Summary
Murine full-dikte van de huid transplantatie is een gevestigde model om afstoting te studeren in een alloimmuun setting. Hier bieden we een tutorial van elke stap die betrokken zijn bij het uitvoeren van een BALB / c -> C57BL / 6 full-dikte van de huid transplantatie.
Abstract
Murine volledige dikte huidtransplantatie is een gevestigde in vivo model om allo respons en transplantaatafstoting bestuderen. Ondanks de beperkte toepassing voor mensen, is huidtransplantatie bij muizen grote schaal toegepast voor transplantatie onderzoek. De procedure is eenvoudig te leren en uit te voeren, en het vereist geen delicate microchirurgische technieken, noch uitgebreide training. Bovendien transplantaatafstoting in dit model wordt op een zeer reproduceerbare immunologische reactie en wordt gemakkelijk gevolgd door directe inspectie en palpatie. Bovendien kunnen secundaire huidtransplantatie met donor gematched of skin derden grafts uitgevoerd complexere transplantatie modellen als alternatief en eenvoudige methode om donor-specifieke tolerantie te bepalen. De complicaties zijn laag en zijn over het algemeen beperkt tot anesthesie overdosering of ademhalingsproblemen na de ingreep. Transplantaatfalen, daarentegen, komt vaak voor als gevolg van slechte voorbereiding van de grachterschip, onjuiste positionering in het transplantaat bed, of onjuiste plaatsing van de bandage. In dit artikel presenteren we een protocol voor volledige dikte huidtransplantatie bij muizen en beschrijf de belangrijke stappen die nodig zijn voor een succesvolle procedure.
Introduction
Orgaantransplantatie is de behandeling van keuze voor patiënten met eindstadium orgaanfalen en resultaten zijn opmerkelijk verbeterd met vooruitgang in chirurgische procedures en immunosuppressie protocollen. Echter langdurige immunosuppressie gepaard met significante bijwerkingen, en de ontwikkeling van nieuwe strategieën verdraagzaamheid blijft het doel van de moderne transplantatieonderzoek.
Talrijke diermodellen zijn ontwikkeld voor basisonderzoek bij transplantatie, de mechanismen van transplantaatafstoting bestuderen en te testen immunosuppressie benaderingen voor het voorkomen van transplantaat afstoting en voor de bevordering van tolerantie op lange termijn 1-3. Muismodellen hebben de steunpilaar van immunologisch onderzoek geworden als gevolg van de exclusieve en ruime beschikbaarheid van diagnostische en therapeutische antilichamen en goed gedefinieerde inteelt en transgene stammen. Huidtransplantatie is een eenvoudige procedure die niet vereist speciale vaardigheden en kan microchirurgischegemakkelijk postoperatief gevolgd. Bij elkaar genomen, heeft de muis huidtransplantatie een uitzonderlijk hulpmiddel om vele aspecten die betrokken zijn bij de alloimmuun reactie, met inbegrip van antigeen-afgifte, mobiele handel, en weefsel tijdens afstoting van 4,5 te bestuderen.
Hier tonen we de stap-voor-stap procedure voor full-thickness huidtransplantatie met het muismodel en we de belangrijke stappen die nodig zijn voor een succesvolle implantatie van de getransplanteerde huid beschrijven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van het National Institute of Health (NIH) en werden goedgekeurd door de Johns Hopkins University Dierverzorging en gebruik Comite (JHUACUC). De specifieke procedures werden uitgevoerd in het kader van de goedgekeurde ACUC protocollen MO13M292 en MO13M370.
1. donorhuid Harvest
- Verdoven van de donor muis met isofluraan (inductie vaporizer op 4%, het onderhoud op 1-2% door middel van de muis kegel). Gebruik de teen knijpen terugtrekking reflex om de diepte van de anesthesie te controleren.
- Met behulp van een elektrisch scheerapparaat, scheren de achterkant van het dier en gedesinfecteerd met 10% povidonjood (bijvoorbeeld Betadine).
