Abstract
Hoewel de aanwezigheid van circulerend celvrij DNA in plasma of serum is op grote schaal aangetoond dat een geschikte bron van biomarkers voor vele vormen van kanker zijn er weinig studies gericht op het mogelijke gebruik van urine celvrij (UCF) DNA. Uitgaande van de hypothese dat de normale apoptotische cellen sterk gefragmenteerd DNA en dat kankercellen vrijgave langer DNA, de mogelijke rol van DNA integriteit UCF beoordeeld als vroege diagnostische merker kan onderscheiden tussen patiënten met prostaatkanker of blaaskanker en gezonde individuen.
Een UCF DNA integriteit analyse is voorgesteld op basis van vier kwantitatieve real-time PCR van vier sequenties langer dan 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2 en AR. Sequenties die vaak een groter aantal DNA-kopieën in de blaas en prostaat kanker werden voor de analyse, maar de werkwijze is flexibel, en deze genen kunnen worden vervangen door andere genen van interest. De potentiële bruikbaarheid van UCF DNA als bron van biomarkers reeds aangetoond voor urologische maligniteiten, aldus de weg voor verdere studies UCF DNA typering bestrating. UCF DNA integriteit test het voordeel dat niet-invasief, snel en gemakkelijk uit te voeren met slechts een paar milliliter urine nodig de analyse worden uitgevoerd.
Introduction
Celvrij DNA in bloed en urine door celdood gedetecteerd door apoptotische of necrotische mechanismen. Celvrij DNA in bloed is uitgebreid bestudeerd voor diagnostische en prognostische doeleinden bij verschillende ziekten, met name kanker 1. Maar minder bekend is over de rol van urine-cel-vrij (UCF) DNA. UCF DNA kan afkomstig zijn van bloed dat door de glomerulaire filtratie systeem of uit cellen die direct in contact komen met de lichaamsvloeistof 2 (bijvoorbeeld urotheelcellen of prostaatcellen). Het gebruik van UCF DNA als bron van biomarkers is hoofdzakelijk onderzocht voor de vroege diagnose van nier, blaas en prostaat kanker door het hoge percentage UCF DNA rechtstreeks uit urinewegen cellen 3,4.
Weinig bekend over UCF DNA en de beste methoden voor het isoleren en karakteriseren van het. Aangezien de hypothese dat tumorcellen vrijkomen langer DNA-fragmenten dan normale cellen, de evaluatiecelvrij DNA integriteit is onderzocht in een poging om de oorsprong van DNA ophelderen in de bloedsomloop 5. Sommige studies hebben aangetoond dat celvrij DNA integriteit in bloed vormt een goede diagnostische test voor vele soorten kanker 6, en dezelfde hypothese is die met betrekking tot urine 7-9.
Dit artikel beschrijft een nieuwe werkwijze voor UCF DNA integriteit analyse met een mogelijke toepassing van de blaas en prostaat kanker detectie. Vooral de integriteit van UCF DNA fragmenten meer dan 250 bp werd getest in 4 regio's waarin een hoger aantal DNA-kopieën in vaste tumoren, zoals prostaat- en blaaskanker: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ) BCAS1 (20q13.2), en AR (Xq12) 10-14. Specifieke oncogenen, plaats willekeurige sequenties werden gekozen om de kans op het vinden van hen in het celvrije fractie van kankerpatiënten te verhogen. Een van de belangrijkste voordelen vandeze methode is dat het flexibel is en dat andere gebieden kunnen ook worden geselecteerd op basis van het type tumor en kenmerken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol volgt de richtlijnen van de IRST Human ethische commissie onderzoek.
LET OP: In dit protocol, geïsoleerde we DNA van urinemonsters naar een UCF DNA integriteit analyses uit te voeren. LNCaP en MRC cellijnen werden gebruikt om standaarden te construeren. Technieken zoals DNA-extractie DNA kwantificatie (spectrofotometer en real-time PCR voor de controle gen STOX1) en real-time PCR voor bepaalde oncogenen werden uitgevoerd (figuur 1).
1. Urine verwerven en verwerken
- Zorg voor een schone bijvangst eerste ochtend urine monster in een schone, droge, plastic beker. Vang minimaal 50 ml van het urinemonster.
- Handhaaf de urine bij 4 ° C gedurende maximaal 3 uur en het naar het laboratorium bij dezelfde temperatuur.
- Meng elk monster door het tweemaal inverteren onmiddellijk na aankomst in het laboratorium en overdracht in twee 50-mL-conische bodem polypropyleen buizen.
- Centrifugeer de buizenbij 850 xg gedurende 10 min bij 4 ° C of bij kamertemperatuur.
