Introduction
ووصف الميتوكوندريا كلاسيكي باسم قوة الخلوية، لأنها هي المقاعد الرئيسية لإنتاج الطاقة في الخلايا المتمايزة. وعلاوة على ذلك، الميتوكوندريا تلعب دورا حاسما في عملية التمثيل الغذائي وتوليد الحرارة، وتعديل الدهون والكالسيوم والتوازن الأكسدة، وتزامن عمليات الخلية إشارات، الخ 1. الميتوكوندريا أيضا أن تلعب دورا نشطا في تحريض الخلايا الموت 2، وكذلك في خلية تنظيم دورة 3. هذه وظائف متعددة تثير الأسئلة الأساسية التالية: أ) كيف الميتوكوندريا أداء كل هذه المهام في وقت واحد وب) وهناك حمامات الميتوكوندريا محددة أو subzones التي تخصصت لوظائف مختلفة؟ في هذا السياق، من المهم أن نلاحظ أن الميتوكوندريا متعددة الوظائف الحيوية في شكلها وحجمها، وهيكل داخل الخلايا الفردية، وأنه شكل حالة استقرار الميتوكوندريا يمكن أن تختلف بين أنواع الخلايا. عقود من البحث من مختلف مختبروتشير الخطابات أن تغيير شكل الميتوكوندريا وحجم وهيكل، التي تسمى مجتمعة ديناميات الميتوكوندريا، أمر بالغ الأهمية للحفاظ على وظائف مختلفة الميتوكوندريا 4،5،6. هذه النتائج تثير إمكانية أن الميتوكوندريا قد يحقق لها وظائف متعددة بحكم ديناميكية الهيكلية.
جارية لفهم العلاقة بين الهيكل وظيفة الميتوكوندريا جهود واسعة النطاق. يتم الحفاظ على دينامية هيكل الميتوكوندريا في المقام الأول من خلال قدرتها على الخضوع الانشطار والانصهار الأحداث مع بعضها البعض. انشطار الميتوكوندريا كبيرة تحولها إلى عناصر الميتوكوندريا أصغر، في حين التحام بين مؤسستي الميتوكوندريا أصغر يدمج منهم إلى عنصر الميتوكوندريا أكبر 7. وعلاوة على ذلك، قد يحدث الانصهار عابرة اثنين من الميتوكوندريا للسماح للخلط محتوياتها. تخضع الأحداث الانشطار والانصهار في الأغشية الميتوكوندريا الداخلية والخارجية بعناية من قبل المواصفاتيحدد IFIC من البروتينات. ويتكون الجهاز الانشطار الأساسية من البروتين ذات الصلة dynamin 1 (Drp1)، الذي يتم تجنيده من العصارة الخلوية إلى الميتوكوندريا التي كتبها تفاعلها مع بعض الحسنة بروتينات الميتوكوندريا الحسنة (على سبيل المثال، Fis1 أو Mff1)، في حين أن وظيفة Drp1 يمكن أيضا أن ينظم من قبل بروتينات أخرى على سطح الميتوكوندريا 4. على الرغم من أن Drp1 تعمل على الغشاء الخارجي، والقدرات الانشطار لها تؤثر على الغشاء الداخلي كذلك. تزامن للانشطار أغشية الميتوكوندريا الخارجي والداخلي ليست مفهومة جيدا. من ناحية أخرى، يخضع انصهار الغشاء الداخلي في صلب الأنشطة التي يقوم بها Opa1، في حين يحكم mitofusins انصهار الخارجي غشاء 5. التوازن في مواجهة الانشطار والانصهار أحداث الميتوكوندريا تملي شكل الميتوكوندريا حالة استقرار في خلية. على سبيل المثال، فإن القمع الانشطار الميتوكوندريا يؤدي إلى الانصهار الكامل وبدون معارضة، في حين أن الإفراط في النشاط الميتوكوندرياسيكون ل الانشطار يؤدي إلى تفتت الميتوكوندريا 3.
دراسة العلاقة بين الهيكل وظيفة الميتوكوندريا ينطوي في المقام الأول نهجين مجانية: أ) تحليل الظواهر الخلوية والعضوي بعد التلاعب الجيني للبروتينات الانشطار / الانصهار الميتوكوندريا وب) التقييمات المباشرة للهيكل الميتوكوندريا وظيفة. ومن الجدير بالذكر أن التحاليل الجينية قد لا تكشف دائما وظيفة مباشرة للجزيء في متناول اليد (في هذه الحالة، الميتوكوندريا البروتينات الانشطار / الانصهار)، كما قد تنشأ الظواهر بسبب آثارها الجانبية. ولذلك، فإنه من الأهمية بمكان لتطوير واستخدام أدوات لدراسة بنية الميتوكوندريا وظيفة مباشرة. أي تقييم لهيكل الميتوكوندريا يتضمن أدوات الفحص المجهري مختلف. استخدام المجهر مضان من الخلايا الحية قد تقدم كثيرا من الدراسات ديناميات الميتوكوندريا، منذ ديناميكية الميتوكوندريا يمكن رصدها من حيث الكم وquantitatively باستخدام أدوات وتقنيات 8 مضان المجهر المناسبة. وقد تم تطوير الأدوات التي تعتمد على الفحص المجهري مضان لدراسة بنية الميتوكوندريا وظيفة في أنسجة البطن الحية والثابتة ذبابة الفاكهة، توضيح أهمية حيوية الميتوكوندريا في الجسم الحي 9. يتم وصف هذه الأساليب وذات الصلة هنا، وذلك بهدف دراسة بنية الميتوكوندريا وظيفة في المبيض ذبابة الفاكهة.
يتكون المبيض ذبابة الفاكهة من سلالة الجرثومية والجسدية الأنساب، التي تنشأ من الخلايا الجذعية البالغة في كل منها الموجودة في germarium 10،11. ستة عشر الخلايا الجرثومية المخلوي (GCS) الحصول على تغليف بواسطة خلايا بصيلات الجسدية (FCS) لتشكيل غرف البيض الفردية التي تنشأ من germarium (الشكل 1). واحدة من 16 GCS الحصول ملتزمة تصبح بويضة، و15 GCS المتبقية تتطور إلى خلايا الممرضة التي تدعم نمو غرفة بويضة، وتسهيل نضوج البويضة قبل وضعه. الغالبية العظمى من السفح الخضوع 9 جولات من الانقسامات الإنقسامية قبل خروجها من دورة الخلية الإنقسامية للتمييز عضال في طبقة الخلايا الظهارية نمط تتكون من خلايا الأمامي جريب (AFCs)، وخلايا الخلفي بصيلات بالفلور، وخلايا الجسم الرئيسية (MBCS) . يتم توصيل الدوائر البيض على التوالي من قبل خلايا ساق، والتي تتمايز الخلايا التي تستمد أيضا من السفح في وقت مبكر في عملية التنمية. شكل الميتوكوندريا التي تنظمها الميتوكوندريا Drp1 البروتين الانشطار وتشارك بنشاط في عملية التمايز خلال التطور الطبيعي للذبابة الفاكهة المبيض طبقة FC 9،12. ووصف الأساليب المستخدمة في هذه الدراسات للتعرف على إشراك Drp1 في ذبابة الفاكهة تطوير طبقة الخلايا المسام هنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد ذبابة الفاكهة (الأدوات المطلوبة وصفت في الشكل 2A)
- للحصول على أي من التجارب وصفها، جمع ذبابة الفاكهة (الحفاظ على درجة حرارة الغرفة، أو 25 درجة مئوية) في غضون 5 أيام من eclosion ووضعها في قارورة مملوءة 5-7 مل من ذبابة الفاكهة الغذائية (انظر المواد الجدول)، مع عدم وجود أكثر من 25 الذباب في كل قارورة. الحفاظ على الإناث: نسبة الذكور من 2: 1.
- رش كمية صغيرة من خميرة حبيبات لتحفيز إنتاج البيض ذبابة الفاكهة. أداء التلاعب التجريبية ضمن 2-4 أيام.