- Met steriele scharen, handschoenen en aseptisch oogst donor rugvel van de heup tot de nek, met stompe dissectie ter hoogte van de areolar bindweefsel.
- Euthanaseren het dier door cervicale dislocatie na het oogsten van dehuid transplantatie.
- Onder een microscoop, scheiden het bindweefsel, vetweefsel en panniculus carnosus het rugvel met behulp van fijne schaar tenotomie. De panniculus carnosus is een dunne, transparante spieren die verantwoordelijk zijn voor de huid trillen bewegingen.
- Met behulp van steriele instrumenten techniek, uitgesneden 15 mm x 15 mm transplantaten van de rug huid voor een 10-mm x 10 mm tot 15 mm x 15 mm graft bed.
- Bewaar de grafts gazen gedrenkt met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een petrischaal op ijs.
LET OP: 8-10 enten kan worden verkregen van één donor muis.
2. Ontvanger Skin Transplant
- Verdoven van de ontvanger muis met isofluraan (inductie vaporizer op 4%, het onderhoud op 1-2% door middel van de muis kegel). Gebruik de teen knijpen terugtrekking reflex om de diepte van de anesthesie te controleren.
- Dien 0,02 mg / kg lichaamsgewicht van buprenorfine voor postoperatieve pijnbestrijding.
- Scheer de zijkant van de rug van het dier wanneer het transplantaat will zijn geplaatst en desinfecteren met 10% povidonjood.
- Met een schaar, snijd een 10-mm x 10 mm tot 15 mm x 15 mm vierkant van de huid. Het defect maat zal iets groter (10%) dan de conduit. Snijd zo oppervlakkig mogelijk te maken. Zorg ervoor dat de panniculus carnosus en vaten te bewaren. De panniculus carnosus kan onderscheiden van de onderliggende fascia door zijn mobiliteit en de bloedvaten die oppervlakkig om het uit te voeren zijn.
- Plaats het transplantaat op het transplantaat bed, het vermijden van plooien langs de randen.
- Plaats 8 hechtingen op de hoeken en het midden van elke rand. Voor elke hechtdraad, passeren de naald door het transplantaat en vervolgens door de panniculus carnosus van het transplantaat onder de omliggende ontvanger huid bed.
- Verwijder de verdoving masker en laat het dier gedeeltelijk te herstellen van de anesthesie alvorens de pleister.
- Wikkel de ontvanger muis in een pleister met gevouwen gaasje op het transplantaat. Maak het verband door twee verbanden, snijdende kleeflaag van een en twee absorberende kussens elkaar te zetten.
- Controleer de muis nauw gedurende herstel te verzekeren dat het verband niet beperkt thorax excursie en ademhaling. Verwijder de bandage als de ademhalingsfrequentie afneemt of het dier begint te hijgen of adem oppervlakkig.
3. postoperatieve zorg
- Dien enrofloxacine 5 mg / kg na de operatie voor infectie profylaxe.
- Plaats de getransplanteerde muis in een schone kooi over een microwavable verwarming pad totdat deze volledig herstelt van anesthesie.
- Let op de muis gedurende 1 uur na de operatie voorafgaand aan de terugkeer naar de behuizing faciliteit.
- Zeven dagen na de operatie, verdoven muizen als in stap 2,1. Verwijder de bandage slechts snijden door de ventrale zijde van het verband.
- Observeren en te betasten het transplantaat op de volgende dag op tekenen van korstvorming, contractie, of hardheid. Indien aanwezig, het transplantaat mogelijk niet correct vasculariza bereikttie en moet worden beschouwd als een technische storing.
- dagelijks controleren op tekenen van afstoting. Overweeg enten afgewezen wanneer ≥90% van het transplantaat weefsel wordt necrotische.