- Zorgvuldig overdracht 10 ml van het bovenste deel van de urine supernatant in twee 5-ml buizen, waarbij ten minste 2 ml van de bovenstaande vloeistof boven de celpellet.
OPMERKING: overbrengen het bovenste deel van het supernatant vermindert het gevaar voor besmetting met cellen of celresten. Er is geen duidelijke afbakening tussen de bovenste en onderste delen. - Gooi de pellet en het supernatant onmiddellijk bevriezen bij -80 ° C tot gebruik.
2. DNA-isolatie uit de urine supernatant en cellijnen
OPMERKING: Isoleer het DNA uit een cellijn (bijvoorbeeld LNCaP prostaatkanker of blaaskanker MRC) met een commerciële kit en de instructies van de fabrikant. Isolatie van DNA uit de urine supernatant moet worden uitgevoerd met de commerciële protocol als volgt gewijzigd:
- Dooi een portie van de supernatant urine bij kamertemperatuur. </ Li>
- Vortex en meng de urine monster en 1 ml van het supernatant urine in een duidelijke 5-mL buis. Bevries de residuele urine bij -80 ° C.
- Voeg 100 ul proteïnase k rechtstreeks aan het monster.
- Voeg 1 ml AL buffer aan het monster en goed mengen door pipetteren.
- Sluit de buis en incubeer de monsters bij 56 ° C gedurende 15 minuten.
- Tijdens incubatie bereiden één kolom voor elk monster en de voorbereiding van de wasbuffers, AW1 en AW2, volgens instructies van de fabrikant (voeg de opgegeven hoeveelheid 100% ethanol).
- Breng de monsters naar kamertemperatuur en voeg 1 ml absolute ethanol. Meng volledig door pipetteren.
- Voeg 650 ul van het mengsel verkregen in stap 2.7 op de kolom en centrifugeer bij 6000 xg deze gedurende 1 min.
- Gooi de buis met het doorstroomkanaal en plaats de kolom op een nieuwe, schone verzamelbuis. Herhaal de stappen 2,8 en 2,9 tot alle monster mengsel is gebruikt (5 maal).
- Voeg 500 &# 181, L buffer AW1 zonder bevochtiging de rand van de kolom. Centrifugeer bij 6000 xg gedurende 1 min.
- Gooi de buis met het doorstroomkanaal en vervangen door een nieuwe, schone verzamelbuis.
- Voeg 500 ul buffer AW2 zonder bevochtiging de rand van de kolom. Centrifugeer het op volle snelheid (20.000 x g) gedurende 3 min.
- Gooi de buis met het doorstroomkanaal en vervangen door een nieuwe, schone verzamelbuis.
- Herhaal stap 2.12 om eventuele resten wassen buffer te verwijderen.
- Plaats de kolom in een schone 1,5-mL buis. Voeg 50 ul elutiebuffer AE en wacht 7 minuten zodat de buffer bevochtigt de kolom.
- Centrifugeer bij 8000 xg gedurende 1 min.
- Pipetteer het eluens uit stap 2,15 in de mini-kolom en centrifugeer het op maximale snelheid gedurende 1 minuut tot de maximale herstel van DNA te waarborgen.
3. DNA Kwantificering en verdunning
- Met behulp van een spectrofotometer, voert de kwantificering van DNA uit both de cellijn en de urine supernatant monsters. Gebruik 2 pi monster op een bench-top spectrometer, volgens instructies van de fabrikant.
- Verdun de UCF DNA monsters worden tot een concentratie van 1 ng / ul verkrijgen en opslaan van de DNA bij -20 ° C totdat het DNA integriteit analyse.
Opmerking: Als de DNA hoeveelheid onvoldoende te gaan met real-time PCR (ten minste 100 ng) Voer een nieuw DNA isolatiewerkwijze. - Verdun het DNA van cellijn monsters met zes standaarden te verkrijgen met verschillende concentraties: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5 en 2 ng / ul, elk met een volume van 100 pl (ST1, ST2, ST3, ST4, ST5, en ST6). Bewaar de cellijn DNA standaarden bij -20 ° C totdat het DNA integriteit analyse.
4. DNA Integrity Test - PCR
- Ontdooi de primers (de concentratie afhankelijk van het type test), groene Supermix, cellijn DNA standaarden en UCF DNA verdunde monsters op ijs.
- Bereid strip buizen in de plaat fof de 72-well rotor disc. Aliquot 10 pi in duplo voor elke standaard en verdunde monster en 10 ul van RNase-vrij water voor de negatieve controle.