2. تشريح ذبابة الفاكهة المبايض (الأدوات المطلوبة وصفت في الشكل 2A)
- دافئ حشرة تشريح المتوسطة (انظر المواد الجدول) إلى درجة حرارة الغرفة 25 درجة مئوية. ملء ثلاثة آبار ثمانية جيدا طبق زجاج تشريح، مع 200 ميكرولتر من المتوسط في كل بئر.
- تخدير ذبابة الفاكهة مع ثاني أكسيد الكربون
- في حين يبحث من خلال العدسة المجهر تشريح، قطع القفص الصدري من البطن باستخدام اثنين من أزواج من الملقط. باستخدام ملقط، ونقل بعناية البطن إلى البئر الثاني من الطبق.
- استخدام زوج واحد من ملقط لعقد البطن في نهاية الخلفي، وببطء دفع المبايض من (جنبا إلى جنب مع محتويات البطن الأخرى) مع زوج آخر من ملقط. إذا فشلت هذه المحاولة، وإزالة بعناية الهيكل الخارجي البطن عن طريق إدراج ملقط في نهاية الأمامي للافراج عن المبايض.
- باستخدام ملقط، عقد المبيض الفردية في نهاية الخلفي مبهمة (أي البيض مليئة صفار البيض، في وقت متأخر من المرحلة) ونقلها بعناية إلى البئر الثالث من الطبقلإغاظة لمعالجة ذلك للفحص المجهري المباشر (الخطوة 3) أو لتحديد لأداء المناعية (الخطوة 7).
- بعناية ندف غلاف واق من حول المبايض التي تجتاح إبرة إغاظة طفيفة من الخلفية إلى الأمامية نهاية كل المبيض أثناء الضغط من قبل نهاية الخلفي مع زوج من الملقط.
ملاحظة: لتقليل الضرر أثناء إغاظة، ينحني رأس الإبرة والتكبير على كل المبيض عن طريق زيادة التكبير من المجهر (الشكل 2A). وينبغي أن يكون إغاظة فعالة بما فيه الكفاية لكسر غمد، ولكن يجب أيضا أن يتم ذلك بعناية للحفاظ على سلامة ovarioles.
3. إعداد لالمجهري لايف الأنسجة
ملاحظة: الأدوات المطلوبة وصفت في الشكل 2A.
- قبل ذبابة الفاكهة تشريح، وإعداد polyL يسين غرف المغلفة. تحقيقا لهذه الغاية، وضع قطرتين 20 ميكرولتر من polyL ليسين (0.1 ملغ / مل) على coverglالحمار (14 مم، رقم 0) طبق بتري القاع الزجاجي (35 ملم) على مسافة معقولة من بعضها البعض من أجل منع اندماج قطرات. الهواء الجاف لوحات لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، وعلامة على حواف بيضاء فيلم polyL يسين على الجانب السفلي من لوحة مع علامة قابل للمسح.
ويمكن تخزين polyL يسين المغلفة غرف في 4 درجات مئوية لمدة أسبوع: ملاحظة. في حالة استخدام غرفة مطلية سابقا، وإحضاره إلى درجة حرارة الغرفة قبل البدء في تشريح ذبابة الفاكهة. - تعيين المعلمات المسح على المجهر متحد البؤر للتأكد من أن العينة يمكن تصوير مباشرة بعد الانتهاء من تشريح والتركيب، على النحو التالي.
- مكان واحد تشريح ومازحت المبيض (بعد الخطوة 2 والملون، وإذا لزم الأمر، وبعد الخطوة 5) في منطقة المغلفة polyL يسين بعلامات ونشر المبيض مع الإبرة إغاظة لفصل ovarioles. وضع قطرة 10 ميكرولتر من المتوسطة تشريح الحشرات فوق المبيض، مع التأكد من تغطية رانه كامل منطقة polyL يسين المغلفة. تغطية طبق بتري.
- أداء فورا المجهري متحد البؤر من العينة التي شنت في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يجب تشريح واحد فقط ذبابة الفاكهة، وتجهيزها، وتصويرها في وقت واحد. أيضا، لا ينبغي أن يقوم المجهري عند 37 درجة مئوية، والتي سوف تحاكي بيئة الصدمة الحرارية للأنسجة ذبابة الفاكهة.
4. الإسفار الخسارة في photobleaching من (FLIP) الفحص لتقييم الميتوكوندريا مصفوفة الاستمرارية
تم تأسيس استمرارية مصفوفة الميتوكوندريا في بنية الميتوكوندريا تنصهر بعد الانصهار الكامل في الأغشية الداخلية والخارجية الميتوكوندريا بعد التقدم من خلال خطوات وسيطة: ملاحظة. انشطار الميتوكوندريا قد اتبع نفس الخطوات ولكن في الاتجاه المعاكس (الشكل 3A). نقف هو الوقت الفاصل بين طريقة القائم على الفحص المجهري نصف الكمية التي يمكن استخدامها لتقييم استمرارية مصفوفة الميتوكوندريا فيالدولة تنصهر النهائية من خارج الحي الميتوكوندريا (الخطوات 3 و 4 في الشكل 3A) في المبايض ذبابة الفاكهة الحية 9. يتم تنفيذ فحص الوجه كمنطقة صغيرة من الفائدة (ROI) من الميتوكوندريا معربا عن جزيء فلوري في المصفوفة الميتوكوندريا التي photobleached على فترات منتظمة (FLIP العائد على الاستثمار في الشكل 3A). ونتيجة لذلك، فإن أي منطقة الميتوكوندريا المحيطة التي هي مستمرة مع العائد على الاستثمار FLIP (ROI التجريبي في الشكل 3A) تفقد إشارة بسبب تبادل الجزيئات في المصفوفة الميتوكوندريا مستمرة. وأجريت التجارب نقف تظاهر هنا على المعدلة وراثيا ذبابة الفاكهة معربا عن mitoYFP، الذي يحتوي على تسلسل استهداف الميتوكوندريا من السيتوكروم أوكسيديز الثامن فرعية الإنسان ذات الكلمات الدلالية مع YFP لاستهدافه إلى مصفوفة الميتوكوندريا في شكل إنتشاري بحرية. ويمكن أيضا تجربة مماثلة أن يؤديها مع التحوير ميتو pUASP-ميتو-GFP، كما ذكرت سابقا <سوب> 9. ويمكن استخدام بروتوكول نقف مماثل مع لجنة التحقيق التي تستهدف الفضاء بين غشاء الميتوكوندريا لتكون قادرة على الكشف عن الاستمرارية الناتجة من اندماج الخارجي ولكن ليس أغشية الميتوكوندريا الداخلية (الخطوة 2 في الشكل 3A).
- فتح البرنامج الحصول على الصور على المجهر متحد البؤر وتعيين المعلمات المسح المناسبة في "اكتساب" علامة التبويب (الجدول 1). التحقق من "السلاسل الزمنية"، "تبيض"، و "صندوق المناطق" لفتح علامات الفردية. وضع قيم المعلمات الاستحواذ المناسبة في كل علامة تبويب (الجدول 1).
ملاحظة: يجب أن تترك الثقب مفتوحة، كما تم تصميم هذه التجربة لمراقبة إشارة عموما من السكان الميتوكوندريا كله في الخلايا الفردية. - استخدام العدسة لتحديد مكان بسرعة في مجال الاهتمام في الأنسجة الحية التي شنت.
ملاحظة: حدد ovarioles التي تنتشر بشكل جيد على الزجاج bottomeد طبق، منذ المجهري متحد البؤر لا يمكن أن يؤديها على ovarioles العائمة. - انقر فوق "العيش" للحصول على صورة حية من الحقل المحدد من الفائدة. انقر على "وقف" لوقف المسح الحية.
- إذا لزم الأمر، وضبط المعلمات اقتناء مثل هذا إشارة الفلورسنت الكشف عن أقل من مستويات التشبع (المشار إليها لعدم وجود بكسل الحمراء عند تحديد الخيار "مؤشر مجموعة")، مع خلفية محددة كما هو مبين من خلال تعديل قيم الإزاحة.
- رسم العائد على الاستثمار صغير باستخدام أداة رسم بيزيه من علامة التبويب "المناطق" لترسيم منطقة photobleaching من على الصورة المكتسبة عن طريق المسح الضوئي الحية.
