेकिन Gad1 का उच्च स्तर है। शाही सेना Seq (Cuffdiff) के आंकड़ों डोपामाइन से संबंधित, GABAergic, निकोटिनिक रिसेप्टर, और सेरोटोनिन टेप के लिए दिखाए जाते हैं। FPKM: लाख मैप किया प्रति प्रतिलेख के kilobase प्रति टुकड़े पढ़ता (FPKM)।

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    Discussion

    यहाँ हम एक फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग करें, तो एकल कोशिका शाही सेना seq के साथ प्रत्येक कोशिका का अध्ययन एक विषम आबादी से एकल कक्षों अलग। हम रिपोर्ट है कि जी वें EGFP कोशिकाओं है कि हम काटा और अनुक्रम की 100% निम्नलिखित तीन महंगाई भत्ते से संबंधित जीन टेप, वें, डीडीसी और slc6a3 की उपस्थिति के आधार पर वास्तव में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स थे। TH-EGFP सकारात्मक कोशिकाओं के सभी इन तीन जीनों के रूप में शाही सेना Seq द्वारा मूल्यांकन व्यक्त किया। यह electrophysiological अध्ययन से पता चला है कि कि प्रत्येक वें EGFP सेल भी डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स 8, 9 के साथ जुड़े आयन चैनल के एक प्रदर्शनों की सूची प्रदर्शित साथ सहमत नहीं था। इस प्रोटोकॉल में हम रहते हैं डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के लिए एक विश्वसनीय मार्कर के रूप में GENSAT tyrosine hydroxylase-EGFP माउस तनाव में 10 का उपयोग किया। गुम्मट संस्कृतियों में वहाँ वर्तमान में जीने डोपामिनर्जिक उनकी आकृति विज्ञान के आधार पर न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए कोई विश्वसनीय तरीका है। पहचान में हमारे व्यापक अनुभव के बावजूदtifying और केवल तीन काटा संदिग्ध डोपामिनर्जिक कोशिकाओं के दस में से डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग, wildtype संस्कृतियों में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स थे। इसके अतिरिक्त, हमने देखा है कि नहीं सभी कोशिकाओं है कि वीं के लिए नकारात्मक रहे थे की GABAergic थे। के रूप में शाही सेना seq द्वारा मूल्यांकन हम Gad1 प्रतिलेख की उपस्थिति और महंगाई भत्ते से संबंधित टेप के अभाव के आधार पर GABAergic के रूप में कोशिकाओं को परिभाषित किया।

    क्योंकि डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स प्राथमिक वीएम संस्कृतियों में व्यक्त न्यूरॉन्स के एक छोटे से अल्पसंख्यक प्रतिनिधित्व करते हैं, मज़बूती से रह संस्कृतियों में इन न्यूरॉन्स की पहचान करने की क्षमता उपलब्ध एकल कोशिका के अध्ययन की सीमा में वृद्धि होगी। इस प्रोटोकॉल डोपामिनर्जिक transcriptome पर विभिन्न उपचार के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए neuroprotection, neurodegeneration, और औषधीय assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एक प्रतिरक्षाऊतकरसायन, electrophysiological, biophotonic 11 के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं, और सिद्धांत रूप में, प्रोटिओमिक assays।एसई assays पार्किंसंस रोग और नशे की लत के अनुसंधान के लिए विशेष रूप से उपयोगी होते हैं। लेकिन निश्चित रूप अनुरूप प्रोटोकॉल, GENSAT चूहों या इसी तरह लेबल चूहों, पर अन्य राज्यों के लिए बीमारी या कोशिकाओं है कि दुर्लभ हैं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। साथ ही, इस प्रोटोकॉल एक दिया न्यूरोनल उपप्रकार के भीतर विविधता के एक उभरते दृश्य देता है।

    पिछले अध्ययनों में, एकल कोशिका की कटाई के बाद हम इसे सीधे पीबीएस में रखा; लेकिन अब हम प्रतिक्रिया बफर में सीधे काटा एकल कोशिका जगह है। के रूप में प्रत्येक पुस्तकालय में पाया जीनों की संख्या द्वारा मूल्यांकन यह बेहतर गुणवत्ता शाही सेना Seq पुस्तकालयों में यह परिणाम है। तकनीक का मुख्य सीमाओं में से एक है कि fluorescently टैग कोशिकाओं आवश्यक हैं। जैसा कि पहले कहा, वहाँ एक मिश्रित आकृति विज्ञान पर आधारित संस्कृति में एक विशेष सेल प्रकार की पहचान करने के लिए कोई वास्तव में विश्वसनीय तरीका है। सेल विशिष्ट फ्लोरोसेंट या माउस लाइनों Cre व्यक्त की बड़ी रेंज अब उचित रूप से कई मामलों में कोशिकाओं को चिह्नित प्रदान करता है। हालाँकि, ध्यान थानेदारजब एक उपयुक्त फ्लोरोसेंट माउस लाइन का चयन ULD लिया जाना, के रूप में ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की एक व्यापक अध्ययन में पाया गया है कि वें-CRE दस्तक माउस लाइनों एक्ज़िबिट nondopaminergic कोशिकाओं 12 में transgene अभिव्यक्ति सुनाया।

    इसके अतिरिक्त, एक और कदम भविष्य प्रयोगों में अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है कि micropipette के वांछित टिप आकार है। भविष्य प्रयोगों डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के अलावा अन्य प्रकार की कोशिकाओं के उपयोग में शामिल हैं, micropipette टिप आकार ब्याज की सेल के लिए अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है।