- Bereid een mengsel van 1 pi van elke primer (de concentraties aangegeven in tabel 1), 12,5 pl groene Supermix en 6,5 ui RNase-vrij water voor elk monster. Bij de voorbereiding van de mix, gebruikt u het volgende aantal monsters: 6-normen voor 2 herhalingen, aantal monsters voor 2 duplo, negatieve controle voor 2 herhalingen, en 2 extra monsters.
- Aliquot 15 pi van het mengsel in elk putje. Niet pipet of draai de buizen.
- Start het protocol met de in tabel 1 PCR-omstandigheden.
LET OP: Voor de UCF DNA waarde werden 29 DNA-monsters verwerkt voor elke real-time experiment met behulp van de 72-well rotor schijf: 29 x 2 monsters + 6 x 2 normen + negatieve controle x 2 = 72 (UCF DNA-waarde).
LET OP: Het protocol voor de UCF DNA integriteit analyse kan ookuitgevoerd met een andere PCR real-time instrument (bij gebruik van een ander apparaat, kan ROX kleurstof te worden toegevoegd).
5. DNA Integrity Test - Data-analyse en interpretatie
OPMERKING: De UCF DNA voor elk monster werd verkregen door een real-time-detectie instrument systeemsoftware met een standaard curve constructie voor elk individueel gen PCR evaluatie en onder gebruikmaking standaardkromme interpolatie, zoals eerder beschreven 7-9 (figuur 2).
- Evalueer de replica's; monster repliceert met een verschil ≥1 Ct moeten worden verwijderd en opnieuw geëvalueerd in een tweede experiment.
- Bereken de mediaan Ct voor elk monster en beschouwen monsters met een Ct-waarde ≤ 36.
- Evalueer de specificiteit van de PCR producten met behulp van smelt-analyse.
- Evalueer de concentratie van elke amplicon door interpolatie van de standaardcurve; het verkrijgen van een concentratie (ng / ul) voor elke amplicon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De totale vrije DNA-concentratie was meetbaar spectrofotometrisch voor alle geanalyseerde monsters, met een bereik tussen 1,51 en 138 ng / ul. Vijf controlemonsters werden gebruikt voor de reproduceerbaarheid van de gegevens: twee onafhankelijke realtime experimenten werden uitgevoerd voor c-MYC, HER2, BCAS1, AR en STOX1. De variatiecoëfficiënten (CV) werden vervolgens berekend voor elk gen (Tabel 2), met een goede reproduceerbaarheid tussen de twee onafhankelijke experimenten (Tabel 2).
Het 125-bp STOX1 sequentie werd geanalyseerd om de aanwezigheid van PCR-remmers te sluiten. Als de monsters vertoonden een versterking van STOX1, werd de UCF DNA integriteit uitgevoerde test. Een gebrek aan amplificatie betekende dat DNA hoeveelheid is niet voldoende om de UCF DNA integriteitstest, is het noodzakelijk dat t herhalenhij analyse met een nieuwe urine collectie. Aangezien er weinig informatie beschikbaar over de amplificatie of deletie van STOX1 blaas en prostaat kanker, kan dit gen worden gebruikt als een controlesequentie die deze tumortypen. Tenslotte werd het DNA UCF integriteit evaluatie door de waarden voor de drie oncogenen (figuur 3) te tellen.
Het gebruik van de som van c-MYC, HER2 en BCAS1 genen is voorgesteld voor blaaskanker detectie 9, terwijl c-MYC, AR en HER2, voor prostaatkanker 7,8 gesuggereerd. De beste cut-off-waarden vastgesteld voor blaas- en prostaatkanker detectie zijn 0,1 ng / ul en 0,04 ng / ul, respectievelijk. Met behulp van deze cut-off-waarden, een gevoeligheid van 73% en een specificiteit van 84% verkregen in het opsporen van blaaskanker versus symptomatische individuen, terwijl 58% gevoeligheid en 44% specifiekliteit werden waargenomen bij het opsporen van prostaatkanker versus patiënten met benigne urogenitale ziekten 7-9. Concluderend, de UCF DNA integriteit test is flexibel, zodat de bij de onderhavige studie genen konden worden vervangen door andere lange sequenties van belang, afhankelijk van de ziekte.
