Introduction
Het doel van deze methode is om een reproduceerbaar model voor ernstige stromingsgeïnduceerde pulmonale arteriële hypertensie in ratten maken en dat in beginsel hemodynamische en histopathologische eindpunten meten.
Pulmonale arteriële hypertensie (PAH) is een klinisch syndroom dat een geleidelijke verhoging van de pulmonale vasculaire weerstand leidt tot rechter ventrikel falen en dood omvat. Binnen het overkoepelende ziektespectrum van pulmonaire hypertensieve ziekten (PH), PAH is de ernstigste vorm en die zonder behandeling 1 blijft. De onderliggende arteriopathie in PAH wordt gekenmerkt door een typische vorm van vasculaire hermodellering dat het vatlumen afsluit. Muscularisatie van normale niet-gemusculariseerd schepen en hypertrofie van de mediale lagen vat worden beschouwd reeds ziekteverschijnselen in PAH ook gezien in andere vormen van PH 2 en 3 worden gedacht omkeerbaar zijn. Als PAH eendvances, de intima-laag begint te verbouwen, uiteindelijk de vorming van karakteristieke neointima laesies 2. Nieuwe intima-type vasculaire longremodellering is exclusief voor PAH en wordt momenteel beschouwd onomkeerbaar 4 te zijn.
Als PAH is een zeldzame ziekte, de vooruitgang in de pathobiological begrip en de ontwikkeling van nieuwe therapieën hebben zwaar op diermodellen ingeroepen. De monocrotalin (MCT) model in ratten een single hit model is, en nog steeds vaak gebruikt. MCT is een toxine dat de schade toebrengt aan de pulmonale arteriolen en regionale ontsteking 5. 60 mg / kg MCT leidt tot een verhoging van de gemiddelde pulmonale arteriële druk (mPAP), pulmonale vasculaire weerstand (PVR) en rechterventrikelhypertrofie (RVH) na 3-4 weken 6. De histomorphology wordt gekenmerkt door geïsoleerde mediale hypertrofie zonder neointima laesies 5. de MCTrattenmodel vormt derhalve een matige vorm van PH en niet PAK, hoewel het gewoonlijk wordt voorgesteld als de laatste.
Bij kinderen met PAH geassocieerd met congenitale links naar rechts shunt (PAH-CHD), verhoogde pulmonaire bloedstroom wordt beschouwd als de essentiële trigger voor de ontwikkeling van neointima laesies 7, 8, 9. Bij ratten kunnen verhoogde pulmonaire bloedstroom worden geïnduceerd door het creëren van een shunt tussen de abdominale aorta en vena cava, een techniek die het eerst beschreven in 1990 10. Alternatieven voor verhoogde pulmonale stroom te creëren zijn door eenzijdige pneumonectomie of subclavia naar longslagader anastomose 11. Conceptuele nadelen van deze modellen bestaan potentiële compenserende groei van de overgebleven long en adaptieve pathway activatie geïnduceerd door de pneumonectomie of iatrogene schade van de pulmonaire vasculatuur te wijtenom longslagader anastomose, zowel verstorende effecten van de toegenomen pulmonale bloedstroom.
Wanneer een aorto- cavale shunt gecreëerd en verhoogde pulmonale bloedstroom wordt geïnduceerd als tweede hit in MCT behandelde ratten, origineel neointima laesies ontstaan en een ernstige vorm van PAH en bijbehorende rechterkamer falen (RVF) ontwikkelen 3 weken na de toegenomen stromen 12. De hemodynamische progressie van PAK's in dit model kan in vivo worden beoordeeld door echocardiografie en rechter hartkatheterisatie. Het vasculaire histomorphology, wanddikte van het drukvat, de mate van arteriolaire occlusie, en parameters voor de rechter ventrikel falen vormen de pijlers van het ex vivo karakterisering van PAH.
Deze methode beschrijft gedetailleerde protocollen voor de aorto-cavale shunt (AC-shunt) chirurgie, rechts hartkatheterisatie, en de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van vasculaire histomorphology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Nederlandse Centrale Commissie Dierproeven en de Animal Care Comite op Universitair Medisch Centrum Groningen (NL). Zowel Wistar en Lewis ratten met gewichten tussen 180 en 300 g werden gebruikt.
1. Huisvesting en acclimatisatie
- Na aankomst bij de centrale dier faciliteit, huis ratten in groepen van 5 per kooi. Gedurende een 7-dagen acclimatisatie periode wennen de ratten humane behandeling, maar geen experimentele procedures uitvoeren.
2. Voorbereiding en Injectie van Steriele Monocrotalin
- Voor 1 ml 60 mg / ml monocrotalin (MCT) oplossing Weeg 60 mg monocrotalin in een 2 ml buis. Voeg 700 ul van 0,9% NaCl. Voeg 200 ul van 1 M HCl. Verwarm de oplossing in de buis onder warm stromend leidingwater en vortex het. Met 6 N NaOH om de pH aan 7,0 te brengen. Gebruik steriele techniek voor bereiding van MCT voor injectie in knaagdieren. Injecteer 1 ml steriele 60 mg / ml MCT oplossing per kg subcutaan in de nek (0,3 ml 60 mg / ml MCT voor een 300-g rat). OPMERKING: We liever geen kleinere hoeveelheden gebruiken vanwege de grotere kans dat de geïnjecteerde dosis geschikt zal zijn.
3. Aorta-caval Shunt Surgery
- Anesthesie.
- Vul de inductie kamer met 5% isofluraan / 100% O 2 (stroomsnelheid: 1 L / min) en plaats de rat in de kamer. Controleer of er voldoende diepte van de anesthesie door het uitvoeren van een hinde teen knijpen. Weeg de rat.