ملاحظة: يجب أن يكون حجم العائد على الاستثمار حول 20-50٪ من إجمالي إشارة الميتوكوندريا الفلورسنت داخل الخلية. - أداء الحصول على الصور من خلال النقر على "بدء التجربة."
- قياس كثافة مضان باستخدام الملكية أو برمجيات المصدر المفتوح (انظر الموادالجدول). تسجيل يعني إشارة من العائد على الاستثمار حيث استهدف تبيض المتكررة (FLIP). رويس حيث لم يتم تنفيذ تبيض في نفس الخلية (التجريبية)؛ العائد على الاستثمار من الخلايا غير مقصور آخر في نفس مجال الرؤية، لتقييم تبيض الإجمالي خلال الفترة التجريبية (تبييض)؛ والعائد على الاستثمار في المنطقة الخلفية (خلفية). طرح إشارة الخلفية يعني الحصول عليها من المتوسط في إشارة رويس الآخرين. تطبيع إشارة الفلورسنت مع الإشارة قبل التبييض الأولي للخلية منها.
- مؤامرة تطبيع البيانات باستخدام أي برنامج التآمر القياسية.
5. تلطيخ العيش مع نيون الميتوكوندريا الأصباغ
ويمكن تقييم هيكل الميتوكوندريا ثابت للدولة وإمكانية استخدام الأصباغ التي تتضمن على وجه التحديد في الميتوكوندريا في الخلايا والأنسجة الحية: ملاحظة. المبايض ذبابة الفاكهة الحية يمكن أن تكون ملطخة خارج الحي مع الميتوكوندريا الفلورسنتالبقع لتصور الميتوكوندريا، لتقييم أنواع الاكسجين التفاعلية الميتوكوندريا (ميتو-ROS) الإنتاج، وتقييم إمكانات الميتوكوندريا في وحدة الكتلة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق المشاركة في تلطيخ مع الميتوكوندريا الجهدية استر صبغ tetramethylrhodamine الإيثيلي (TMRE) وصمة عار الميتوكوندريا الحية متوافقة يمثلون كتلة الميتوكوندريا (انظر المواد الجدول لالأصباغ محددة).
- تمييع الأسهم من البقع في الحشرات الدافئة تشريح المتوسطة إلى تركيز العمل النهائية: وصمة عار الميتوكوندريا، 250 نانومتر. TMRE، 50 نانومتر. وميتو-ROS وصمة عار، 5 ميكرومتر.
- بعد تشريح وإغاظة المبايض التالية الخطوة 2، وضع المبيضين إلى 200 ميكرولتر من أي حل تلطيخ معين في بئر طبق تشريح. احتضان لهم لمدة 10 دقيقة مع الطبق مربع مناسبة ملفوفة بورق الألومنيوم لحمايتها من ضوء تغطيتها. غسل المبايض الملون عن طريق نقلها بعناية مع ملقط إلى 3 آبار متتالية containinز وسيط وبدون وصمة عار.
- للمشاركة في تلطيخ مع TMRE والمتوافقة مع وصمة عار الميتوكوندريا الشاملة، اتبع البروتوكول أعلاه وصمة عار لأول مرة مع TMRE وبعد ذلك على الفور مع وصمة عار الميتوكوندريا الإجمالية (من دون أي خطوات غسل بين).
- جبل المبايض على طبق القاع الزجاجي polyL يسين المغلفة التالية الخطوة 3 والاستعداد للفحص المجهري متحد البؤر مع المعلمات المسح المناسبة (الجدول 1)، بعد الخطوات 4،2-4،4.
ملاحظة: إن إشارة من الأصباغ أدرجت لم يدم عند محاولة تركيب عينات الملون في تصاعد المتوسطة. - ضع علامة في المربع-باجتزاء Z لفتح علامة التبويب. أدر عجلة التركيز نحو الجزء السفلي من العينة بينما يتم فحص الحية وانقر على "المجموعة الأولى" لتحديد bottommost القسم Z. تفعل الشيء نفسه أثناء تحريك عجلة التركيز نحو الاتجاه الآخر لتحديد العلوي القسم.
- أداء الحصول على الصور من خلال النقر على "بدء التجربة."
- قياس كثافة الفلورسنت لتصحيح الخلفية من رويس للإشارة الخلفية والخلايا الفردية (كما في الخطوة 4.7) ورسم البيانات باستخدام أي برنامج التآمر.
6. توليد Drp1 خالية الفسيفساء
ملاحظة: استراتيجية نسيلي المستخدمة هنا يدخل الخضراء بروتين فلوري (GFP)-سلبية Drp1 استنساخ فارغة في خلفية لذلك، ظاهريا الخلفية من النوع البري GFP إيجابية وهذا هو متخالف genotypically للطفرة فارغة Drp1 9. حرارة الصدمة التي يسببها flippase flippase الاعتراف الهدف (FLP-FRT) بوساطة مواقع محددة الإنقسامية إعادة التركيب يخلق استنساخ متماثل من الأليل drpKG03815 لاغيا وظيفيا. وراثى من ذبابة الفاكهة تحمل متحولة Drp1 هو drpKG03815 FRT40A / CYO، في حين أن النمط الجيني تحمل FLP الناجم عن صدمة للحرارة (hsFLP) وUbiGFP علامة نسيلي هو hsflp. NLS-GFP اليوبيكويتين (UbiGFP) FRT 40A / CYO. وراثى للحد ذاتهاذرية lected الصليب بين المورثات أعلاه هو hsFLP / +. drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.
- مزامنة ذبابة الفاكهة لجمع البكر عن طريق نقلها إلى قارورة جديدة من المواد الغذائية الطازجة كل 2 إلى 3 أيام. مراقبة قارورة pupariating يوميا من أجل جمع الإناث عذراء الناشئة.
- جمع ومجعد الجناح الإناث البكر حمراء العينين من النمط الجيني متحولة Drp1 كل يوم، مرة في الصباح ومرة في المساء، ووضعها في قارورة منفصلة. في موازاة ذلك، جمع الذكور ذبابة الفاكهة مع عيون حمراء داكنة والأجنحة المستقيمة تحمل hsflp وUbiGFP خلال 5 أيام من eclosion.
- إنشاء تقاطع طريق إضافة الذكور إلى الإناث البكر مع الإناث: نسبة الذكور من 2: 1.
- رش كمية صغيرة من خميرة حبيبات لتحفيز إنتاج البيض.
ملاحظة: بعناية تحريك ذبابة الفاكهة إلى قارورة جديدة من وسائل الاعلام كل 2-3 أيام إلى زيادة كمية ذرية وللحد من الازدحام قارورة. - لesthetize وفرزها، وجمع مباشرة الجناحين، أحمر العينين ذرية الإناث خلال 5 أيام من eclosion.
- لالصدمة الحرارية، وضع ذبابة الفاكهة التي تم جمعها في قارورة فارغة مع كمية صغيرة من خميرة حبيبات وصغيرة، لينة مسح (لامتصاص الرطوبة خلال الصدمة الحرارية). ضع قارورة مع ذبابة الفاكهة في حمام مائي عند 38 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، لتوليد الحيوانات المستنسخة خلية المسام في المقام الأول، وعلى 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مرتين في اليوم (السماح على الأقل 5 ساعات بين الصدمات 2 الحرارة) لمدة 2 أيام متتالية ، لتوليد كل من سلالة الجرثومية واستنساخ الخلايا المسام.
ملاحظة: تأكد من أن القارورة مغمورة تماما في المياه يصل إلى مستوى المكونات. - صدمة الحرارة قد تجعل متحرك ذبابة الفاكهة. السماح للذبابة الفاكهة للحرارة صدمت لاسترداد لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة عندما تصبح المحمول مرة أخرى.
- إضافة الذكور إلى الإناث بنفس النسبة كما في الصليب، ونقلها إلى قارورة جديدة مع جامعة المدينة العالميةرش م مع كمية صغيرة من خميرة حبيبات. الحفاظ على ذبابة الفاكهة لمدة 5 أيام على الأقل.
- تشريح المبيض عند الضرورة لإجراء تجربة حية أو الثابتة.
