Abstract
Även om närvaron av cirkulerande cellfria DNA i plasma eller serum har i stor utsträckning visat sig vara en lämplig källa för biomarkörer för många typer av cancer, har få studier fokuserat på den potentiella användningen av urin cellfri (UCF) DNA. Utgående från de hypoteser som normala apoptotiska celler producerar mycket fragmenterat DNA och att cancerceller släppa längre DNA, potentiella roll UCF DNA integritet utvärderades som en tidig diagnostisk markör kan särskilja mellan patienter med prostatacancer eller blåscancer och friska individer.
En UCF DNA integritet analys föreslås på grundval av fyra kvantitativa realtid PCR av fyra sekvenser längre än 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, och AR. Sekvenser som ofta har en ökad DNA-kopietal i urinblåsan och prostatacancer valdes för analysen, men metoden är flexibel, och dessa gener kan vara substituerade med andra gener av integreresten. Den potentiella nyttan av UCF DNA som en källa för biomarkörer har redan visats för urologiska maligniteter, vilket banar väg för fortsatta studier på UCF DNA karaktärisering. UCF DNA integritetstest har fördelen av att vara icke-invasiv, snabb och enkel att utföra, med endast ett fåtal milliliter urin behövs för att utföra analysen.
Introduction
Cellfria DNA kan detekteras i blod och urin beroende på celldöd genom apoptotiska eller nekrotiska mekanismer. Cellfria DNA i blodet har i stor utsträckning studerats för diagnostiska och prognostiska ändamål i olika sjukdomar, särskilt cancer 1. Men mindre är känt om den roll som urincellfria (UCF) DNA. UCF DNA kan härröra från blod som passerar genom glomerulär filtreringssystem eller från celler som kommer direkt i kontakt med denna kroppsvätska 2 (t.ex. urotelceller eller prostataceller). Användningen av UCF-DNA som en källa för biomarkörer har huvudsakligen undersökts för den tidiga diagnosen av njur-, urinblåsa och prostata cancer på grund av den höga andelen UCF-DNA som kommer direkt från urinvägsceller 3,4.
Lite är känt om UCF DNA och de bästa metoderna för att isolera och karakterisera det. Med tanke på den hypotesen att tumörcellerna släpper längre DNA-fragment än normala celler, utvärderingenav cellfria DNA-integritet har studerats i ett försök att klarlägga ursprunget för DNA i blodcirkulationen 5. Vissa studier har visat att cellfria DNA-integritet i blod utgör en bra diagnostiskt test för många typer av cancer 6, och samma hypotes har föreslagits i förhållande till urinen 7-9.
Detta dokument beskriver en ny metod för UCF DNA integritet analys med en potentiell ansökan till urinblåsan och upptäckt av prostatacancer. I synnerhet integritet UCF DNA-fragment längre än 250 bp testades i 4 regioner kända för att ha en ökad DNA kopietal i solida tumörer, inklusive prostata och cancer i urinblåsan: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2), och AR (Xq12) 10-14. Specifika onkogener, snarare än slumpmässiga sekvenser, valdes för att öka sannolikheten för att hitta dem i den cellfria fraktionen av cancerpatienter. En av de viktigaste fördelarna meddenna metod är att den är flexibel och att andra regioner kan också väljas på grundval av tumörtypen och egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet följer riktlinjerna i IRST mänskliga forskningsetikkommittén.
OBS: I detta protokoll, isolerade vi DNA från urinprover för att utföra en UCF DNA integritet analys. LNCaP och MRC cellinjer användes för att konstruera normer. Tekniker såsom DNA-extraktion, DNA kvantifiering (spektrofotometer och realtids-PCR för kontroll genen STOX1), och realtids-PCR för specifika onkogener utfördes (Figur 1).
1. Urin Insamling och behandling
- Skaffa en ren bifångst första morgonen urinprov i en ren, torr, plastkopp. Samla minst 50 ml av urinprovet.
- Bibehålla urinen vid 4 ° C under maximalt 3 timmar och skicka den till laboratoriet vid samma temperatur.
- Blanda varje prov genom att vända det två gånger omedelbart efter ankomsten i laboratoriet och överföring till två 50-ml koniska botten polypropylenrör.
- Centrifugera rörenvid 850 xg under 10 min vid 4 ° C eller vid rumstemperatur.