Figuur 1. Urine Cell-vrij DNA Integriteit Workflow en Timeline. De workflow van de methode is verdeeld in verschillende stappen en tijden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. rapport c-MYC Amplicon analyse. Een voorbeeld van het smelten analyse amplificatiecurveEn standaardcurve gegeven voor de c-MYC evalueren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. UCF DNA Integriteit Analyse Workflow. Een eenvoudige workflow voor de UCF DNA integriteit analyse wordt gerapporteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Gen | referentiesequentie | primer vooruit | primer achteruit | Amplicon Lengte (bp) | Real Time Protocol |
| MYC (c-MYC) (V-Myc Avian Myelocytomatosis Viral Oncogene homoloog locus 8q24.21) | NG_007161.1 | TGGAGTAGGG ACCGCATATC | CCCAACACCA CGTCCTAAC | 264 | 95 ° C gedurende 3 minuten gevolgd door 45 cycli bij 94 ° C gedurende 40 seconden, 56 ° C gedurende 40 seconden en 72 ° C gedurende 1 minuut. |
| ERBB2 (HER2) (Erb-B2 receptortyrosinekinase 2, locus 17q12.1) | NG_007503.1 | CCAGGGTGTT CCTCAGTTGT | TCAGTATGGC CTCACCCTTC | 295 | |
| BCAS1 (Mammacarcinoom Amplified Sequence 1, locus 20q13.2) | NC_000020 | GGGTCAGAGC TTCCTGTGAG | CGTTGTCCTG AAACAGAGCA | 266 | |
| AR (Androgene receptor, locus Xq12) | NG_009014.2 | AGCCCAGGTT CTCTCCTGAT | TGGCTAGTC CTCAGCTT | 265 | |
| STOX1 (Storkhead Box1, locus 10q21.3) | NG_012975.1 | GAAAACAGG GCAGCAAGAAG | CAGACAGCAT GGAGGTGAGA | 125 | 95 ° C gedurende 90 seconden gevolgd door 45 cycli bij 94 ° C gedurende 40 seconden en 54 ° C gedurende 1 minuut. |
Tabel 1. Primer Sequences en testomstandigheden.
| Monster | HER2 | CV (%) | BCAS1 | CV (%) | c -MYC | CV (%) | AR | CV (%) | STOX1 | CV (%) | |||||
| Repli-cate 1 * | Repli-cate 2 * | Repli-cate 1 * | Repli-cate 2 * | Repli-cate 1 * | Repli-cate 2 * | Repli-cate 1 * | Repli-cate 2 * | Repli-cate 1 * | Repli-cate 2 * | ||||||
| 1 | 0.0 | 0.0 | | 0.1 | 0.1 | 3.4 | 0.1 | 0.1 | 14.0 | 0.6 | 0.5 | 29.1 | 0.6 | 0. 8 | 4.5 | |
| 2 | 2.6 | 2.7 | 2.3 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.9 | 1.5 | 28.6 | 0.1 | 0.1 | 22.0 | 2.6 | 3.0 | 6.1 |
| 3 | 0.4 | 0.2 | 17.0 | 0.1 | 0.1 | 5.9 | 2.6 | 3.2 | 11.6 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.7 | 1.2 | 23.1 |
| 4 | 0.0 | 0.0 | NE | 1.1 | 1.0 | 3.0 | NE | 0.0 | NE | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | NE |
| 5 | 2.5 | 3.1 | 9.8 | 0.1 | 0.1 | 14.0 | NE | 0.0 | NE | 0.1 | 0.0 | 27.1 | 0.0 | 0.0 | NE |
Tabel 2. Real-time PCR reproduceerbaarheid voor elk gen.
* Resultaten vermeld als ng / ul
CV, variatiecoëfficiënt; NE, niet evalueerbaar
| Genen voor UCF DNA integriteit | Disgemak | Kankerpatiënten (n) | Controls (n) | Knip (ng / ul) | Gevoeligheid tarief (95% CI) | Specificiteit tarief (95% CI) | Referentie |
| MYC HER2 BCAS1 | Blaaskanker | 52 | 46 symptomatische individuen 32 gezonde individuen | 0.1 | 0,73 (0,61-0,85) | 0,83 (0,72-0,94) | Casadio V et al. 2013 9 |
| MYC HER2 BCAS1 | Prostaatkanker | 29 | 25 gezonde individuen | 0.04 | 0,79 (0,62-0,90) | 0,84 (0,65-0,94) | Casadio V et al. 2013 8 |
| c-MYC AR BCAS1 | Prostaatkanker | 67 | 64 patiënten met benigne aandoeningen van de urogenitale tractus | 0.04 | 0,58 (0,46-0,73) | 0,44 (0,30-0,58) | Salvi S et al. 2015 7 |
Tabel 3. Samenvatting van de verkregen resultaten voor de vroege diagnose van de prostaat en blaaskanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
UCF DNA integriteit analyse is een nieuwe, niet-invasieve werkwijze voor het bepalen van DNA integriteit in urine. Het werd onlangs voorgesteld voor de vroege diagnose van de blaas 9 en prostaatkanker 7,8. Een aantal van de voor- en nadelen van de UCF DNA betrouwbaarheidstoetsing komen hier aan bod, samen met toekomstperspectief.