ملاحظة: المبايض معزولة عن الوالدين ذبابة الفاكهة معربا عن UbiGFP يجب أن تستخدم ضوابط السلبية لتأكيد تحريض كفاءة من الحيوانات المستنسخة GFP سلبية من قبل الصدمة الحرارية.
7. المشارك المناعية للالسيكلين E والميتوكوندريا
ملاحظة: للكشف عن ذبابة الفاكهة السيكلين E (dCyclinE)، وقد استخدمنا الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها تجاريا أثيرت على وجه التحديد ضد dCyclinE 9 (انظر المواد الجدول). كعلامة الميتوكوندريا، كنا الأجسام المضادة ضد ATP-B (وحدة فرعية من مجمع سينسيز ATP الميتوكوندريا) 9.
- دافئ 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) إلى درجة حرارة الغرفة 25 درجة مئوية. الحذر! امتصاص العرق هي سامة.
ملاحظة: بعد افتتاحوأمبولة، يجب أن يتم تخزين PFA في 4 درجات مئوية، وتستخدم خلال 7 أيام. وذلك لأن تخزين PFA قد تسمح أكسدة الميثانول، والتي من شأنها أن تغير بشكل كبير أغشية الميتوكوندريا أثناء التثبيت، حتى لو كان حاضرا في كميات ضئيلة. - مباشرة بعد تشريح، وتحديد المبيضين تشريح عن طريق وضعها في 200 ميكرولتر من PFA جديدة في بئر من صحن الزجاج تشريح (بدون إغاظة). الحفاظ على طبق في غطاء الدخان لمدة 15 دقيقة. غسل المبايض الثابتة عن طريق نقلها بعناية مع ملقط إلى 3 آبار متتالية، كل منها يحتوي على 200 ميكرولتر من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
ملاحظة: هذه التجربة يمكن أن تتوقف هنا والعينات يمكن أن تترك في 4 درجة مئوية لمدة 1 يوم. - ندف المبيضين أكثر شمولا في برنامج تلفزيوني (على غرار الخطوة 2.6) لإزالة بعناية الغمد الليفي الحماية التي قد تعيق وصول المستضد بواسطة الأجسام المضادة.
- Permeabilize المبايض مثار عن طريق وضعها في أنبوب microfuge مع 500 ميكرولتر من الطازجة المصنوعة 0.5٪ PBS-تريتون-X100 (PBS-TX)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في حين تعصف في 25 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: خلال هزاز، وضع أنابيب موازية لحركة هزاز. وضعها بشكل عمودي قد تسمح الأنسجة التمسك الغطاء من الأنابيب، مما أدى إلى فقدان الأنسجة. - لإزالة برنامج تلفزيوني-TX، ووضع أنابيب microfuge في رفوف للسماح للأنسجة لتستقر في الجزء السفلي من الأنابيب. تفتيشها بصريا والاستفادة من الأنابيب، إذا لزم الأمر، لتحقيق أي أنسجة العائمة إلى أسفل. نضح الحل بعناية من أعلى، والتأكد من أن الأنسجة في الجزء السفلي من الأنابيب لا تزال دون عائق.
- منع المبيضين وذلك بإضافة 200 ميكرولتر من 2٪ زلال المصل البقري (BSA) الذائب في 0.5٪ في برنامج تلفزيوني-TX، واحتضان على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. إزالة عامل عرقلة باتباع الخطوة 7.5.
- إضافة الأجسام المضادة الأولية في 200 ميليلتر من وكيل حجب العذبة: المضادة للأرنب dCyclinE الأجسام المضادة (1: 100)، ومكافحة فأر ATP-B الأجسام المضادة(1: 100). احتضان الأنسجة على الروك لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل البويضات مع برنامج تلفزيوني-TX 3 مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما، بعد خطوة 7.5.
- إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة في برنامج تلفزيوني جديد-TX: مكافحة فأر-CY3 (1: 1000) والمضادة للأرنب-CY5 (1: 500). احتضان على الروك لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل البويضات مع برنامج تلفزيوني-TX 3 مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما، بعد خطوة 7.5.
- وصمة عار على الحمض النووي، إضافة هويشت (1: 1000 تمييع) لغسل برنامج تلفزيوني-TX النهائي.
- وأخيرا، يترك الأنسجة في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1X.
- باستخدام micropipette 1 مل، وإزالة المبايض immunostained من microfuge أنبوب في بئر جديدة من وعاء زجاجي تشريح تحتوي على 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
- إضافة قطرة واحدة من المتوسطة المتزايدة على أساس الجلسرين لشريحة زجاجية وإضافة المبايض immunostained واحدا تلو الآخر إلى تصاعد المتوسط.
ملاحظة: تأكد من أن المبايض يتم نقل الواقع إلى تصاعد المتوسط. الفشل في القيام الصورةس سيؤدي إلى فقدان الأنسجة. - في حين يبحث من خلال مجهر التشريح، ونتف بلطف ovarioles شفافة (مراحل الأصغر سنا) من غرف بيضة ناضجة مبهمة باستخدام إبرة إغاظة حين الضغط على جزء معتم من المبيض مع ملقط. إزالة غرف بيضة ناضجة من تصاعد المتوسط.
- وضع ساترة (22 مم، رقم 1) على الشريحة واضغط برفق للتأكد من أن تصاعد المتوسط وتنتشر بشكل موحد تحت.
ملاحظة: الضغط على ساترة كما يضمن التوافق السليم للأنسجة على طول ساترة. الفشل في القيام بذلك على النحو الأمثل قد تسمح للمراحل أصغر لتطفو في المتوسطة المتزايدة، ومنع المجهر الأمثل لتلك الأنسجة. - الهواء تجفيف العينات لمدة 15 دقيقة وختم حواف ساترة بعناية مع طلاء الأظافر.
- أداء متحد البؤر المجهري وفقا للحاجة التجريبية (الجدول 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن استخدام الأساليب المذكورة لدراسة بنية الميتوكوندريا وظيفة في المبايض ذبابة الفاكهة الحية والثابتة (الشكل 2B). تقدم بعض الأمثلة على النتائج المتوقعة التي تم الحصول عليها مع الأساليب المذكورة.
تشريح المبيض ذبابة الفاكهة: عند تشريح أبعد من ذلك، يجب على البطن قطعت (الشكل 3B) من كامل ذبابة الفاكهة (الشكل 3A) الافراج عن محتويات البطن، بما في ذلك 2 المبايض من كل ذبابة الفاكهة الفردية. ويبدو أن المبايض سليمة كما بيضاوية الشكل، والهياكل البيضاء (الأسهم في الشكل 3C و D) التي ينبغي من الناحية المثالية لا تزال تعلق على بعضهم البعض من خلال ساق بوقي. ينبغي أن تعقد ovarioles في كل المبيض معا من الغمد الليفي (# في جزء المكبرة من الشكل 3C)، والتي يتم إزالتها بإغاظة متأنية ذ (السهم سميكة في الشكل 3D؛ * يدل على المبيض مثار بشدة مع ovarioles منفصلة) لفضح ovarioles لتلطيخ والفحص المجهري. ويمكن أيضا أن المبايض إصدارها مع سيقان بوقي مزقتها خلال الافراج عن محتويات البطن يمكن استخدامها، بشرط ألا معطوبة خلاف ذلك. أي المبايض التالفة (* في الشكل 3C) وغيرها من محتويات البطن (رأس السهم في الشكل 3C) ينبغي التخلص منها.
المجهري المباشر لالمبيض ذبابة الفاكهة: وهنا، علينا أن نبرهن تقنية نقف وتحميل الأصباغ الهيكلية والوظيفية الميتوكوندريا في المبايض ذبابة الفاكهة.