- Överför försiktigt 10 ml av den övre delen av urin supernatanten i två 5-ml rör, vilket lämnar åtminstone 2 ml av supernatanten ovanför cellpelleten.
OBS: Överföra den övre delen av den överstående vätskan minskar risken för kontaminering av celler eller cellrester. Det finns ingen tydlig avgränsning mellan de övre och nedre delarna. - Kassera pellet och omedelbart frysa supernatanten vid -80 ° C fram till användning.
2. DNA-isolering från urin Supernatant och cellinjer
OBS: Isolera DNA från en cellinje (t.ex. LNCaP för prostatacancer eller MRC för blåscancer) med användning av ett kommersiellt kit och enligt tillverkarens instruktioner. Isolering av DNA från urin vätskan ska utföras med hjälp av kommersiella protokoll, ändras enligt följande:
- Tina en alikvot av urin supernatanten vid rumstemperatur. </ Li>
- Vortex och blanda urinprovet och överföra en ml av urinen supernatanten i en klar 5-ml rör. Frys residualurin vid -80 ° C.
- Tillsätt 100 ni proteinas k direkt till provet.
- Tillsätt 1 ml av AL-buffert till provet och blanda väl genom att pipettera.
- Stänga rören och inkubera proverna vid 56 ° C under 15 min.
- Under inkubation, förbereda en kolumn för varje prov och förbereda tvättbuffertar, AW1 och AW2, enligt tillverkarens instruktioner (lägg den angivna mängden 100% etanol).
- Föra proverna tillbaka till rumstemperatur och tillsätt 1 ml absolut etanol. Blanda helt genom pipettering.
- Lägga 650 mikroliter av blandningen erhållen i steg 2,7 till kolonnen och centrifugera den vid 6000 xg under 1 min.
- Kassera röret med genomströmning och placera kolonnen på en ny, ren uppsamlingsrör. Upprepa steg 2,8 och 2,9 tills alla provblandningen har använts (5 gånger).
- Lägg 500 &# 181; L buffert AW1 utan att blöta ner kanten av kolonnen. Centrifugera det vid 6000 xg under 1 minut.
- Kasta röret med genomströmning och ersätta den med en ny, ren provröret.
- Tillsätt 500 | il av buffert AW2 utan att blöta ner kanten på kolonnen. Centrifugera det i full fart (20.000 xg) under 3 min.
- Kasta röret med genomströmning och ersätta den med en ny, ren provröret.
- Upprepa steg 2,12 för att avlägsna eventuell kvarvarande tvättbuffert.
- Placera kolonnen i en ren 1,5-ml rör. Tillsätt 50 pl elueringsbuffert AE och vänta 7 min för att säkerställa att buffert väter kolonnen.
- Centrifugera det vid 8000 xg i 1 min.
- Pipett eluenten från steg 2,15 till mini-kolonnen och centrifugera det vid maximal hastighet under en minut för att säkerställa maximal återhämtning av DNA.
3. DNA Kvantifiering och Utspädning
- Med hjälp av en spektrofotometer, utför kvantifiering av DNA från both cellinjen och urin supernatant prover. Använda 2 | il av provet på en bänk-topp-spektrometer, i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- Späd UCF DNA-prov för att erhålla en koncentration av 1 ng / mikroliter och lagra DNA vid -20 ° C tills DNA integritet analysen.
OBS: Om DNA mängd inte är tillräcklig för att fortsätta med realtids-PCR (åtminstone 100 ng), utföra en ny DNA-isoleringsprocess. - Späd DNA från cellinje prover för att erhålla sex standarder med olika koncentrationer: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5 och 2 ng / mikroliter, var och en med en volym på 100 mikroliter (st1, ST2, ST3, ST4, ST5, och ST6). Lagra Cellinjen DNA-standarder vid -20 ° C tills DNA integritet analysen.
4. DNA Integrity Test - PCR
- Tina primers (koncentrationen beror på vilken typ av analys), grön Supermix, cell-line DNA-standarder, och UCF DNA spädda prover på is.
- Förbered remsor rör i plattan feller skivan 72-brunnars rötor. Alikvot 10 mikroliter i duplikat för varje standard och utspätt prov och 10 | il av RNase-fritt vatten för den negativa kontrollen.
