Summary
Murino di trapianto a tutto spessore della pelle è un modello consolidato per studiare il rifiuto in un ambiente alloimmune. Qui, mettiamo a disposizione un tutorial di ogni passo coinvolti in esecuzione di un BALB / c -> C57BL / 6 a tutto spessore trapianto di pelle.
Abstract
Murino di trapianto a tutto spessore della pelle è un modello in vivo consolidata per studiare alloimmune risposta e rigetto del trapianto. Nonostante la sua limitata applicazione per gli esseri umani, il trapianto di pelle nei topi è stato ampiamente impiegato per la ricerca sui trapianti. La procedura è facile da imparare ed eseguire, e non richiede tecniche microchirurgiche delicate né una formazione completa. Inoltre, il rigetto in questo modello si verifica in una reazione immunologica molto riproducibili ed è facilmente monitorato mediante ispezione diretta e palpazione. Inoltre, il trapianto di pelle secondario con innesti donatore corrispondenza o pelle di terze parti può essere eseguita su più modelli di trapianto complessi come un metodo alternativo e semplice per valutare la tolleranza specifici per donatore. Le complicazioni sono bassi e sono in genere limitati a overdose anestesia o distress respiratorio dopo la procedura. fallimento Graft, invece, si verifica comunemente come a causa della scarsa preparazione del gra poppa, errato posizionamento nel letto trapianto, o il posizionamento inadeguato del bendaggio. In questo articolo, vi presentiamo un protocollo per il trapianto di pelle a tutto spessore nei topi e descrivere i passi importanti necessari per una procedura di successo.
Introduction
Il trapianto di organi è il trattamento di scelta per i pazienti con insufficienza terminale d'organo, ed i risultati hanno migliorato notevolmente con i progressi nelle procedure chirurgiche e protocolli immunosoppressione. Tuttavia, immunosoppressione a lungo termine è associato ad effetti collaterali significativi, e lo sviluppo di nuove strategie che promuovano la tolleranza rimane l'obiettivo della ricerca trapianti moderna.
Numerosi modelli animali sono stati sviluppati per la ricerca di base nel trapianto, per studiare i meccanismi di rigetto e per testare immunosoppressione approcci per prevenire il rigetto del trapianto e per promuovere la tolleranza a lungo termine 1-3. modelli di topo sono diventati il cardine della ricerca immunologica grazie alla disponibilità esclusiva e vasta di anticorpi diagnostici e terapeutici e ceppi inbred e transgenici ben definiti. Il trapianto della pelle è una procedura semplice che non richiede particolari competenze di microchirurgia e puòessere facilmente monitorati dopo l'intervento. Nel loro insieme, il trapianto di pelle del mouse è stato uno strumento eccezionale per studiare molti aspetti coinvolti nella risposta alloimmune, tra cui la consegna antigene, il traffico delle cellule, e la distruzione dei tessuti durante rigetto del trapianto 4,5.
Qui, vi mostriamo la procedura passo-passo per il trapianto a tutto spessore della pelle utilizzando il modello di topo, e descriviamo i passi importanti necessari per un attecchimento di successo della pelle trapiantata.
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Protocol
Tutte le procedure sono state condotte in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institute of Health (NIH) e sono stati approvati dal Comitato Johns Hopkins University Animal Care e Usa (JHUACUC). Le procedure specifiche sono state eseguite sotto la protocolli ACUC approvato MO13M292 e MO13M370.
1. donatore Harvest pelle
- Anestetizzare il mouse donatore con isoflurano (vaporizzatore induzione a 4%, manutenzione a 1 - 2% attraverso il cono del mouse). Utilizzare la punta pizzico di ritiro reflex per monitorare la profondità dell'anestesia.
- Usando un rasoio elettrico, radere dorso dell'animale e disinfettare con 10% di iodio povidone (ad esempio, Betadine).
- Utilizzando forbici sterili, guanti e tecnica asettica, pelle di nuovo raccolto donatore dal fianco al collo, con scollamento a livello del tessuto connettivo areolare.
- Eutanasia dell'animale da dislocazione cervicale dopo la raccolta delinnesto di pelle.
- Sotto un microscopio, separare il tessuto connettivo, tessuto adiposo, e pannicolo carnosus dalla pelle indietro con le forbici tenotomy sottili. Il carnosus pannicolo è un sottile, trasparente muscoli responsabili dei movimenti contrazioni della pelle.
- Usando una tecnica strumenti sterili, tagliare innesti 15 mm x 15 mm dalla pelle indietro per un 10 mm x 10 mm per 15 mm letto trapianto x 15 mm.
- Conservare gli innesti su garze imbevute con sterile tampone fosfato salino (PBS) in una capsula di Petri sul ghiaccio.
NOTA: 8 - 10 innesti può essere ottenuta da un topo donatore.
2. trapianto di pelle
- Anestetizzare il mouse destinatario con isoflurano (vaporizzatore induzione a 4%, manutenzione a 1 - 2% attraverso il cono del mouse). Utilizzare la punta pizzico di ritiro reflex per monitorare la profondità dell'anestesia.
- Somministrare 0,02 mg / kg di peso corporeo di buprenorfina per alleviare il dolore post-operatorio.
- Shave lato del dorso dell'animale in cui l'innesto will essere inserito e disinfettare con il 10% di iodio povidone.
- Utilizzando le forbici, tagliare un 10 mm x 10 mm per 15 mm x 15 mm quadrato di pelle. La dimensione difetti dovrebbe essere leggermente più grande (10%) rispetto al trapianto. Tagliare come superficialmente possibile. Fare attenzione a preservare la carnosus pannicolo e vasi. La carnosus pannicolo può essere distinto dal fascia sottostante per la sua mobilità e dei vasi sanguigni che corrono superficiale ad esso.