- Scheren en de buik schoonmaken over een gebied dat ongeveer 8 cm lang en 3 cm breed. Plaats de rat op zijn rug op een warmte-mat (37 ° C) bedekt door een steriele mat.
- Plaats de snuit in een beademingsmasker / kap met 2-3% isofluraan / 100% O 2 (stroomsnelheid: 1 L / min). Controleer de diepte van de anesthesie door het uitvoeren van een hinde teen knijpen. Toepassen oogzalf tot droog voorkomen terwijl onder verdoving.
- shunt Surgery.
- Scrub de huid met chloride-hexidine voor desinfectie. Injecteren 0,01 mg / kg buprenorfine subcutaan voor postoperatieve analgesie.
- Gebruik steriele instrumenten voor een operatie. Een insnijding met een # 10 scalpel in de buik op de middellijn vanaf 1 cm onder het diafragma een beneden uitstrekt tot net boven de genitaliën.
- Til de darm met een wattenstaafje, bedek de ingewanden in een steriele natte gaas (0,9% NaCl), en plaats ze op de linkerzijde van het dier.
- Wattenstaafjes de membranen die de abdominale aorta en vena cava inferior van de omliggende weefsels hechten scheiden.
LET OP: niet de membranen tussen de aorta en de vena cava ontleden. - Gebruik splinter forceps, verwijder de perivasculaire aorta vet net boven de bifurcatie, alleen aan de rechterzijde van de aorta en alleen op de plaats waar de naald wordt ingebracht.
- Gebruik wattenstaafjes om de aorta en vena cava te scheiden van 2 mm supeot de plaats waar de naald om ruimte te scheppen voor een Biemer klem wordt geplaatst.
- Op dit gebied, in de eerste plaats een losse ligatuur (5-0 hechtdraad) rond de aorta. Maak spanning op de ligatuur door het plaatsen van een Kocher klem op, en plaats de Kocher superieur aan de incisie (Figuur 1A). Plaats de Biemer klem gewoon superieur aan de ligatuur (Figur e 1A).
- Met een wattenstaafje, comprimeren vena cava zo distaal mogelijk de flux (figuur 1A) belemmeren. Bocht een naald (18 G in dit protocol) in een hoek van 45 graden, met de opening naar buiten wijzen (figuur 1A).
- Onder een hoek van 90 graden, de naald in de aorta, net boven de bifurcatie, met de opening van de naald naar links (figuur 1A). Manipuleren van de punt van de naald naar links en steek deze in de vena cava.
LET OP: De naaldtip moet nu visible in de vena cava (figuur 1B). - Gebruik een tweede wattenstaafje om de resterende bloed in de aorta duwen van de insertieplaats trombose te voorkomen. Droog het gebied rond de shunt met een steriel gaas zodat de lijm voldoende blijven.
- Trek de gehele naald uit de aorta en onmiddellijk een druppel weefsel lijm op de prikplaats in de aorta. Zorg ervoor dat de wattenstaafje niet te lijmen aan het weefsel. Ontspanschakelaars de aorta.
- handmatig controleren de shunt door te trekken aan en loslaten van de ligatuur van de aorta proximaal van de shunt. Versoepeling moet de vena cava distale kleur aan de shunt in fel rood en creëren turbulentie op de shunt website.
LET OP: Aanscherping zal het bloed terug naar donkerrood draaien in de vena cava. - Plaats de darmen opnieuw in het dier. Sluit de spierlaag en huid met resorbeerbare 4-0 hechtingen. Ventileren het dier met 100% O 2 om te herstellen van de anesthesie.
NB: Gebruik geen ani geen reactiemal onbeheerd totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven.
- Sham Surgery.
- Voer alle bovenstaande procedures behalve voor het inbrengen van de naald in de aorta.
- Post-operatieve zorg.
- Plaats de rat in een kooi en in een incubator bij 37 ° C tot de volgende ochtend.
- Ongeveer 6 uur na de operatie, injecteren 0,01 mg / kg subcutaan buprenorfine voor postoperatieve analgesie. Herhaal de volgende ochtend als ratten tekenen van ongemak.
OPMERKING: De eerste 3 dagen na de operatie, ratten neiging om te eten en drinken minder (dit is vooral belangrijk wanneer voer of drinkwater worden gemengd met medicijnen). De meeste ratten normaal gedrag 3 dagen na de operatie. Zo niet, op de voet volgen. Gewichtsverlies van meer dan 15% in 1 week als abnormaal beschouwd en deze ratten worden gedood door de extractie van het circulerende bloedvolume terwijl onder verdoving.
LET OP: In dit protocol, het dier wordt gedood door de extractie van het circulerend bloedvolume, terwijl onder verdoving.
- Sacrifice 1 dag na de operatie (MF8) voor het begin van de cellulaire en functionele reacties op verhoogde pulmonale bloedstroom (bijvoorbeeld gen up-regulering of begin transcriptiefactoren).
- Sacrifice 1 week na de operatie (MF14) voor een vroeg stadium van PAH vasculaire fenotype (mediale hypertrofie zonder neointima laesies).
- Sacrifice 2 weken na de operatie (MF21) voor een gevorderd stadium PAH vasculaire fenotype (gemarkeerd mediale hypertrofie en de vorming van nieuwe intima) met een lichte verhoging van de RVP en mPAP.
- Offeren 3 weken na de operatie (MF28) voor een eindstadium PAH vasculaire fenotype (aangeduid neointima occlusie) en sterke verhoging van RVP en mPAP. Klinische symptomen van rechter ventrikel falen zijn gebruikelijk in dit stadium.