- Förbereda en blandning av 1 | il av varje primer (koncentrationerna anges i tabell 1), 12,5 mikroliter av grönt Supermix, och 6,5 | il av RNase-fritt vatten för varje prov. Vid framställning av blandningen, använd följande antal prover: 6 standarder för 2 replikat, antal prover för 2 replikat, negativ kontroll för 2 replikat, och 2 extra prover.
- Alikvotera 15 mikroliter av blandningen i varje brunn. Inte pipett eller snurra rören.
- Starta protokoll med de PCR-betingelser som anges i tabell 1.
OBS: För UCF DNA värdet var 29 DNA-prover behandlas för varje realtidsexperiment med hjälp av rotorskivan 72 brunnar: 29 x 2 prover + 6 x 2 standarder + negativ kontroll x 2 = 72 (UCF DNA värde).
OBS: Protokollet för integritet analys UCF DNA kan också varautförs med hjälp av en annan PCR realtidsinstrument (när du använder en annan enhet, kan ROX färgämne behöva läggas).
5. DNA Integrity Test - Dataanalys och tolkning
OBS: UCF-DNA-värdet för varje prov erhölls genom en realtidsinstrument-detektionssystemprogram med användning av en standardkurva konstruktion för varje individuell PCR-gen utvärdering och användning av standardkurvan interpolation, såsom tidigare beskrivits 7-9 (Figur 2).
- Utvärdera replikat; prov replikerar med en skillnad ≥1 Ct måste kasseras och omprövas i ett andra försök.
- Beräkna median Ct för varje prov och överväga prov med ett Ct-värde ≤ 36.
- Utvärdera specificiteten av PCR-produkter som använder smältanalys.
- Utvärdera koncentrationen av varje amplikon genom interpolation med standardkurvan; erhålla ett koncentrationsvärde (ng / l) för varje amplikon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den totala fria DNA-koncentrationen var kvantifierbart genom spektrofotometri för samtliga prover analyserats, som visar ett område av mellan 1,51 och 138 ng / | il. Fem kontrollprover användes för reproducerbarhet av data: två oberoende realtids experiment utfördes för c-MYC, HER2, BCAS1, AR, och STOX1. Variationskoefficienterna (CV) beräknades sedan för varje gen (tabell 2), med en god grad av reproducerbarhet mellan de två oberoende experiment (tabell 2).
Den 125-bp STOX1 sekvensen analyserades för att utesluta förekomst av PCR-inhibitorer. Om proverna visade en förstärkning av STOX1 ades UCF DNA integritetstest utförs. Brist på förstärkning innebar att DNA kvantiteten var inte tillräcklig för att utföra UCF DNA integritetstest, vilket tyder på att det är nödvändigt att upprepa tHan analys med en ny urinsamlingen. Som det finns lite information tillgänglig om amplifiering eller deletion av STOX1 i urinblåsan och prostatacancer, skulle denna gen kunna användas som en styrsekvens för dessa tumörtyper. Slutligen UCF DNA integritet utvärdering utförs genom att summera de värden som erhålls för de tre onkogener (Figur 3).
Användningen av summan av c-MYC, HER2, och BCAS1 gener har föreslagits för blåscancer detektering 9, medan c-MYC, AR, och HER2 har föreslagits för prostatacancer 7,8. De bästa cut-off-värden som fastställts för urinblåsan och upptäckt av prostatacancer är 0,1 ng / mikroliter och 0,04 ng / l, respektive. Med hjälp av dessa avstängningsvärden har en känslighet på 73% och en specificitet på 84% erhölls i att upptäcka cancer i urinblåsan jämfört med symptomatiska individer, medan 58% sensitivitet och 44% specifikten observerades för att upptäcka prostatacancer jämfört med patienter med godartade urogenitalsystemet sjukdomar 7-9. Sammanfattningsvis är UCF DNA integritetstest flexibel, så de gener som används i föreliggande studie kunde vara substituerade med andra långa sekvenser av intresse, beroende på den sjukdom.