Het belangrijkste voordeel van de benadering is dat het een goedkope, niet-invasieve werkwijze en een eenvoudig protocol om urine te onderzoeken als een mogelijke bron van biomarkers, waarvoor slechts een basiskennis van moleculaire biologische technieken. De test is snel uit te voeren, en de resultaten beschikbaar na 2 werkdagen (Fig. 1), kunnen gemakkelijk worden uitgelegd zonder de hulp van een arts. Bestaande uit slechts DNA isolatie processen en 2 real-time PCR's, de aanpak heeft ook een goede kosten-batenverhouding. In termen van nauwkeurigheid, UCF DNA integriteit heeft een hoge gevoeligheid (73%) en specificiteit (84%) in het opsporenblaaskanker bij symptomatische patiënten 9. Tenslotte de werkwijze is flexibel, en de beoogde genen kunnen gemakkelijk worden vervangen door andere genen van belang, zolang ze langer dan 250 bp.
De test heeft ook een aantal beperkingen. Ten eerste, de DNA spectrofotometrische kwantificatie methode is vaak onnauwkeurig en kan worden vervangen door andere, nauwkeuriger, fluorometrische benadering (bijvoorbeeld qubit of PicoGreen). De DNA-kwaliteit is ook vrij slecht, zoals blijkt uit de vaak lage 260/280 en 260/230 ratio's. Daarnaast is bij een van onze studies, zeer lage specificiteit (44%) werd waargenomen bij prostaatkankerpatiënten versus patiënten met benigne aandoeningen van het urogenitale kanaal 7, die waarschijnlijk een gevolg van goedaardige inflammatoire necrotische cellen vrijgeven meer intact DNA in de omloop. Dit is een cruciaal punt, omdat beide prostaatkanker patiënten en personen met een goedaardige aandoeningen een inflammatoire component in hun u kan hebbenrinary cellen. Aldus is binnen het kader van vroege diagnose van prostaatkanker, de resultaten van een UCF DNA integriteit analyse zou misleidend zijn.
UCF DNA integriteit werd geëvalueerd bij 314 urinemonsters uit patiënten met prostaatkanker of blaaskanker, gezonde en symptomatische individuen en patiënten met benigne aandoeningen van het urogenitale kanaal. Een prospectief onderzoek op grotere case series is nodig om de rol van deze benadering beter te definiëren als een vroege merker voor diagnostische urogenitale kankers.
Hoewel weinig wat betreft UCF DNA als bron van biomerkers voor kanker is gepubliceerd, wordt belangstelling voor dit gebied vergroten. Recentelijk Togneri et al. 4 een interessant paper waarin celvrije DNA geëxtraheerd uit urine supernatant van blaaskanker patiënten een hogere tumor genoom last dan cellulair DNA geïsoleerd uit de urine pellet, wat suggereert dat de studie van de cel-vrije fractieDNA in urine kan nuttig zijn om urologische kankers karakteriseren.
In onze ervaring heeft de UCF DNA betrouwbaarheidstoetsing niet blijken te zijn een goed begin van de diagnostische test voor prostaatkanker. Omgekeerd vertoonde potentieel als een marker voor de vroege opsporing van blaaskanker bij gebruik in combinatie met gebruikelijke urine cytologie. Een bevestigend onderzoek op een grotere prospectieve case series wordt momenteel gepland.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µL rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 mL tubes | |||
| incubator | |||
| -80 °C freezer | |||
| -20 °C freezer | |||
| 10 μL pipette | |||
| 20 μL pipette | |||
| 200 μL pipette | |||
| 1,000 μL pipette | |||
| pipette tips (10; 20; 200; 1,000) | |||
| 1.5 mL tubes | |||
| 50 mL tubes | |||
| 15 mL tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 mL) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10 mL) | Qiagen | 19133 |
References
- Francis, G., Stein, S. Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer. Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).
- Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential. Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).
- Szarvas, T., et al. Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment. Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).
- Togneri, F. S., et al. Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA. Eur.J.Hum.Genet. , (2016).
- Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research. Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).
- Hao, T. B., et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer. Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).
- Salvi, S., et al. Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients. Dis.Markers. 2015, 574120 (2015).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study. Biomed.Res.Int. 2013, 270457 (2013).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data. Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Ishkanian, A. S., et al. High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer. Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).
- Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer. J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).
- Nord, H., et al. Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma. Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).
- Tabach, Y., et al. Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer. PLoS One. 6 (1), e14632 (2011).