- Sacrifice na dag 28 (MF-RVF) Voor PAH geassocieerd rechter ventrikel falen (RVF), klinisch gedefinieerd als kortademigheid, ernstige lethargie, en gewichtsverlies (<10% in 1 week). Beëindig ratten wanneer een van deze tekenen aanwezig is. Vaak ratten ontwikkelen deze symptomen tussen dag 28 en 35 en, indien onbewaakt, matrijs spontaan gedurende deze periode.
5. Recht hartkatheterisatie
- Anesthesie.
- Vul de inductie kamer met 5% isofluraan / 100% O 2 (stroomsnelheid: 1 L / min) en plaats de rat in het vak. Controleer of er voldoende diepte van de anesthesie door het uitvoeren van een hinde teen knijpen. Weeg de rat.
- Scheren en reinigen van de hals aan de rechterkant ventrale zijde van de rat en voor de echocardiografie protocol, de thorax en bovenbuik.
- Plaats de rat op zijn rug op een verwarmingsmat (37 ° C) en plaats de snuit in een beademingsmasker / kap met 2-3% isofluraan / 100% O 2 (stroomsnelheid: 1 L / min). De snuit moet maken aan de onderzoeker.
- Echocardiografie protocol.
- Voer de echocardiografie volgens de werkwijze beschreven door Brittain et al protocol. in Jupiter 13.
- Catheterisatie protocol.
LET OP: Dit protocol maakt gebruik van een stijve canule met een voorgevormde tip gebogen 20 graden ten opzichte van de 15-cm silicium katheter te begeleiden met een bal 2 mm van de tip. Een 20-G naald met de opening licht gebogen naar binnen wordt gebruikt om de canule in de rechter halsader te voegen (zie de lijst van materialen). Ratten in elke fase van PAH progressie controle kan worden gebruikt in dit protocol.- Ontsmet de hals met chloride-hexidine. Voeg een 1,5 cm incisie met een # 10 scalpel in de rechter ventrale zijdevan de hals, van rechts sleutelbeen aan de onderkaak bot.
- Verspreid het weefsel met een schaar. Met behulp van een pincet, trek het weefsel uit elkaar totdat de halsader verschijnt. Ontleden de membranen rond de halsader gebruikt splinter forceps.
- Zet spanning op de halsader door het plaatsen van een losse ligatuur (5-0 hechtdraad) rond het vat. Verhoog de spanning en plak de ligatuur op de beademingsmasker (Figuur 2A).
- Stroomafwaarts van de insertieplaats, plaats een losse ligatuur rond het schip te draaien na de canule in situ om lekken en drukverlies te voorkomen.
- Via de handvatten van een forceps, licht buigen het uiteinde van een 20-G naald met de opening naar binnen de canule te voeren met de katheter.
- Voeren de punt van de 20-G naald in de ader wordt snel de canule met de katheter in het vat. Trek de naald, en sluit de ligatuurdat werd bereid in stap 5.3.4.
- Het gedrag van de canule met de katheter in de halsader. De punt van de canule bij een 20 graden curve (zie stap 5.3.5). Manoeuvre de canule onder het sleutelbeen en vooraf een beetje naar rechts atrium (figuur 2C) in te voeren.
- Rechts ventrikel invoeren, richt de punt van de canule naar links, naar het hart (Figuur 2D). Op het nachtkastje monitor moet een camper druk curve lijken, bijpassende figuur 2D.
- Wanneer de RV druk curve constant is, noteer dan de systolische en diastolische rechter ventrikel druk 1 (sRVP1 / dRVP1).
- Manipuleren van de punt van de canule naar links en naar boven. Schuif de katheter in de canule (figuur 2E).
- Schuif de katheter in de belangrijkste longslagader (PA). Geen weerstand moeten worden gevoeld bij het passeren van de pulmonale klep.
OPMERKING: Wanneer de katheter komt in de belangrijkste longslagader, de diastolic druk zal stijgen. Op het nachtkastje monitor moet een PA druk curve lijken, bijpassende figuur 2E. - Wanneer de PA druk curve constant is, noteert u de systolische, diastolische en gemiddelde PA druk 1 (sPAP1, dPAP1, mPAP1).
- Verdere vooraf de katheter binnen de canule totdat de bal aan het uiteinde van de katheter komt te zitten in een longslagader. Let op de druk curve op het nachtkastje beeldscherm vallen en overeenkomen met de wedge druk curve in figuur 2F.
- Wanneer de wiggedruk curve constant is, noteert u de systolische, diastolische en gemiddelde wiggedruk.
- Trek de katheter langzaam en vervolgens te meten en noteer de waarden voor sPAP2, dPAP2, mPAP2, sRVP2 en dRVP2, zoals weergegeven op het nachtkastje monitor.
- Toen in de camper, iets terug te trekken de canule en de katheter voor het meten van de gemiddelde rechter atrium druk (RAP). De curve moet overeenkomen met de RAP kromme in figuur 2A.
NEETE: In dit protocol, de ratten worden gedood na de catheterisatie protocol door de extractie van het circulerend bloedvolume, terwijl onder verdoving.
6. morfologie Assessment en Morphometry
LET OP: In dit protocol, het dier wordt gedood door de extractie van het circulerend bloedvolume, terwijl onder verdoving. Ratten in elke fase van PAH progressie controle kan worden gebruikt in dit protocol.
- Na het offer, nemen de longen door het snijden van de luchtpijp ongeveer 5 mm boven de bronchiale vertakking en de vaten, die de longen verbinden met het hart. Doe de longen in koude zoutoplossing. Ontleden de linkerlong. Snijd de linker hoofdbronchus bij de splitsing.