تقنية FLIP، تطبيق سابقا لتقييم استمرارية الميتوكوندريا في خلايا بصيلات ذبابة الفاكهة 9، وقد تجلى هنا في خلايا التمريض في المبيض من ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا الشكل (4A). فليب تستهدف واحدة من الغيوم الميتوكوندريا المرتبطة خلايا ممرضة يؤدي إلى فقدان أكثر من 50٪ من إشارة الفلورسنت من رويس زرقاء وبيضاء المحيطة العائد على الاستثمار نقف الأحمر في حدود 200 ق (الشكل 4B و C)؛ يتم استخدام إشارة من العائد على الاستثمار الأخضر لتصحيح الخلفية. تبقى إشارة الفلورسنت من العائد على الاستثمار الأصفر في الخلايا الممرضة غير مستهدفة أخرى ثابتة في هذا الإطار الزمني، مما يدل على تبييض العام الحد الأدنى خلال وقت التجربة (الشكل 4B، وC). أيضا، انظر الفيديو 1. تشير هذه النتيجة إلى أن الميتوكوندرياوتنصهر في ممرضة خلايا الأغشية الخارجي والداخلي، والمتمثل في الخطوات 3 و 4 (الشكل 4A)، في حين لا يتوقع أن تظهر أي خسارة في مضان في هذا الإطار الزمني الميتوكوندريا في الخطوات 1 و 2.
وقد ثبت سابقا أن تدبير نصف الكمية من إمكانات الميتوكوندريا لكل وحدة كتلة الميتوكوندريا يمكن تقييم من قبل زملاء تلطيخ مع الصبغة الجهدية TMRE وصمة عار الميتوكوندريا الشاملة التي تعكس كتلة الميتوكوندريا 13. هنا، تم استخدام نفس الأسلوب للتدليل على تقييم إمكانات الميتوكوندريا في وحدة الكتلة في أنسجة المبيض الحية ذبابة الفاكهة. المجهر متحد البؤر المبايض ذبابة الفاكهة حية ملطخة TMRE يدل على انخفاض في إشارة مع عمق الأنسجة (الشكل 5A). ومن المتوقع أن تحدث مع أي نوع من fluorop هذه الخسارة في إشارة الفلورية بسبب زيادة مبعثر في أعمق الأنسجةعاهرة مع مسافة عمل معين من الهدف في الاستخدام. ولذلك، من المهم أن نتبين عمق القصوى من الأنسجة يمكن من خلاله الكشف عن fluorophore أثناء التصوير الأنسجة الحية. على سبيل المثال، يعيش المبايض ذبابة الفاكهة ملطخة وصمة عار الميتوكوندريا الإجمالية (ميتو) ولا يمكن تصوير باستخدام الإعداد المجهر وصف (الجدول 1) ضمن مجموعة من 20 ميكرون من ساترة، في حين ينخفض الحد الأقصى لعمق imageable مع زيادة حجم غرفة البيض (الشكل 5B). إعدادات المجهر الأمثل للبقع الميتوكوندريا كشف اشارات ايجابية في القنوات الكشف الملائمة، في حين أن الإعدادات لفحص أي لا مبرر له إشارة عبر الكلام أو fluorophore عبر إثارة الكشف عن توقعات الحد الأدنى أو أي إشارة (الشكل 6A). شارك في تلطيخ TMRE مع وصمة عار الميتوكوندريا الشاملة يمكن أن تستخدم في كل من نوعي (الشكل 6B) والكمية (الشكل 6C وD </ قوي>) تقييم إمكانات الميتوكوندريا في وحدة الكتلة في المبايض ذبابة الفاكهة الحية. على سبيل المثال، أ) يوضح تحليل نوعي أن germarium ذبابة الفاكهة المعارض إمكانات الميتوكوندريا أعلى لكل وحدة كتلة في 2B المرحلة التي نشأت في خلايا بصيلات الجسدية لتغليف الخلايا الجرثومية (رؤساء السهم في الشكل 6B) وب) التحاليل شبه الكمية تثبت الفرق في إمكانات الميتوكوندريا في وحدة الكتلة بين (التمدد) AFCs وMBCS، وتحليلها من البيض غرفة مرحلة 9 (الشكل 6C). لاحظ أن القياس الكمي قد تم تنفيذ من 2 شرائح بصرية مختلفة لAFCs وMBCS، اعتمادا على طائرتهم من التركيز. ويتجلى استخدام مسبار ميتو-ROS التي استخدمت بنجاح في ذبابة الفاكهة 14 في طبقات الحية ذبابة الفاكهة المبيض الظهاري الخلايا المسام، حيث استنساخ فارغة الوظيفية للبروتين الانشطار الميتوكوندريا قدم Drp1were. معظم، بور لم يكن كلها، من Drp1 استنساخ خلايا بصيلات فارغة الحية GFP سلبية تظهر تلطيخ مرتفعة لميتو-ROS (7A الشكل وباء). لاحظ أنه على الرغم من إشارة الميتوكوندريا واضحة لا يمكن الكشف عنها في هذه الأنسجة، ويمكن أن يتم الكشف عن تركيز وصمة عار ميتو-ROS في المنطقة النووية في خلايا بصيلات بعد الإنقسامية المتقدمة، والتي هي أكبر بكثير من خلايا بصيلات الإنقسامية (* في الشكل 7C). قد يحدث هذا نتيجة لتفاعل الحامض النووي، والمنتج الأكسدة الفلورسنت من الصبغة ميتو-ROS، وهو مشتق من إيثيديوم 15.
الكشف عن الميتوكوندريا السيكلين E في ذبابة الفاكهة خلايا بصيلات المبيض ثابت: تم أظهرت مؤخرا أن الميتوكوندريا يمكن تنظيم جزيء دورة الخلية السيكلين E من خلال تجنيد إلى السطح الميتوكوندريا في خلايا الثدييات وطبقة ذبابة الفاكهة خلايا بصيلات
الصفحة = "1"> 
الشكل 1. تنمية البيض غرف ذبابة الفاكهة. الرسوم المتحركة يصور ovariole ذبابة الفاكهة التي تتكون من سلسلة من تطوير غرف البيض، ويتكون من بويضة وخلايا الممرضة (الخط الجرثومي) تغليف بواسطة طبقة الخلايا المسام (جسدية) لكل منهما. غرف بيضة تتطور من germarium وتتطور من خلال مراحل حيث تصبح خلايا بصيلات الإنقسامية بعد الإنقسامية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. خطة التجريبية والتحضير. (أ) الأدوات المستخدمة في الطرق ووصفت: أ يطير قارورة. B. الحشرات تشريح المتوسطة. جيم امتصاص العرق. فرشاة D. يطير. E. تشريح الطبق. الزجاج واو الغلاف. G. Microfuge أنبوب. طبق H. زجاج القاع. الشريحة أولا الزجاج. J. 1000 ميكرولتر micropipette. ك 200 ميكرولتر micropipette. L. 2.5 ميكرولتر micropipette. م إغاظة إبرة مع طرف عازمة (ويضاعف رأس)؛ ملقط N. سميكة. ملقط O. رقيقة. (ب) وتدفق الرسم البياني التخطيطي تمثل الأساليب المذكورة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تشريح ذبابة الفاكهة المبايض. ذبابة الفاكهة (A) تخدير كامل. (ب) قطعت ذبابة الفاكهة البطن مع أو بدون (*) محتويات البطن. (ج) صدر ذبابة الفاكهة محتويات البطن، بما في ذلك المبايض (الأسهم و*) ومحتويات أخرى(السهام). التكبير في المنطقة محاصر على حق تسليط الضوء الأمامي (النملة) والخلفي (بوست) ينتهي من زوج من المبايض التي عقدها ساق بوقي، الذي يحتجز فيه ovarioles من الغمد الليفي (#). (D) مثار ذبابة الفاكهة المبيض (السهم سميكة