Figur 1. Urin Cell-fritt DNA Integrity Workflow och tidslinje. Arbetsflödet av metoden är uppdelad i olika steg och tider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Rapport för c-MYC Amplicon analys. Ett exempel på smältanalys, amplifiering plotOch standardkurva rapporteras för c-MYC utvärdering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. UCF DNA Integrity Analysis Workflow. En enkel arbetsflöde för UCF DNA integritet analysen redovisas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Gen | referenssekvens | primer framåt | primer omvänd | Amplicon längd (bp) | Real Time Protocol |
| MYC (c-MYC) (V-Myc Avian Myelocytomatosis Viral Oncogene homolog, locus 8q24.21) | NG_007161.1 | TGGAGTAGGG ACCGCATATC | CCCAACACCA CGTCCTAAC | 264 | 95 ° C under 3 minuter, följt av 45 cykler vid 94 ° C under 40 sekunder, 56 ° C under 40 sekunder och 72 ° C under 1 minut. |
| ErbB2 (HER2) (Erb-B2 receptor tyrosinkinas 2, locus 17q12.1) | NG_007503.1 | CCAGGGTGTT CCTCAGTTGT | TCAGTATGGC CTCACCCTTC | 295 | |
| BCAS1 (Bröstkarcinom Amplified Sekvens 1, locus 20q13.2) | NC_000020 | GGGTCAGAGC TTCCTGTGAG | CGTTGTCCTG AAACAGAGCA | 266 | |
| AR (Androgenreceptorn, locus Xq12) | NG_009014.2 | AGCCCAGGTT CTCTCCTGAT | TGGCTAGTC CTCAGCTT | 265 | |
| STOX1 (Storkhead box1, locus 10q21.3) | NG_012975.1 | GAAAACAGG GCAGCAAGAAG | CAGACAGCAT GGAGGTGAGA | 125 | 95 ° C i 90 sekunder följt av 45 cykler vid 94 ° C under 40 sekunder och 54 ° C under 1 minut. |
Tabell 1. primersekvenser och testmetoder.
| Prov | HER2 | CV (%) | BCAS1 | CV (%) | c -MYC | CV (%) | AR | CV (%) | STOX1 | CV (%) | |||||
| Repli-kat 1 * | Repli-kat 2 * | Repli-kat 1 * | Repli-kat 2 * | Repli-kat 1 * | Repli-kat 2 * | Repli-kat 1 * | Repli-kat 2 * | Repli-kat 1 * | Repli-kat 2 * | ||||||
| 1 | 0,0 | 0,0 | | 0,1 | 0,1 | 3,4 | 0,1 | 0,1 | 14,0 | 0,6 | 0,5 | 29,1 | 0,6 | 0. 8 | 4,5 | |
| 2 | 2,6 | 2,7 | 2,3 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,9 | 1,5 | 28,6 | 0,1 | 0,1 | 22,0 | 2,6 | 3,0 | 6,1 |
| 3 | 0,4 | 0,2 | 17,0 | 0,1 | 0,1 | 5,9 | 2,6 | 3,2 | 11,6 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,7 | 1,2 | 23,1 |
| 4 | 0,0 | 0,0 | NE | 1,1 | 1,0 | 3,0 | NE | 0,0 | NE | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | NE |
| 5 | 2,5 | 3,1 | 9,8 | 0,1 | 0,1 | 14,0 | NE | 0,0 | NE | 0,1 | 0,0 | 27,1 | 0,0 | 0,0 | NE |
Tabell 2. Real-time PCR reproducerbarhet för varje gen.
* Rapporterade resultat som ng / mikroliter
CV, variationskoefficient; NE, inte kunde utvärderas
| Gener för UCF DNA integritet | dislätthet | Cancerpatienter (n) | Kontroller (n) | Avskurna (ng / l) | Känslighetsgrad (95% CI) | Specificitet (95% CI) | Referens |
| MYC HER2 BCAS1 | Blåscancer | 52 | 46 symptomatiska individer 32 friska individer | 0,1 | 0,73 (0,61-0,85) | 0,83 (0,72-0,94) | Casadio V et al. 2013 9 |
| MYC HER2 BCAS1 | Prostatacancer | 29 | 25 friska individer | 0,04 | 0,79 (0,62-0,90) | 0,84 (0,65-0,94) | Casadio V et al. 2013 8 |
| c-MYC AR BCAS1 | Prostatacancer | 67 | 64 patienter med godartade sjukdomar i det urogenitala området | 0,04 | 0,58 (0,46-0,73) | 0,44 (0,30-0,58) | Salvi S et al. 2015 7 |
Tabell 3. Sammanfattning av de resultat som uppnåtts för tidig diagnos av prostata- och blåscancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
UCF DNA integritet analys är en ny, icke-invasiv metod för att bedöma DNA integritet i urin. Det har nyligen föreslagits för tidig diagnos av urinblåsan 9 och prostatacancer 7,8. Ett antal fördelar och nackdelar med UCF DNA integritetstest diskuteras här, tillsammans med framtidsutsikter.