- Vul een 50 ml spuit met 4% paraformaldehyde, bevestig een buis met een canule op de injectiespuit, en hangen de spuit ongeveer een meter boven de werktafel. Plaats de canule in de linker hoofdbronchus aan de longen met paraformaldehyde passief te vullen.Behandel paraformaldehyde met de nodige voorzichtigheid.
- Incubeer de linkerlong in paraformaldehyde gedurende 48 uur.
- Uitdrogen de linkerlong van achtereenvolgens incuberen in 70% ethanol (1 uur), 80% ethanol (1 uur), 90% ethanol (1 h), 100% ethanol (3 h), xyleen (2 h), en paraffine ( 2 h).
- Insluiten linkerlong in paraffine, de hilus van de long tegenover de cassette.
- Vlekken de paraffine ingebedde, 4-um longcoupes met een Verhoeff of Elastica-van Gieson kleuring, volgens instructies van de fabrikant 29. Controleer de elastische laminae goed gedifferentieerd (zoals in figuur 3). Scan de gekleurde coupes bij een vergroting van 40x.
- Verdeel de long in 4 kwadranten. In elk kwadrant, vindt 10 schepen met een buitendiameter van <50 micrometer (intra-acinaire) en 10 schepen met een buitendiameter> 50 pm (pre-acinaire). Maak een foto (2 x 40 beelden per long). Zoom in willekeurig tot 20x vergroting en foto elk schipin dit gezichtsveld selectievertekening minimaliseren.
- Uitsluiten schepen die een verhouding langste / kortste diameter van> 2, een onvolledige ronde vorm, of een val van meer dan een kwart van de vaatwand hebben.
Opmerking: Een voorbeeld van een uitgesloten vaartuig is weergegeven in figuur 3b elk beeld op dezelfde vergroting (40X) Voeg en omvatten een schaalbalk. - Open ImageJ en de eerste foto. Trek een rechte lijn op de schaal bar in de afbeelding om de schaal te stellen via "Analyse" en "Set schaal." Voor de "bekende afstand", gebruik dan de waarde op de foto's schaal bar. Gebruik micrometer (pm) als de lengte-eenheid. Zet de schaal aan de mondiale.
- Met behulp van "de vrije hand selecties," trek een lijn op de binnenkant van het luminale gebied (figuur 3), en gebruik "maat" (Crtl m) naar dit gebied te meten. Dan trek een lijn rond de buitenste elastic plaat (figuur 3) van het totale schip oppervlaktemaat.
- Bereken de luminale en buitendiameter (
) gebruik makend van 
. - Bepalen wanddikte met
. - Bereken de muur / lumen verhouding met behulp
. - Bereken de occlusie Score met
. - Score het vaartuig muscularisatie (nee, gedeeltelijke of totale muscularisatie) (Figuur 3B).
LET OP: Schepen met een dubbele elastische lamina voor meer dan de helft van de omtrek worden gedefinieerd als geheel gemusculariseerde. Schepen met een dubbele elastische lamina minder dan de helft van de omtrek worden gedefinieerd als gedeeltelijk gemusculariseerde. - Score het vaartuig op de aanwezigheid van een Neointima (ja of nee) (Figuur 3C).
LET OP: Schepen zonder duidelijk omschreven interne elastische lamina in combinatie met (vaak excentrieke) luminale occlusie worden gedefinieerd als neointima laesies.
) gebruik makend van 
. 
. 
. 
. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 4. De gepresenteerde resultaten tonen kenmerken van MCT + FLOW in Lewis ratten in de volgende groepen: Controle (n = 3), MF8 (n = 5), MF14 (n = 5), MF28 (n = 5) en MF-RVF ( n = 10). Statistische analyses werden uitgevoerd met de eenzijdige ANOVA met Bonferroni-correctie.
60 mg / kg MCT en verhoogde pulmonaire bloedstroom leiden tot een gemiddelde stijging van systolische rechter ventriculaire druk (sRVP) (23 ± 6-56 ± 11 mmHg), systolische pulmonale arteriële druk (SPAP) (20 ± 4-54,0 ± 10 mmHg ), en de gemiddelde pulmonale arteriële druk (mPAP) (16 ± 3-36 ± 4 mmHg) na 28 dagen (MF28). Ze blijven even hoog tot aan de fase waarin rechterkamer falen ontwikkelt (MF-RVF) (figuur 4). Aan het begin van de PAH stadia (MF8 en MF14), wordt er geen stijging van de sRVP, SPAP en mPAP waargenomen. Diastolische PAP en rechts eenproef drukverhoging in de late fase, maar niet significant. Wedge drukken niet significant veranderen tijdens progressie van de ziekte.
De rechter ventrikel naar de linker hartkamer en septum gewichtsverhouding aanzienlijk toeneemt van MF14 naar MF-RVF, wat aangeeft rechterventrikelhypertrofie. nat-to-verhouding van het drooggewicht van de lever is aanzienlijk toegenomen in het MF-RVF podium, met vermelding van de lever oedeem en congestief rechter ventrikel falen.
Muscularisatie van intra-acinaire schepen <50 pm stijgt geleidelijk in de loop van PAH progressie. Schepen van deze omvang normaal gesproken niet over een gespierde mediale laag in controle ratten. Bij MF14, bijna de helft van deze schepen (43 ± 17%) heeft een totale gespierde media (zoals in figuur 3B). Bij MF28 en MF-RVF, wordt bijna elke arteriole gemusculariseerde (98,7 ± 2,5% en 100 ± 0%). Neointima laesies eerste optredenbij MF21, terwijl MF28 en MF-RVF, ongeveer 65% van de arteriolen een neointimale laag (zoals in figuur 3C). Het arteriële wall-to-lumen ratio en occlusie scores zowel stijging aanzienlijk van MF14 naar MF28 (respectievelijk 10,4 ± 3,9-71,5 ± 30 (con: 7,1 ± 0,2) en 20,0 ± 2,8-54,7 ± 10,6 (con: 12,2 ± 0,3) ). De hemodynamische en histomorfologische kenmerken van PAK progressie MCT + FLOW bij Wistar ratten 14 soortgelijke.