علامات بشكل مناسب مثار و* العلامات مثار بشدة) بالمقارنة مع المبيض unteased (السهم رقيقة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. لايف الأنسجة نقف الفحص. (A) تخطيطي يمثل خطوات الميتوكوندريا الانشطار / الانصهار، والتي يمكن أن يعاير من قبل فحص استمرارية الميتوكوندريا المناسب باستخدام طريقة FLIP. في هذه الحالة، تحقيقا ميتو-YFP في المصفوفة الميتوكوندريا يسمح للassessmوالأنف والحنجرة من استمرارية مصفوفة الميتوكوندريا. (ب) الوقت الفاصل بين خارج الجسم الحي المجهري لالمعدلة وراثيا غرفة البيض ذبابة الفاكهة الحية معربا عن ميتو-YFP. وتظهر نقاط فقط الوقت لتحديد (ر). انظر الفيديو 1 لجميع نقاط الوقت. يتم التعبير عن (C) الكميات من إشارة الفلورسنت من رويس الملون منها في الفقرة (ب) بعد تصحيح الخلفية والتطبيع. وتشير النصال النقاط الوقت photobleaching من تكرارية، في حين أن الفاصل الزمني بين حدثين تبيض متتالية هو الوقت الانتعاش. شريط الحجم: 10 ميكرون. تم الحصول على الصور مع المعلمات هو موضح في الجدول رقم 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. لايف الميتوكوندريال تلطيخ والميكروسكوب من ذبابة الفاكهة Ovariole. (A) شرائح ضوئية فردية لovariole ذبابة الفاكهة الحية ملطخة TMRE. تم الحصول على صورة مع المعلمات هو موضح في الجدول رقم 1. Z يدل على مسافة واحدة من ساترة في ميكرون. (ب) والحية ذبابة الفاكهة تحميل ovariole مع وصمة عار الميتوكوندريا الإجمالية (ميتو). يتم عرض الصورة XZ من الخط الأحمر في الصورة XY، حيث B هو الجزء السفلي و T هو الجزء العلوي من الصورة المكتسبة. المسافة من أسفل إلى الخط الأزرق هو 20 ميكرون. شريط الحجم: 20 ميكرون. تم الحصول على الصور مبائر مع المعلمات هو موضح في الجدول رقم 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Figure 6. شارك في تلطيخ الحية ذبابة الفاكهة Ovarioles مع TMRE والميتوكوندريا وصمة عار بوجه عام. (A) شريحة بصرية واحدة من ovariole ذبابة الفاكهة العيش المشترك ملطخة TMRE وصمة عار الميتوكوندريا الإجمالية (ميتو)؛ * يدل على وجود قطعة أثرية التجريبية الموضحة في قسم مناقشة. (ب) الإسقاط القصوى الشدة من 3 شرائح ضوئية متتالية من germarium في الفقرة (أ)؛ وتشير النصال المنطقة حيث يتم زيادة مضان TMRE. (C) شريحة بصرية واحدة في مرحلة ما بعد الإنقسامية غرفة البيض المشارك ملطخة TMRE وصمة عار الميتوكوندريا الشاملة. وتظهر لوحات العلوية والسفلية الطائرة للتركيز عليها AFCs وMBCS، على التوالي. (D) صندوق مؤامرة تظهر كثافة الفلورسنت يعني من TMRE وصمة عار الميتوكوندريا الشاملة كميا من AFCs الفردية وMBCS في المناطق محاصر في (C). شعيرات من مؤامرة مربع تشير إلى القيم القصوى والدنيا لكل مجموعة، باستثناء القيم المتطرفة.
الرقم 7. تلون لايف Drp1 خالية الفسيفساء ذبابة الفاكهة Ovarioles مع الصبغة ميتو-ROS. (A) شريحة بصرية واحدة من ovarioles ملطخة الصبغة ميتو-ROS. (ب) الإسقاط القصوى الكثافة من 2 شرائح ضوئية متتالية من غرفة البيض الفردية مع خلايا بصيلات في ميتومرحلة التشنج ملطخة الصبغة ميتو-ROS. (C) شريحة بصرية واحدة من الغرفة بيضة الفردية مع خلايا بصيلات في مرحلة ما بعد الإنقسامية ملطخة الصبغة ميتو-ROS، * يشير إلى وجود إشارة النووية. عدم وجود UbiGFP يصادف استنساخ فارغة Drp1. شريط الحجم: 20 ميكرون. تم الحصول على الصور مبائر مع المعلمات هو موضح في الجدول رقم 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 8. المشارك المناعية من ثابت Drp1 خالية الفسيفساء ذبابة الفاكهة Ovarioles مع dCyclinE والأجسام المضادة ATP-B. (A) الإسقاط القصوى الشدة من 3 شرائح ضوئية متتالية من germarium-immunostained المشترك. (ب) الإسقاط القصوى الشدة من 3 شرائح ضوئية متتالية من شارك في immunostained MBCS بعد الإنقسامية. الخطوط العريضة ترسيم UbiGFP سلبية Drp1 استنساخ فارغة. شريط الحجم: 10 ميكرون. تم الحصول على الصور مبائر مع المعلمات هو موضح في الجدول رقم 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 9. أمثلة من الأضرار المحتملة وقطع أثرية. (A) Germarium من UbiGFP، معربا عن ovariole الثابتة وملطخة صبغ الحمض النووي هويشت تبين الفجوات لا لزوم لها (*). (ب) غرفة البيض من UbiGFP، معربا عن ovariole الثابتة وملطخة صبغ الحمض النووي هويشت تبين النكات / الدموع (*). (C) يعيش ovariole مع Drp1 استنساخ فارغة UbiGFP سلبية ملطخة الصبغة ميتو-ROS تظهر غرفة المشوهة (*) وغرفة بيضة التالفة، مما يسمح جزئي تلطيخ من سلالة الجرثومية (**)؛ # يدل على وصمة عار ربما الحقيقية للغرفة البيض التالفة في نفس ovariole. (D) لايف ملطخة ovariole مع ميتو-ROS صبغ مبديا غرفة التالفة الشاملة مع تلطيخ مصطنعة مكثفة من سلالة الجرثومية. * يشير إلى الضرر الناجم عن بالارض ovarioles مع فقدان إشارة UbiGFP، مما أدى بالتالي إلى استنساخ GFP سلبية مصطنعة. شريط الحجم: 20 ميكرون. تم الحصول على الصور مبائر مع المعلمات هو موضح في الجدول رقم 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1. لايف الأنسجة نقف الفحص. وبالطبع الوقت الكامل لنقف فحص القائم على photobleaching من وصفها في الشكل (5).كوم / ملفات / ftp_upload / 54989 / Video1.avi "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
الجدول 1: إعدادات مجهر متحد البؤر لاكتساب من الصور التمثيلية قدم. الرجاء انقر هنا لعرض الجدول 1. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
photobleaching من: منع photobleaching من لا مبرر له من عينات الفلورسنت ضروري جدا لأداء كفاءة المجهر متحد البؤر. ولذلك، فإن الوقت المستخدم لتحديد العينات من خلال العدسة أو لتعيين المعلمات الحصول على الصور من خلال وضع المسح الحية يجب أن يكون الحد الأدنى لتقليل photobleaching من.