    आरएनए गहरी अनुक्रमण प्रोटीन की तुलना में अधिक शक्तिशाली तकनीक है। शाही सेना Seq अच्छे रन-टू-रन reproducibility देता है। पता चला गतिशील रेंज कोशिकाओं के भीतर वास्तविक प्रतिलिपि बहुतायत के बराबर है। एक वैकल्पिक ब्याह रूपों और उपन्यास isoforms पता लगा सकते हैं। एक संदर्भ जीन के बिना नमूनों की नए सिरे से विश्लेषण संभव है; और अगर एक नया संदर्भ जीन की खोज की है डेटा के लिए फिर से विश्लेषण किया जा सकताविशिष्ट जीन (एस) गीला काम प्रयोग फिर से 13 चलाने के लिए बिना।

    संक्षेप में, हम रिपोर्ट है कि जी वें EGFP कोशिकाओं है कि काटा और अनुक्रम थे की 100% डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स थे। इस तकनीक को अन्य खबरें हैं कि तीव्रता से GENSAT चूहों, 14, 15 और तकनीक तंत्रिका विज्ञान और आणविक जीव विज्ञान में बड़े पैमाने पर आवेदन करना होगा से अलग या लंबी अवधि सुसंस्कृत डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की पहचान फैली हुई है।

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Papain Worthington Biochemical Corporation  LS003126
    Hanks-balanced Salt Solution (HBSS), 1x Gibco  14175-095
    Donor Equine Serum Thermo Scientific  SH30074.03
    Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma  A7030-50G
    Medium: Neurobasal medium Gibco  21103-049
    Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX Gibco  35050-061 0.5 mM final concentration.
    L-Ascorbic acid Sigma  A7506
    B27 Gibco  17504-044 50x stock solution, 1x final concentration.
    35 mm glass bottom dishes MatTek   P35GC-1.5-10-C
    Poly-L-Ornithine Sigma  P4957
    Laminin Sigma  L2020 Stored at -20 °C in 20 µL aliquots
    Deoxyribonuclease I (DNase) Sigma  DN25
    Blue pipette tips P1000 Sorenson Bioscience  Inc. 10130
    10 mm shallow Petri dish VWR  25384-324
    37 °C Water bath
    37 °C, 5% humidity incubator
    16% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
    Triton X-100 Sigma  X100-500ML
    Donkey serum Equitech  SD-0100HI 100% stock solution, 1% final concentration.
    Standard Pattern surgical scissors Fine Science Tools 14000-14
    Forceps - 2x3 teeth Fine Science Tools 11022-14
    Forceps - Dumont #55 Fine Science Tools 11295-51
    Forceps - Dumont #5 Fine Science Tools 11252-23
    10x PBS, pH 7.4 Gibco  70011-044
    Dulbecco's Phosphate-buffered solution (DPBS) 1x Gibco 14190-144 500 mL
    21 G needle BD PrecisionGlide Needle 305167 100 needles
    Micropipette puller Sutter Instrument model P-87
    Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-285
    Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing Clontech 634936 100 rnxs,incl Advantage2PCR Kit
    oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) From the SMARTer Kit 
    Reverse transcriptase (100 units) SMARTcribe reverse transcriptase From the SMARTer Kit 
    Primer 1 3’ CDSIIa primer  From the SMARTer Kit
    Primer 2 IS PCR primer From the SMARTer Kit
    50x 2 polymerase mix 50x Advantage 2 polymerase mix From the SMARTer Kit
    10x PCR buffer 10x Advantage 2 PCR buffer From the SMARTer Kit
    RNA Spikes ThermoFisher 4456740
    PCR cooler rack IsoFreeze PCR cooler rack
    DNA Sample Preparation Kit  (Illumina/Nextera) Nexter FC-121-1030 24 Samples
    PCR master mix Nextera PCR master mix (NPM) From the Nextera Kit 
    PCR primer cocktail (PPC)  Nextera PCR primer cocktail (PPC)  From the Nextera Kit
    Fluorometer The Qubit ThermoFisher Q33216
    HS DNA BioAnalyzer kit Agilent 5067-4626 110 rxns
    Electrophoresis system  Agilent 2100 Bioanalyzer. G2938C
    Magnetic beads: Agencourt AMPure  Beckman Coulter A63880 5 mL
    RNAse wipe: RNAse Zap wipes Ambion AM9786 Size 100 Sheets
    Qubit ds HS Assay Kit Molecular probes  Q32854 500 assays
    Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen  28704
    Glass capillary tubing (Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm o.d.)
    Microforge Narishige (or equivalent) 
    Sequencer Illumina HiSeq instrument
    GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain  MMRRC stock number: 000292-UNC Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center

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    References

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    तंत्रिका विज्ञान अंक 120 एकल कोशिका शाही सेना अनुक्रमण सेल कटाई मध्यमस्तिष्क संस्कृतियों डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स पार्किंसंस रोग
    Midbrain संस्कृतियों में रहने वाले डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के विश्वसनीय पहचान आरएनए अनुक्रमण और वें प्रमोटर संचालित EGFP अभिव्यक्ति का उपयोग
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    Henley, B. M., Cohen, B. N., Kim, C. … More

    Henley, B. M., Cohen, B. N., Kim, C. H., Gold, H. D., Srinivasan, R., McKinney, S., Deshpande, P., Lester, H. A. Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression. J. Vis. Exp. (120), e54981, doi:10.3791/54981 (2017).

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