Figuur 1. Schematische weergave van de aorto-cavale Shunt Surgery. A) De aorta wordt gespannen en vastgezet boven de inbrengplaats. De vena cava gecomprimeerd inferieur aan de insertieplaats. De naald, gebogen in 45 ° en met de opening naar buiten wordt in de aorta ingebracht bij een 90 ° hoek. B) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Catheterisatie Procedure Hart Recht en vertegenwoordiger Pressure Curves. A) het recht halsader wordt gespannen met een ligatuur en vastgebonden op het beademingsmasker. De katheter wordt geplaatst in de jugulaire ader. B) Een bedside monitor weergave van een rechter ventrikel drukgolf. C) De katheter binnen de canule geplaatst in het rechteratrium na binnenkomst in de rechter halsader. Onder: een typisch recht atriale drukgolf. D) De katheter binnen de canule geplaatst in de rechter ventrikel. Onder: een typische recht ventricular drukgolf in het eindstadium van PAH. E) De katheter wordt voortbewogen in de canule van de belangrijkste longslagader voeren. Onder: een typisch pulmonale arteriële drukgolf. F) De katheter wordt voortbewogen in de longslagaders tot een wig drukgolf op de monitor wordt weergegeven. Onder: een typisch pulmonale wedge drukgolf. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Vasculaire morfologie en Morphometry in controle en PAK Rats. A) Een normale, niet-gemusculariseerd schip met een occlusie score van 3,7%. B) Een volledig gemusculariseerd arteriole met een occlusie score van 24,3%. C). Een nieuwe intima laesie met een occlusie score van 54,1%. D) E) De meting van de totale oppervlakte vat en lumen (in een vat met een schematische weergave van een neo-intimale laesie), waaronder berekeningen. De staven stellen 50 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Representatieve resultaten van pulmonale hemodynamiek en Vasculaire morfologie / Morphometry. De statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van de one-way ANOVA met Bonferroni correcties. Waarden worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM. con: controle; MF (monocrotalin + flow); RVF: rechter ventrikel falen; s: systolische; d: diastolische; m: gemiddelde; RVP: rechter ventrikel druk; PAP: pulmonary arteriële druk; RAP: rechts atriale druk. RV: rechter ventrikel; LV: linker ventrikel; IVS: interventriculare septum; BW: lichaamsgewicht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode beschrijft de chirurgische procedure van een aorto-caval shunt bij ratten voorbehandeld met MCT tot stromingsgeïnduceerde PAK en de technieken om het beginsel van hemodynamische en histopathologische eindpunten dat PAK en dit model te karakteriseren beoordelen creëren.
Kritische stappen in het protocol en problemen oplossen
Chirurgie en na de operatie. Tijdens de aorto- cavale shunt operatie, de meest kritische stap is de dissectie van de aorta en vena cava. De membranen die omsluiten de aorta en vena cava dient zo ontleed om 1) een goede zichtbaarheid van de aorta, waar de naald wordt ingevoegd creëren, en de positie van de naald in de vena cava na inbrengen en 2) voldoende ruimte klem de aorta boven de inbrengplaats. Dezelfde membranen worden echter ook gebruikt om de aorta bloed verlopen via de prikplaats tussen beide vaten (Figuur 1). Ontrafeling van de membranen te veel zalveroorzaken de shunt lekken. Weefsellijm kan de lekkage op te lossen, maar het kan dan ook sijpelen in de shunt, koste zijn grootte. Als de lijm stroom door de shunt of één van de schepen heeft beperkt, kan de lijm voorzichtig worden verwijderd, maar de breuk van de vena cava of de membranen die het gedrag van de shunt optreden. De omvang of geschiktheid van de shunt kan worden geschat door het kleurverschil en de mate van turbulentie van het bloed in de vena cava tijdens de compressie en decompressie van de proximale aorta met een wattenstaafje.
Een 18-G naald is aangetoond dat een adequate shunt die resulteert in een consistente en reproduceerbare vorm van PAH progressie in Lewis (dit artikel) en Wistar te maken (zie referentie 14), ratten en van de rechter ventrikel volume overbelasting 15. Een 18-G naald gemaakt de uitgebalanceerde shunt, met pulmonale stroom enerzijds en een lage postoperatieve complicaties anderzijds aanzienlijk toegenomen. De meest voorkomende post-operatieve probleem is gewichtsverlies. Gewichtsverlies tot 10% in 1 week komt in alle ratten na operatie, waarschijnlijk als gevolg van geringere opname de eerste dagen na de operatie. Ratten worden gedood wanneer het gewichtsverlies 15% in 1 week overschrijdt, wordt dit beschouwd als een teken van onwel. Chow vloeistof kan verbeteren voederen in de eerste week na de operatie. Zeldzame postoperatieve complicaties zijn achterbeen verlamming en darmischemie, die ook leiden tot euthanasie. In totaal had minder dan 5% van de ratten worden gedood postoperatief.
Catheterisatie. Kritische stappen tijdens de catheterisatie protocol beginnen met de regulering van de anesthesie. De diepte van de anesthesie moet zo klein mogelijk zijn (1,5-2% isofluraan in dit protocol), een toename van anesthesie diepte lijkt rechterventrikel en longslagader druk verminderen, vooral bij ratten met rechter ventrikel falen. Metingen hebben de neiging om perfectionee onbetrouwbaar als het protocol meer dan 20 minuten duren.