تلف الأنسجة: منذ تعتبر الميتوكوندريا أن تكون أجهزة الاستشعار الصحة الخلوية، فمن المهم للغاية للتأكد من أن البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام الأساليب المذكورة هي ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ولا تعكس الضرر لا مبرر له الناجمة عن تشريح الإجرائي المبيضين ذبابة الفاكهة. ينبغي إجراء تشريح في أسرع وقت ممكن، ولكن أيضا بحذر شديد إلى التقليل من تلف الأنسجة. متوسط الوقت للتشريح وإغاظة من 5 ذبابة الفاكهة المبيض هو من 5 إلى 7 دقائق (في يدناق). يجب أن تؤخذ جهد لتحديد الدوائر البيض تظهر الأنسجة التالفة التي سيتم استبعادها من التحليلات. ويمكن أن تشمل تلف الأنسجة نتيجة لتشريح الفجوات لا لزوم لها (* في الشكل 9A، على النحو المحدد بسبب عدم وجود إشارة)، النكات / الدموع (* في الشكل 9B، على النحو المحدد بسبب عدم وجود إشارة)، أو تشوه غرف البيض (* في الشكل 9C). ومع ذلك، فإن أي تشوه غرفة معنى الناجمة عن التلاعب التجريبية ينبغي تقييمها بعناية. على الرغم من أن يستخدم أي ساترة على أعلى من الأنسجة الحية في البروتوكول وصفها، تسطيح للovarioles قد تحدث مع ضغط غير مبرر تطبيقها على الأنسجة بينما إغاظة أو تركيب (* في الشكل 9D). لم يحترم تسطيح ovarioles مع عينات ثابتة، منذ بروتوكول صفها ينطوي على تحديد الأنسجة مباشرة بعد تشريح، مع إغاظة تحدث بعد ذلك. أي غرفة البيض معزولة دون أية توقيعات aforementioneويمكن اعتبار الضرر د ضعها الطبيعي. الأضرار الميكانيكية المحتملة الناتجة عن تشريح قد يؤدي أيضا إلى فقدان GFP، مما أسفر كاذبة GFP سلبية استنساخ 16، ويمكن أيضا أن تؤدي إلى تعزيز دمج صبغ. وبالنظر إلى أن الخلايا الجرثومية المقيمين داخل غرف البيض ليست قابلة للاختراق عادة إلى الأصباغ الميتوكوندريا الحية (أرقام 6 و 7)، وتعزيز تلطيخ الميتوكوندريا من الخلايا الجرثومية ذبابة الفاكهة قد تنجم عن زيادة في نفوذية التالفة / الأنسجة الموت. تحدث مثل هذه الحرفية مع الصبغة ميتو-ROS (** في الشكل 9C وovariole كله في الشكل 9D)، وكذلك مع البقع الميتوكوندريا الحية الأخرى (لا يظهر). فقدان UbiGFP في الشكل 9D (*) ويمكن أيضا أن تنتج عن الضرر الذي تسبب في تسطيح للغرف البيض. على الرغم من غرف بيضة أخرى في ovariole التالفة قد تبقى أصيلة والقطع الأثرية مجانا (# في الشكل 9C
حساسية الوقت: في حالة الحية المجهرية المجراة سابقا، ينبغي الحصول على البيانات في غضون 15 دقيقة من تصاعد الأنسجة. خلاف ذلك، فإن النتائج التجريبية قد تتأثر التعديلات علم وظائف الأعضاء وذلك بسبب وفاة التي تلت ذلك من الأنسجة. في بعض الأحيان، وهذا يتوقف على قوة الليزر والمعلمات المسح الضوئي الأخرى، و10 ميكرولتر من المتوسطة المتزايدة قد تتبخر عاجلا من 15 دقيقة. الكشف عن تجمع السيكلين E الميتوكوندريا عن طريق المشاركة في المناعية يتطلب تقليل الوقت تشريح (الأرجح بسبب طبيعة عابرة للmitochondالريال السيكلين E تجمع بالاحتفاظ بها نشطة التنفس الميتوكوندريا 12). كما لم يلاحظ حمام سباحة السيكلين E الميتوكوندريا ملموس مع أوقات permeabilization أقل من 30 دقيقة.
فليب: إن الحركة في أي غرفة البيض تخضع للفحص خلال الوقت نقف قد يؤدي إلى التحليلات مصطنعة وبالتالي يجب استبعادها. لا ينصح استخدام أي الأصباغ الميتوكوندريا حية أو TMRE في تجربة الآخر، منذ تأسيس صبغ الأجانب قد يغير استمرارية الميتوكوندريا، وبالتالي يؤدي إلى نتائج مصطنعة.
استراتيجية معبر ذبابة الفاكهة: إن متبادلة عبر لواحد هو موضح هنا (حيث يتم استخدام الذكور التي تحمل أليل متحولة Drp1) لا تسفر عن العديد من النسل، الأرجح بسبب تأثير مجهولين من Drp1 القمع في الآباء الذكور متخالف.
تفسير البيانات نسيلي: أي استنساخ-GF السلبي الكشف في المبيضين السيطرة معزولة عن ذبابة الفاكهة الوالدين معربا عن UbiGFP شأنها أن تشير إلى استنساخ سلبية كاذبة مصطنعة، من المحتمل ولدت نتيجة لفقدان GFP الناجمة عن تلف أثناء تشريح 16. ومع ذلك، يجب أن يكون عدد من الحيوانات المستنسخة GFP سلبية في ذرية للحرارة صدمت الصليب أعلى بكثير من أي استنساخ سلبية كاذبة ينظر في الضوابط. الحيوانات المستنسخة ولدت في طبقة الخلايا المسام ذبابة الفاكهة من خلال استراتيجية وصفه القائم على إعادة التركيب الإنقسامية يمكن أن تنشأ من خلايا بصيلات الجذعية الإنقسامية (وقف استنساخ الخلية) أو من غير الجذعية خلايا بصيلات الإنقسامية (استنساخ عابرة). لاستنساخ الخلايا الجذعية، وينبغي إجراء التحاليل التجريبية بعد 10 أيام فقط من الصدمة الحرارية، عندما تم بالفعل وضع غرف البيض مع الحيوانات المستنسخة عابرة. لاستنساخ عابرة، ينبغي إجراء التحاليل في غضون 6 أيام بعد الصدمة الحرارية، مع استنساخ خلايا بصيلات من ovarioles دون أي استنساخ خلايا بصيلات في germarium.
الصورة = "jove_content"> تعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
عند تقييم إمكانات الميتوكوندريا في وحدة الكتلة باستخدام الطريقة الموصوفة، على المرء أن يكون على بينة من التحف المحتملة الناشئة عن البصريات المجهر أو مجموعات صبغ الميتوكوندريا. أي منطقة تظهر إشارة ضعف من وصمة الميتوكوندريا الشاملة وإشارة TMRE مرتفعة نسبيا (الشكل 5A، *) قد تنشأ بسبب مضان نقل الطاقة الرنين (الحنق) بين الأصباغ 8 أو بسبب خصائص بصرية مختلفة من الأحمر (TMRE) والأخضر (صبغ الميتوكوندريا العام) مصابيح الفلورسنت، نظرا لحجم الثقب ثابتة في الإعداد الاستحواذ. القطع الأثرية ذات الصلة الحنق يمكن تجنبها عن طريق خفض تركيزات صبغ، إذا أمكن، في حين لا يمكن أن يؤديها التحليلات الكمية على توقعات من 2-3 شرائح ضوئية متتالية لتجنب القطع الأثرية البصرية. أيضا، إذا تم الكشف عن إشارة الفلورسنت في الحديث المتبادل وعبر الإثارةالقنوات، يجب أن عدلت إعدادات الليزر وكاشف للحد من إشارة في هذه القنوات، والتي من المتوقع للحد من إشارة الفلورسنت في القنوات المثلى كذلك.
قد يسبب الليزر التي يسببها التالفة من photobleaching من يتكرر تجزئة الميتوكوندريا، وبالتالي يسبب انقطاع الميتوكوندريا، منع نقف ناجحة. تجزئة يشتبه في الميتوكوندريا أثناء تنفيذ بروتوكول نقف يمكن تحديدها من خلال الحصول على صور ذات دقة أعلى مع انخفاض الثقب (وتعزيز مكاسب كاشف). إذا لاحظت تجزئة الميتوكوندريا واضح أثناء تنفيذ بروتوكول نقف، وقوة الليزر تبيض يجب تخفيض و / أو يجب زادت الفترة الزمنية الفاصلة بين التبييض متتالية. إذا كان هناك تبيض العام خلال وقت التجربة FLIP (إشارة من العائد على الاستثمار الأصفر في الشكل 3B و C)، لا بد من إعادة تعديل ليزر المسح إلى مستوىيسمح الحد الأدنى أو أي photobleaching من العام.
لتجنب القطع الأثرية المحتملة نتيجة لفقدان الناجم عن تلف GFP، ويمكن إدخال الحيوانات المستنسخة GFP إيجابية باستخدام استراتيجية MARCM، بعد وصفه بروتوكول الحرارة صدمة. هنا، وذبابة الفاكهة مناسبة لاستخدامها في الصليب هو البكر أنثى drpKG03815 FRT40A / CYO X الذكور Gal80 FRT 40A / CYO. حوض-GAL4، UAS-CD8GFP / TM6 9. وينبغي أن تستخدم ذرية الجناح الثابت لتوليد استنساخ باستخدام الصدمة الحرارية (كما هو موضح في الخطوة 6).