- Euthanaseren de afgekeurde dieren en oogsten ze voor analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De plaatsing van de pleister op de ontvanger muis is een belangrijke stap van de procedure. Het huidtransplantaat wordt op de ontvangende stam, tussen de schouder, heup en wervelkolom (figuur 1). Het verband bestaat met gevouwen gaas en de combinatie van twee plastic pleisters. De ontvanger muis ligt met het transplantaat naar beneden over het gaas in het midden van het verband. Via twee gebogen micro pincet, wordt het ondereinde van de eerste bandage getrokken, en dan de bovenkant van het verband is gewikkeld over de muis om de buik.
In complete mismatch modellen, zijn volledige dikte huid transplantaten meestal afgewezen in 8 tot 12 dagen. In kleine mismatch modellen, afstotingsreacties trager, meer variabel en de huidtransplantaat uiterlijk wordt gekenmerkt door minder duidelijke veranderingen, zoals contractie of haaruitval (figuur 2). Acute afstoting van het transplantaat generally begint met zwelling en roodheid van het transplantaat. Deze gebeurtenissen worden gevolgd door graft uitdroging, krimp en korstvorming (figuur 2B en C). Afhankelijk van de mate van MHC mismatch en immunosuppressieve protocol, kan afstoting plaatsvinden door een subacute werkwijze, gekenmerkt door subtiele veranderingen, zoals haarverlies, pigmentatie, huidribbels en graft volume. In deze gevallen, een afgewezen graft lijkt glanzend, wit en kaal, met ongelijke randen (figuur 2F) 14.
Gebruik makend van dit model van huidtransplantatie, onderzochten we een nieuwe aanpak gericht T-cel metabolisme tot afstoting 15 te voorkomen. Het is bekend dat metabole signaalwegen spelen cruciale rol in dicteren de resultaten van T-celresponsen 16. Naïeve T-cellen afhankelijk mitochondriale oxidatieve fosforylering aan de energie die nodig is voor basis immuunsurveillance genereren. Echter,na activering, effector-T-cellen metabolisch herprogrammeren om aërobe glycolyse en vertonen verhoogde glutamine metabolisme 16,17. Met behulp van Balb / c als donoren en C57BL / 6 als ontvangers, we hebben geconstateerd dat de remming van de glycolyse en oxidatieve fosforylering (2DG + metformine) of glutamine metabolisme alleen (DON) verlengde huidtransplantatie overleven, maar tegelijkertijd het blokkeren van de drie trajecten geleid tot aanzienlijk-toegenomen graft overleving (Figuur 3C). Bovendien triple metabole therapie werkzamer dan conventionele cyclosporine of rapamycine (Figuur 3A en B). Permanente acceptatie is niet gehaald, en verder strategieën, met inbegrip van uitputting therapie, costimulatieblokkade, of nieuwer metabolische therapieën, kan beter inductie van transplantatie tolerantie te bevorderen. De studie leverde twee nieuwe inzichten: het gebruik van niet-specifieke inhibitoren selectief immuuncellen met een verhoogde metabolische eisen, evenals de eis t targeten o blokkeren de drie metabole routes tegelijkertijd robuuster immuunsuppressie bij transplantaatafstoting verkrijgen.
Calcineurineremmers en zoogdieren doelwit van rapamycin (mTOR-remmers) vormen het grootste deel van de conventionele immunosuppressieve therapie gebruikt in klinische transplantatie. Mediane graft overleving van Balb / c om C57BL / 6 huidtransplantaties werden behandeld met ciclosporine en rapamycine waren 17 en 16 dagen, respectievelijk. Ter vergelijking, de ontvangers behandeld met metabole remmers die T-cel glycolyse, mitochondriële oxidatieve fosforylering te remmen, en glutamine metabolisme had survival verlengd: de mediane transplantaat overleving was 29 dagen. Bovendien is de histologie van huidtransplantaten van de metabole therapie groep vertoonden meer intact weefsel uitlijning en minder lymfocytische inflammatoire infiltraat (figuur 4).