De volgende belangrijke stap is de manipulatie van de katheter in de RV en de belangrijkste longslagader. Dit kan een uitdaging zijn. Spoelen van de catheter kan helpen om curve van de katheter in de uitstroom tract wanneer de tip zit vast in trabekels de RV's. De manipulatie zelf kan RV dyskinesie, die onregelmatige druk bochten op het nachtkastje beeldscherm toont veroorzaken. De invoering van de katheter in de rechter ventrikel en de pulmonale arterie moet verlopen. Wanneer de tip vast komt te zitten in de pulmonale klep, wordt een weerstand gevoeld. Doordrukken deze weerstand kan de pulmonale klep te scheuren, wat de betrouwbaarheid van volgende metingen beperkt veroorzaken.
In het huidige protocol, worden ratten gedood na de catheterisatie procedure. In theorie echter de jugulaire ader en chirurgische wond kan worden gesloten nadat de katheter wordt teruggetrokken, zoals dieren leven alleende resterende linker halsader.
Morfometrie. Bij de beoordeling van vasculaire occlusie wanddikte en scores, de meest kritische stap is de elastische laminae identificeren. Uit ervaring, de kans op succes hiertoe is het grootst bij een goed gedifferentieerde Verhoeff of Elastica-van Gieson kleuring. Terwijl het lumen meestal gemakkelijk kan worden onderscheiden van de intima (interne vasculaire gebied te meten), onderscheiding van de media uit de adventitia kan een kijkje vereisen (naar de externe vasculaire gebied te meten). Sommige protocollen maatregel intimale en mediale dikte afzonderlijk, waarin de intima de laag tussen het lumen en de interne elastische lamina en de media als de laag tussen de inwendige en uitwendige elastische lamina. Dit is meestal mogelijk in een vroeg stadium van MCT + FLOW PAH. Evenwel arteriolen in gevorderde ziekte, met name neo-intimale lesies, verschillende elastische laminae weergeven en verliezen vaak de integriteit van de elastische laminae ( Voordelen en beperkingen van de Flow toevoegen als een trigger Het gebruik van verhoogde pulmonaire bloedstroom PAK maken bij ratten heeft een aantal voordelen, de belangrijkste is dat het een bekend (patho-) fysiologische trigger voor de ziekte, die translatie bevordert menselijke PAH-CHD (Eisenmenger fysiologie), maar ook andere vormen van PAH 9. Het model maakt het mogelijk voor de regeling van de stroming door het variëren van de grootte van de naald bij het maken van de AC-shunt. in human PAH-CHD, de sluiting van de shunt zal leiden tot het terugdraaien van PAK's in de vroege fase van de ziekte, maar tot progressie van de PAK's in gevorderde ziekte fasen. Sluiting van de shunt in vivo zou mogelijk maken om het effect van verwijdering van de trekker onderzocht op verschillende tijdstippen van ziekteprogressie en aldus de mechanismen van (niet-) omkering van PAH onderzoeken. Helaas momenteel shunt sluiting niet haalbaar in het huidige model. De effecten van hemodynamische normalisering (zoals afvoeren van overtollige stroom en de normalisering van pulmonale arteriële druk) bij ratten met flow-geassocieerde PAH kan worden onderzocht door transplantatie van de betrokken linkerlong in een ontvanger rat met normale circulatie. Het is eerder aangetoond dat hemodynamische normalisatie, bij ratten door longtransplantatie en in menselijke PAH-CHD door sluiting van een cardiale shunt, leidt tot de regressie van mediale hypertrofie in een vroeg stadium van PAH 21. De effecten van hemodynamische normaleordening in de gevorderde stadia van de experimentele stroom-PAK's zijn op dit moment onbekend. Belang met betrekking tot alternatieve modellen De single-hit MCT model. Een subcutane injectie van 60 mg / kg MCT is een eenvoudige en effectieve manier om een model voor pulmonaire hypertensie bij ratten maken. MCT induceert pulmonale arteriële endotheliale celschade, gevolgd door hypertrofie van de spierlaag van de longslagaders 5. Hoewel de exacte mechanismen onduidelijk zijn verschillende paden en groeifactoren geïdentificeerd die deelnemen aan de mediale hypertrofie na MCT. Farmaceutische interventie op deze trajecten vaak met succes teruggedrongen mediale hypertrofie en mPAP in MCT-ratten. Aangezien mediale hypertrofie is bekend dat een natuurlijke neiging om te keren bij de mens hebben en 3 is ook beschreven spontaan omkeren MCT-ratten 16, het effect van deze behandelingenmoet kritisch worden beoordeeld. De dubbel-hit MCT + FLOW model. De toevoeging van verhoogde pulmonaire bloed vloeien 7 dagen na MCT injectie kritisch verandert de (vasculaire) fenotype in een karakteristieke tijd-afhankelijke manier. Bij MF14 (7 dagen na de inductie van verhoogde stroom), gewoonlijk niet-gemusculariseerd vaartuigen gaan een gespierde middelste laag ontwikkelen. Bij MF21, de mediale dikte toeneemt en de eerste neointima laesies ontstaan. Bij MF28 heeft een neo-intimale laag ontwikkeld in de meeste schepen. Tussen MF28 en MF35, de meeste ratten ontwikkelen rechter hartfalen en sterven van zijn restverschijnselen. Eerdere studies in MCT + Flow ratten hebben aangetoond dat de toevoeging van stroming MCT leidt tot de activering van specifieke clusters van genen. In een aantal clusters, stroming verzette zich tegen de effecten veroorzaakt door MCT; in anderen, stroom versterkt deze effecten, en één cluster bevatte genen die specifiek waren up-gereguleerd na doorstroming 17. Een van die stroom-specifieke genen is hetvroege groeirespons-1 gen 14 (Egr-1). Vroege inhibitie van Egr-1 resulteerde in de vermindering van PAH en de vorming van nieuwe intima in MCT + Flow 18 ratten. Egr-1 werd ook geassocieerd met hermodellering neointima in menselijke PAH (PAH-CHD en idiopathische PAH) 19. Deze observaties toe te voegen aan het bewijs dat verhoogd