القيود المفروضة على تقنية
أ) في حين أن خلايا بصيلات المقيمين على سطح الحية غرف البيض ذبابة الفاكهة تتضمن الأصباغ تلطيخ الميتوكوندريا، تفشل الخلايا الجرثومية داخل غرفة البيض للقيام بذلك؛ سلالة الجرثومية للمراحل الأصغر سنا وصمة عار ضعيفة (الشكلان 5 و 6). ب) يعيش خارج الجسم الحي TISSUيجب إجراء البريد المجهر خلال 15 دقيقة من الانتهاء من تلطيخ على المبيض معزولة عن الفردية ذبابة الفاكهة، واحدة في وقت واحد. منذ المجموعات التجريبية يجب معالجتها وتصوير في نفس اليوم، وإجمالي الوقت المستغرق في الحصول البيانات ذات دلالة إحصائية من يعيش خارج الجسم الحي المجهري الأنسجة من المجموعات التجريبية المختلفة غير معقول أطول من تلك التي حصلنا عليها من الأنسجة الثابتة. C) لاحظنا أن وصمة عار ميتو-ROS لم تكن مستقرة جدا في خارج الجسم الحي الأنسجة ذبابة الفاكهة، على الأرجح بسبب طبيعة عابرة للROS تحليلها يكشف 17،15، والتي قد تكمن وراء عدم الكشف عن إشارة من جميع Drp1 استنساخ فارغة. ومع ذلك، أي أهمية بيولوجية للتغير في تلطيخ ميتو-ROS في خلايا فارغة Drp1 / الحيوانات المستنسخة لا يمكن استبعاد ويجب التحقيق أبعد من ذلك. لاحظ أن إشارة إيجابية من وصمة ميتو-ROS قد لا تعكس فقط تعزيز الفائق ولكن أيضا في الميتوكوندريا تعزيز أو cellulمؤكسد البيئة AR 15. D) وصمة عار الميتوكوندريا الشاملة لا يمكن أن تستخدم في التجارب نسيلي GFP سلبية أو GFP إيجابية، لأن الطيف الفلورسنت من هذا وصمة عار الميتوكوندريا وGFP لا يمكن تمييزها. E) التجربة نقف المصممة لفحص الاستمرارية مصفوفة الميتوكوندريا يتطلب الحصول على الصور مع الثقب المفتوح الذي يشمل قرار من الهياكل الميتوكوندريا.
أهمية تقنية مع الاحترام لالحالية / الطرق البديلة
دراسة العلاقة بين الهيكل وظيفة الميتوكوندريا أمر حاسم لفهم دقيق لآليات تنظيمية وظيفة الميتوكوندريا. بسبب عيوب الميتوكوندريا يسهم إلى حد كبير في العديد من الأمراض، مثل السكري، والسرطان، ومرض باركنسون، فهم مفصل لطريقة عمل الميتوكوندريا يبشر facilitatiنانوغرام تطوير استراتيجيات علاجية موجهة الميتوكوندريا. المجهر الخلية الحية أداة لا غنى عنها لدراسة العلاقة بين الهيكل وظيفة الميتوكوندريا. ومع ذلك، فقد اقتصرت معظم هذه الدراسات إلى خلايا معزولة. وقد تم تمديد دراسة هيكل الميتوكوندريا وظيفة للعيش الأنسجة ذبابة الفاكهة في الإعداد فيفو السابقين 9. وبروتوكول وصفها لهذا وما يتصل بها من دراسات يؤدي إلى فهم بنية الميتوكوندريا وظيفة في المبايض ذبابة الفاكهة حية، خارج الحي، مما يتيح فهم الميتوكوندريا في سياق الفسيولوجية. هذا النهج فيفو السابقين له مزايا هامة على الدراسات في المختبر، لأن تنظيم التمثيل الغذائي وخصائص حيوية من الميتوكوندريا في خلية معينة يعتمد إلى حد كبير على توافر المواد الغذائية والإشارات المناسبة في سياق الفسيولوجية للخلايا.
التلاعب الجيني للميلهيكل tochondrial من قمع الميتوكوندريا Drp1 البروتين الانشطار deregulates المغير دورة الخلية السيكلين E ويؤثر على تطور ذبابة الفاكهة جراب المبيض خلية طبقة 9،12. هنا، ويشمل البروتوكول وصفا لكيفية إدخال الحيوانات المستنسخة فارغة وظيفيا من Drp1 في المبيضين ذبابة الفاكهة لدراسة العلاقة بين الهيكل وظيفة الميتوكوندريا. تم الكشف عن تجمع الرواية من الميتوكوندريا السيكلين E في خلايا الثدييات، وكذلك طبقة ذبابة الفاكهة خلايا بصيلات 12، بنجاح، والتي من المرجح يكمن وراء تنظيم السيكلين E ذكرت الميتوكوندريا 18. هنا، مخطوطة توضح طريقة للكشف عن تجمع السيكلين E الميتوكوندريا جديدة من نوعها، شارك في المناعية الثابتة المبايض ذبابة الفاكهة لdCyclinE وعلامة الميتوكوندريا (ATP-B).
التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية
ر معينقبعة ذبابة الفاكهة هو نظام قوي نموذج الجيني، ومن المتوقع الأساليب المذكورة جهدنا لتساهم بشكل كبير في فهم الأساس الجيني من العلاقة بين الهيكل وظيفة الميتوكوندريا في الصحة والمرض. وقد استخدمت ذبابة الفاكهة على نطاق واسع من استبعاد التفاعلات الوراثية مما يؤدي إلى تكون الأورام 19. القدرة على توليد الحيوانات المستنسخة في طبقة الخلايا الظهارية بصيلات ذبابة الفاكهة تسمح للدراسة التفاعل من الميتوكوندريا والمسرطنة أو المكثفات ورم في استنساخ مكون للأورام الفردية في في الجسم الحي والإعداد خارج الحي. ويمكن استخدام الأساليب المذكورة لدراسة تنظيم العلاقة بين الهيكل وظيفة الميتوكوندريا على المبيض معزولة عن متحولة المناسب ذبابة الفاكهة. الأساليب المذكورة يمكن زيادة تمديد لدراسة تأثير مباشر من مختلف عامل المغذيات والنمو يدل على هيكل الميتوكوندريا وظيفة من خلال exogبالإضافة enous من المغذيات المناسبة و / أو عوامل النمو في فيفو السابقين التصوير المتوسطة. الأساليب المذكورة يمكن تعديلها بشكل مناسب ويعمل في الأنسجة ذبابة الفاكهة معزولة أخرى، مثل أقراص تخيلي اليرقات، التي استخدمت على نطاق واسع لدراسة مسارات نقل الإشارة في أمراض مثل السرطان 20،21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) | Life Technologies | m7514 | Reconstitute and Aliquot |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate | Sigma Aldrich | 87917-25MG | Reconstitute and Aliquot |
| MitoSox (Mito-Ros stain) | Life Technologies | m36008 | Reconstitute and Aliquot |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Conicals | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Vial Flugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Fly Conical Flugs | Fisher Scientific | AS 277 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-50G | |
| Cyclin E Antibody (d-300) | Santa Cruz | sc- 33748 | |
| ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker | AbCam | ab14730 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-175-144 | |
| Hoechst | Fisher Scientific | H3570 | |
| VectaShield | Fisher Scientific | H100 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Analyses software | Carl Zeiss | Zen | |
| Analyses software | Open source | Image J | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono | QImaging | QIC-F-M-12-C | |
| QCapture Pro 5.1 | QImaging |
References
- Nunnari, J., Suomalainen, A.
- Youle, R. J., van der Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
- Mitra, K. Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation. Bioessays. , (2013).
- Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions. Curr Opin Cell Biol. 23 (4), 427-434 (2011).
- Chen, H., Chan, D. C.
- Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 17 (4), 491-506 (2013).
- Hoppins, S.
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).
- Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. J Cell Biol. 197 (4), 487-497 (2012).
- Klusza, S., Deng, W. M. At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells. Bioessays. 33 (2), 124-134 (2011).
- Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
- Parker, D. J., et al. A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation. J Cell Sci. 128 (22), 4171-4182 (2015).
- Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).
- Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia. J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces "false clones" with apparent polarity phenotypes. Biol Open. 2 (12), 1313-1320 (2013).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila. Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).
- Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation. Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