105 / 55105fig1.jpg "/>
Figuur 1: Covering van de Graft de bandage. (A) huidtransplantaat rechts geplaatst stam. (B) Bandage gemaakt met een opgevouwen gaas en twee plastic strips bandages. (C) Ontvanger muizen geplaatst op het gaas. (DF) Bandage rond de muis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Skin Graft Appearance tijdens acute en chronische afstoting. (A) Balb / c om C57BL / 6 (compleet mismatch) full-dikte van de huid transplantatie zonder bewijs van afstoting (dag 8). (B) Balb / c om C57BL / 6 full-thickness huidtransplantatie met 50% transplantaatafstoting (dag 13). (C) Balb / c om C57BL / 6 full-thickness huidtransplantatie met volledige transplantaatafstoting (dag 18). (D) Syngene volledige dikte van de huid transplantatie (dag 8). (E) Syngene full-thickness huidtransplantatie (dag 30). (F) C57BL / 10 tot C57BL / 6 (kleine mismatch) full-thickness huidtransplantatie chronische transplantaatafstoting (dag 100). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Balb / c om C57BL / 6 huid transplantaatoverleving. (A) De behandeling met cyclosporine (25 mg / kg QD). (B) De behandeling met rapamycine (3 mg / kg QD). (C) Behandeling met metabole remmers, 2-deoxy-D-glucose (2DG) 500mg / kg QD, metformine 150 mg / kg QD en 6-diazo-5-oxo-L-norleucine (DON) 1,6 mg / kg QOD. Alle behandelingen werden toegediend vanaf de dag van de transplantatie tot afstoting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: hematoxyline en eosine Stain (rechts, X100, links, X200) van huidtransplantaties met Metabolic Therapy op postoperatieve dag 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sinds de introductie van Medawar, eerst in menselijke studies en bij konijnen en muizen is huidtransplantatie een waardevol model voor de studie van allogene immune responsen 6,7 geweest. In dit manuscript presenteren we een model van grootschalige, niet-gevasculariseerd, full-thickness huidtransplantatie met de bovenste en onderste rugvel. Diverse alternatieve werkwijzen, inclusief het gebruik van de staart huid of oorhuid van de muis als graft bronweefsel, zijn tot op heden 8,9. Deze modellen presenteren het duidelijke voordeel van de technische eenvoud en zorgen voor high-volume throughput. De relatief tekort aan epidermale Langerhans cellen en dermale dendritische cellen in de staart huidtransplantaten, leidt echter tot vertraagde afstoting en graft om gunstiger aanvaarding door de gastheer, met name kleine MHC mismatch modellen 10,11. Daarom is full-thickness trunk huidtransplantatie als een robuuste uitvoering en meer geschikt voor T-cel-media bestuderented acute afstoting 12.
Bovendien, ons model maakt gebruik van eenvoudige technieken en vereist geen geavanceerde microchirurgische vaardigheden. De bedrijfsduur is kort (~ 10 min per muis van het begin van anaesthesie voor de voltooiing van de procedure) en de postoperatieve morbiditeit en sterfte verwaarloosbaar. De totale operatieve mortaliteit (sterfte binnen 24 uur na de operatie plus overlijden voor het verwijderen van de pleister) gerapporteerd 3,8% 13 is. De meeste van de complicaties van anesthesie overdosering of overdreven beperkend verbanden, die gemakkelijk kan worden voorkomen door zorgvuldige controle van de ademhalingsfunctie tijdens na de operatie en snelle verwijdering van de bandage bij de eerste tekenen van ademnood 6,17.