of verstoorde doorbloeding van de longen is een belangrijke trekker voor de vorming van nieuwe intima. De single-hit stroom-only model. In ratten met een aorto- cavale shunt zonder MCT-injectie, pulmonale hypertensie (mPAP> 25 mmHg) ontstaat tussen 10 en 20 weken na shunt inductie 20. Op 20 weken, is de pulmonaire vasculaire histologie gedomineerd door mediale hypertrofie van de pre-acinaire slagaders en neo-muscularisatie van intra-acinaire arteriolen. Hoewel sommige neointima laesies zijn ook in dit model 20 beschreven, de ontwikkeling van deze laesies moet t o worden bevestigd en gekwantificeerd. De Sugen-hypoxie model. Een andere veel voorkomende model voor PAH met neointima laesies is het Sugen5416-hypoxie (SuHx) rat. Sugen5416 blokkeert de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) receptor. Dit veroorzaakt endotheliale celschade en een signalerende cascade die, in combinatie met hypoxie, roept endotheliale apoptose en proliferatie 22. Na Sugen5416 injectie wordt de rat in een hypoxische kamer voor 4 weken, waarna PAH ontwikkelt. De rat wordt vervolgens opnieuw worden blootgesteld aan normoxie gedurende 4 weken. Farmacologische verbindingen die endotheliale apoptose-resistentie of de signalering cascades van TGF-B en BMP richten hebben de potentie om de neointima laesies te keren in dit model 23, 24, 25 getoond. Een nieuwe variant van de SuHx model is de Sugen-pneumectomy model, wat ook leidt tot ernstige PAH met neointima laesies > 26. Echter, dit model is nog niet volledig gekarakteriseerd. Een nieuwe genetische methode PH induceren in ratten omvat een mutatie in het BMP-receptor-2 gen, hetgeen resulteert in significante muscularisatie (PH) maar geen formatie (PAH) 27 neointima. Vergelijkbare resultaten gemeld over het aantal neointima laesies en de mate van luminale occlusie in het eindstadium van onbehandelde SuHx en MCT + Flow 28 ratten. De belangrijkste verschillen tussen beide modellen zijn 1) de mPAP in MCT + Flow geleidelijk toeneemt, terwijl in SuHx is de mPAP aangetoond geleidelijk afnemen na hernieuwde blootstelling aan normoxia 28; 2) dat de MCT + Flow model kent een vroeg stadium de ziekte, gekenmerkt door mediale hypertrofie en endotheelceldisfunctie; 3) de tijd die nodig beide modellen een eindstadium waarin rechterkamer falen begint te ontwikkelen (4 weken MCT + Flow, 8 weken SuHx) bereikenef "> 28 verschillend is, en 4) die Sugen5416 ingrijpt in een moleculaire route (VEGF) waarvan de rol in de pathogenese van PAH is nog onduidelijk Dit kan de vertaling belemmeren menselijke PAH.. Toekomstige toepassingen of richtingen De verschillende fasen van de ziekte MCT + Flow model laat men 1) tot de mechanismen van ziekteprogressie testen (menselijk weefsel in het algemeen alleen uit post-mortem of explantaat procedures) en 2) te testen ingrepen in verschillende strategieën. Een preventieve strategie kan worden gestart met de bouw van de shunt (MF7). Een vroege interventie kan worden gestart met MF14. Dit kan relevant zijn als een behandeling strategie voorafgaand aan de sluiting bij kinderen shunt met een aangeboren cardiale shunt en geassocieerde PAH dat is gevorderd in de grijze zone tussen omkeerbare en onomkeerbare ziekte. Reversal strategieën kunnen worden ingeleid op MF21 of MF28. Latere stadia tonen beide neointima laesies, een manifestatie van eindstadium PAH. </ P> Concluderend is de toevoeging van verhoogde pulmonale flow MCT bij ratten leidt tot een model van progressieve en ernstige PAH dat ontwikkeling van menselijke ziekte nabootst. Recht hartkatheterisatie en de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van de vasculaire histopathologische vormen de hoekstenen van de karakterisering van ziekten in deze en andere modellen voor PAH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shunt Surgery | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Duratears Eye ointment | Alcon | 10380 | |
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Histoacryllic tissue glue | B. Braun Medical | 1050052 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Safil 4-0 sutures violet resorbable | B. Braun Medical | ||
| 18 G needle | Luer | NN1838R BD | tip bent in 45 degrees orifice to the outside |
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Temgesic Buprenorphine | RB Pharmaceuticals | 5429 | subcutaneous injection |
| Sodium Chloride 0.9% | |||
| Ventilation mask Rat | |||
| Scalple blade | |||
| Biemer clamp 18 mm, 5 mm opening | AgnTho | 64-562 | |
| Heat mat | |||
| Kocher Clamp | |||
| Shaving machine | |||
| Microscope | Leica | ||
| Right Heart Catheterization | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Eye ointment | Duratears | ||
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Needle 20 G | Luer | Tip slightly bent to the inside | |
| Cannula 20 G | Luer | to introduce catheter, tip pre-formed in 20 degrees | |
| Silastic Catheter 15 cm long | 0.5 mm ball 2 mm from tip | ||
| Pressure transducer | Ailtech | ||
| Bedside monitor Cardiocap/5 | Datex-Ohmeda | ||
| Shaving machine | |||
| 10 mL Syringe | |||
| Sodium Chloride 0.9% | for flushing | ||
| Vascular Morphology | |||
| 50 mL Syringe | |||
| 4% Formaldehyde | |||
| 18 G cannula with tube | |||
| Verhoef staining kit | Sigma-Aldrich | HT254 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US |
| Digital slide scanner | Hamamatsu | C9600 | |
| ImageJ | |||
| Elastic (Connective Tissue Stain) | Abcam | ab150667 | http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf |
References
- Hoeper, M. M., Bogaard, H. J., Condliffe, R., et al. Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension. J Am Coll Cardiol. 62, D42-D50 (2013).