Den främsta fördelen med metoden är att det erbjuder ett billigt, icke-invasiv metod och ett enkelt protokoll för att studera urin som en potentiell källa till biomarkörer, som endast kräver en grundläggande kunskap om molekylärbiologiska tekniker. Testet går snabbt att utföra, och resultaten, som efter två arbetsdagar (Fig. 1), kan lätt tolkas utan hjälp av en läkare. Består av endast DNA isoleringsprocesser och 2 realtid PCR, har tillvägagångssättet också en bra kostnads-nyttoförhållande. När det gäller noggrannhet, har UCF DNA integritet hög känslighet (73%) och specificitet (84%) i att upptäckablåscancer i symtomatiska patienter 9. Slutligen är metoden flexibel, och de föreslagna generna kan enkelt substitueras med andra gener av intresse, så länge som de är längre än 250 bp.
Testet har också ett antal begränsningar. För det första är DNA spektrofotometriska kvantifieringen metod ofta otydliga och kan ersättas med andra, mer exakt, fluorometriska metoder (t.ex. kvantbit eller Picogreen). DNA-kvaliteten är också ganska dålig, vilket framgår av de ofta låga 260/280 och 260/230 nyckeltal. Dessutom i en av våra studier, var mycket låg specificitet (44%) observerades hos patienter med prostatacancer jämfört med patienter med godartade sjukdomar i det urogenitala området 7, som var förmodligen ett resultat av godartade inflammatoriska nekrotiska celler frigör mer intakt DNA i cirkulationen. Detta är en viktig fråga, eftersom båda prostatacancerpatienter och personer med godartade sjukdomar kan ha en inflammatorisk komponent i deras urinary celler. Således, inom ramen för tidig diagnos av prostatacancer, kan resultaten från en UCF DNA integritet analys vara vilseledande.
UCF DNA integritet utvärderades i 314 urinprover från patienter med prostatacancer eller blåscancer, friska och symptomatiska individer och patienter med godartade sjukdomar i det urogenitala området. En prospektiv studie på ett större fall serie behövs för att bättre definiera rollen för denna strategi som en tidig diagnostisk markör för urogenitalsystemet cancer.
Även lite har publicerats på temat UCF DNA som en källa av biomarkörer för cancer, är intresset för detta område ökar. Nyligen Togneri et al. 4 publicerat en intressant papper där cellfritt DNA extraherat från urin supernatanten av patienterna blåscancer uppvisade en högre tumör genomet börda än den hos cellulär DNA som isolerats från urinen pelleten, vilket tyder på att studien av den cellfria fraktionenav DNA i urin kan vara användbart för att karakterisera urologiska cancerformer.
I vår erfarenhet, gjorde UCF DNA integritetstest inte visa sig vara en bra början diagnostiskt test för prostatacancer. Omvänt visade potential som en markör för tidig upptäckt av cancer i urinblåsan när den används i kombination med konventionell urin cytologi. En bekräftande studie på en större prospektiv fall-serien planeras för närvarande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µL rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 mL tubes | |||
| incubator | |||
| -80 °C freezer | |||
| -20 °C freezer | |||
| 10 μL pipette | |||
| 20 μL pipette | |||
| 200 μL pipette | |||
| 1,000 μL pipette | |||
| pipette tips (10; 20; 200; 1,000) | |||
| 1.5 mL tubes | |||
| 50 mL tubes | |||
| 15 mL tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 mL) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10 mL) | Qiagen | 19133 |
References
- Francis, G., Stein, S. Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer. Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).
- Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential. Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).
- Szarvas, T., et al. Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment. Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).
- Togneri, F. S., et al. Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA. Eur.J.Hum.Genet. , (2016).
- Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research. Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).
- Hao, T. B., et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer. Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).
- Salvi, S., et al. Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients. Dis.Markers. 2015, 574120 (2015).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study. Biomed.Res.Int. 2013, 270457 (2013).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data. Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Ishkanian, A. S., et al. High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer. Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).
- Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer. J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).
- Nord, H., et al. Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma. Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).
- Tabach, Y., et al. Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer. PLoS One. 6 (1), e14632 (2011).