De belangrijkste factor bij het proces van enting is de revascularisatie van transplantaat weefsel door de ingroei van ontvangende vaartuigen het transplantaat 6. De geoogste huid vereisens zorgvuldige voorbereiding en de dissectie van de panniculus carnosus is een cruciale stap. Wij vinden de panniculus carnosus onder een microscoop te verwijderen. Het wordt aanbevolen de dissectie starten van een van de randen en langzaam vooruit door op de spier en scheiden van de huid met het blad van een gebogen tenotomie enigszins schuin. De plaats van het implantaat bed moet ver van gewrichten en de wervelkolom. Alvorens insnijdingen in de ontvangende muis gebruikt, de schouder en de heup worden verplaatst naar de huidplooien die helpen om het niveau van de gewrichten bakenen visualiseren. Bij het verwijderen van de ontvanger huid, is het belangrijk om te voorkomen dat schade aan de bloedvaten die oppervlakkig de panniculus carnosus draaien. Als bloeden optreedt, gelden de lokale compressie en verwijderen van bloed en stolsels die kunnen interfereren met innesteling. Tenslotte moet het verband niet leiden tot ademhalingsmoeilijkheden dat compromis herstel, hoewel het voldoende samentrekkende moet zijn om verplaatsing van het transplantaat en auto-mu voorkomenzame tijdens het proces van revascularisatie. Tape pleisters zijn hechtende en sterk genoeg zijn voor dit doel. We combineren twee verbanden volledig wikkel de muis taille en de plaatsing van een opgevouwen gaas tussen het verband en de graft (figuur 1) mogelijk maken. Het verband wordt verwijderd door snijden van de ventrale kant ervan, en de rest wordt verwijderd door het dier, teneinde te verstoren het transplantaat bij een poging de bandage handmatig verwijderen.
Samengevat, full-thickness huidtransplantatie is een gevestigde model met veel verwijzingen in de literatuur. De procedure is eenvoudig uit te voeren, de operationele tijd is kort, en de postoperatieve complicaties zijn beperkt. De kritische stappen zijn nauwgezet donorhuid oogst en de juiste plaatsing van de ontvanger bandage. Toekomstige studies met biomaterialen die angiogenese en weefselherstel te bevorderen, kan verdere verbetering van de mate van succes van de procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door NIH-subsidie R01AI077610.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro forceps | Sigma | F4017 | |
| Curved micro forceps | Aesculap | BD333R | |
| Curved Stevens tenotomy scissors | Aesculap | BC905R | |
| Mayo dissecting scissors | Sigma | S3146 | |
| Micro needle holder | Aesculap | BM563R | |
| Sterile gauze | Covidien | 441218 | |
| 6-0 Nylon suture | MWI | 31849 | |
| Plastic Strips Band-Aid | Johnson & Johnson | Obtained from pharmacy | |
| 10 cm Petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| PBS | Quality Biological | 119069131 | |
| Buprenorphine | DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy | ||
| Enrofloxacin | Bayer Health Care | 186599 |
References
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. J Vis Exp. , (2016).
- Oh, B., et al. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J Vis Exp. , (2016).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , e50753 (2014).
- Jones, T. R., Shirasugi, N., Adams, A. B., Pearson, T. C., Larsen, C. P. Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts. J Clin Invest. 112, 1714-1723 (2003).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17, 744-749 (2011).
- Medawar, P. B. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits: A report to the War Wounds Committee of the Medical Research Council. J Anat. 78, 176-199 (1944).
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B., Sparrow, E. M. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. I. The survival times of skin homografts exchanged between members of different inbred strains of mice. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 143, 43-58 (1954).
- Garrod, K. R., Cahalan, M. D.
- Schmaler, M., Broggi, M. A., Rossi, S. W. Transplantation of tail skin to study allogeneic CD4 T cell responses in mice. J Vis Exp. , e51724 (2014).
- Bergstresser, P. R., Toews, G. B., Gilliam, J. N., Streilein, J. W. Unusual numbers and distribution of Langerhans cells in skin with unique immunologic properties. J Invest Dermatol. 74, 312-314 (1980).
- Chen, H. D., Silvers, W. K. Influence of Langerhans cells on the survival of H-Y incompatible skin grafts in rats. J Invest Dermatol. 81, 20-23 (1983).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a015495 (2013).
- Mayumi, H., Nomoto, K., Good, R. A. A surgical technique for experimental free skin grafting in mice. Jpn J Surg. 18, 548-557 (1988).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S.
- Lee, C. F., et al. Preventing Allograft Rejection by Targeting Immune Metabolism. Cell reports. 13, 760-770 (2015).
- Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342, 1242454 (2013).