- Stacher, E., Graham, B. B., Hunt, J. M., et al. Modern age pathology of pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 186 (3), 261-272 (2012).
- Levy, M., Maurey, C., Celermajer, D. S., et al. Impaired apoptosis of pulmonary endothelial cells is associated with intimal proliferation and irreversibility of pulmonary hypertension in congenital heart disease. J Am Coll Cardiol. 49 (7), 803-810 (2007).
- Sakao, S., Tatsumi, K., Voelkel, N. F. Reversible or irreversible remodeling in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 629-634 (2010).
- Gomez-Arroyo, J. G., Farkas, L., Alhussaini, A. A., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (4), L363-L369 (2012).
- Jones, J. E. Serial noninvasive assessment of progressive pulmonary hypertension in a rat model. Am J Physiol - Heart Circ Physiol. 283 (1), 364-371 (2002).
- Hoffman, J. I., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Pulmonary vascular disease with congenital heart lesions: Pathologic features and causes. Circulation. 64 (5), 873-877 (1981).
- van Albada, M. E., Berger, R. M. Pulmonary arterial hypertension in congenital cardiac disease--the need for refinement of the evian-venice classification. Cardiol Young. 18 (1), 10-17 (2008).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A., Berger, R. M. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: Lessons from preclinical animal models. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 305 (1), L1-L14 (2013).
- Garcia, R., Diebold, S. Simple, rapid, and effective method of producing aortocaval shunts in the rat. Cardiovasc Res. 24 (5), 430-432 (1990).
- Okada, K., Tanaka, Y., Bernstein, M., Zhang, W., Patterson, G. A., Botney, M. D. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. Am J Pathol. 151 (4), 1019-1025 (1997).
- van Albada, M. E., Schoemaker, R. G., Kemna, M. S., Cromme-Dijkhuis, A. H., van Veghel, R., Berger, R. M. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. Eur Respir J. 26 (3), 487-493 (2005).
- Brittain, E. Echocardiographic assessment of the right heart in mice. JVis Exp. (e81), (2013).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Molema, G., et al. Egr-1 expression during neointimal development in flow-associated pulmonary hypertension. Am J Pathol. 179 (5), 2199-2209 (2011).
- Borgdorff, M. A., Bartelds, B., Dickinson, M. G., Steendijk, P., de Vroomen, M., Berger, R. M. Distinct loading conditions reveal various patterns of right ventricular adaptation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (3), H354-H364 (2013).
- Ruiter, G., de Man, F. S., Schalij, I., et al. Reversibility of the monocrotaline pulmonary hypertension rat model. Eur Respir J. 42 (2), 553-556 (2013).
- van Albada, M. E., Bartelds, B., Wijnberg, H., et al. Gene expression profile in flow-associated pulmonary arterial hypertension with neointimal lesions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (4), L483-L491 (2010).
- Dickinson, M. G., Kowalski, P. S., Bartelds, B., et al. A critical role for egr-1 during vascular remodelling in pulmonary arterial hypertension. Cardiovasc Res. 103 (4), 573-584 (2014).
- van der Feen, D. E., Dickinson, M. G., Bartelds, M. G., et al. Egr-1 identifies neointimal remodeling and relates to progression in human pulmonary arterial hypertension. Jheart lung transplant. 35 (4), 481-490 (2016).
- Rungatscher, A. Chronic overcirculation-induced pulmonary arterial hypertension in aorto-caval shunt. Microvasc Res. 94, 73-79 (2014).
- O'Blenes, S. B., Fischer, S., McIntyre, B., Keshavjee, S., Rabinovitch, M. Hemodynamic unloading leads to regression of pulmonary vascular disease in rats. J Thorac Cardiovasc Surg. 121 (2), 279-289 (2001).
- Sakao, S., Taraseviciene-Stewart, L., Lee, J. D., Wood, K., Cool, C. D., Voelkel, N. F. Initial apoptosis is followed by increased proliferation of apoptosis-resistant endothelial cells. FASEB J. 19 (9), 1178-1180 (2005).
- Spiekerkoetter, E. FK506 activates BMPR2, rescues endothelial dysfunction, and reverses pulmonary hypertension. J Clin Invest. 123 (8), 3600-3613 (2013).
- Nickel, N. P., Spiekerkoetter, E., Gu, M., et al. Elafin reverses pulmonary hypertension via caveolin-1-dependent bone morphogenetic protein signaling. Am J Respir Crit Care Med. 191 (11), 1273-1286 (2015).
- Meloche, J., Potus, F., Vaillancourt, M., et al. Bromodomain-containing protein 4: The epigenetic origin of pulmonary arterial hypertension. Circ Res. 117 (6), 525-535 (2015).
- Happé, C. M. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
- Ranchoux, B., Antigny, F., Rucker-Martin, C., et al.
- de Raaf, M. A. SuHx rat model: Partly reversible pulmonary hypertension and progressive intima obstruction. Eur Respy J. 44 (1), 160-168 (2014).
- Elastic (Connective Tissue Stain) Instructions for Use. , Available from: http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf (1506).