- Posizionare l'innesto sul letto graft, evitando pieghe lungo i bordi.
- Mettere 8 punti di sutura sugli angoli e sul centro di ciascun bordo. Per ciascuna di sutura, passare l'ago attraverso l'innesto e poi attraverso la carnosus pannicolo dell'innesto letto sotto la pelle del destinatario circostante.
- Rimuovere la maschera anestetico e lasciare che l'animale recupera parzialmente da anestesia prima di applicare il cerotto.
- Avvolgere il mouse destinatario in un bendaggio adesivo con garza piegata sopra l'innesto. Effettuare la benda dalla combinazione di due bende, tagliola parte adesiva di uno e posizionare i due tamponi assorbenti insieme.
- Monitorare il mouse da vicino durante il recupero per garantire che il bendaggio non sta limitando torace escursione e la respirazione. Togliere la benda se la frequenza respiratoria diminuisce o l'animale comincia a boccheggiare o alito superficialmente.
3. Cura postoperatoria
- Somministrare enrofloxacina 5 mg / kg dopo l'intervento chirurgico per la profilassi delle infezioni.
- Posizionare il mouse trapiantato in una gabbia pulita su una piastra elettrica per microonde fino a quando non recupera completamente dall'anestesia.
- Osservare il mouse per 1 ora dopo l'intervento prima di ritornare alla struttura alloggiativa.
- Sette giorni dopo l'intervento, anestetizzare il mouse come al punto 2.1. Rimuovere il bendaggio tagliando solo attraverso il lato ventrale della benda.
- Osservare e palpare il trapianto il giorno successivo per i segni di formazione di croste, la contrazione, o la durezza. Se presente, l'innesto può non aver raggiunto la corretta vascularizazione e deve essere considerato un guasto tecnico.
- Daily Monitor per i segni di rigetto. Considerare innesti respinto quando ≥90% del tessuto trapianto diventa necrotico.
- Eutanasia gli animali rifiutati e li raccolto per l'analisi.
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Representative Results
Il posizionamento del bendaggio sul mouse destinatario è un importante passo della procedura. L'innesto di pelle è posizionato sul tronco destinatario, tra la spalla, anca e colonna vertebrale (Figura 1). La benda è realizzata con garza piegata e la combinazione di due bende adesive plastica. Il mouse destinatario è posizionato con l'innesto giù sopra la garza sul centro della benda. Utilizzando due micro pinze curve, l'estremità inferiore della benda è tirato prima, e poi la parte superiore della benda è avvolto sopra il mouse per l'addome.
Nei modelli di mismatch completi, tutto spessore innesti cutanei sono di solito respinte 8 a 12 giorni. Nei modelli disallineamento minori, risposte di rigetto sono più lenti, più variabile, e la comparsa innesto di pelle è caratterizzata da cambiamenti distinti meno, come contrazione o la perdita di capelli (Figura 2). trapianto rigetto acuto generilly inizia con gonfiore ed eritema del trapianto. Questi eventi sono seguiti da trapianto essiccazione, restringimento, e formazione di crosta (Figura 2B e C). A seconda del grado di MHC disadattamento e il protocollo immunosoppressione, rifiuto può avvenire mediante un processo subacuto, caratterizzato da cambiamenti sottili come la perdita di capelli, pigmentazione, creste dermiche, e il volume dell'innesto. In questi casi, un innesto respinto appare lucido, bianco, e senza peli, con bordi irregolari (Figura 2F) 14.
Utilizzando questo modello di trapianto di pelle, abbiamo studiato un nuovo approccio mira il metabolismo delle cellule T per evitare rigetto del trapianto 15. E 'ben noto che la segnalazione di percorsi metabolici giocano un ruolo critico nel dettare i risultati delle risposte delle cellule T 16. cellule T naive basano su fosforilazione ossidativa mitocondriale per generare l'energia necessaria per la sorveglianza immunitaria base. Però,dopo l'attivazione, le cellule T effettrici metabolicamente riprogrammare per glicolisi aerobica e mostrano un aumento del metabolismo della glutammina 16,17. Utilizzando Balb / c come donatori e C57BL / 6 come destinatari, abbiamo osservato che l'inibizione glicolisi e fosforilazione ossidativa metabolismo (2DG + metformina) o glutammina da sola (DON) prolungato con la pelle del trapianto di sopravvivenza, ma bloccando i tre percorsi contemporaneamente ha portato in modo significativo, aumento del trapianto sopravvivenza (Figura 3C). Inoltre, la terapia metabolica tripla era più efficace di ciclosporina convenzionale o rapamicina (Figura 3A e B). accettazione permanente non è stato raggiunto, e ulteriori strategie, tra cui la terapia esaurimento, costimulation blocco, o nuove terapie metabolici, può favorire una migliore induzione della tolleranza del trapianto. Tuttavia, lo studio ha fornito due nuovi approfondimenti: l'uso di inibitori non specifici per colpire le cellule immunitarie selettive con aumentate richieste metaboliche, nonché il requisito t o bloccare i tre percorsi metabolici contemporaneamente per ottenere immunosoppressione più robusto nel rigetto del trapianto.
inibitori della calcineurina e bersaglio della rapamicina nei mammiferi (mTOR inibitori) costituiscono la maggior parte della terapia immunosoppressiva convenzionale utilizzato nei trapianti clinica. i tassi di sopravvivenza del trapianto mediani dei Balb / c per C57BL / 6 trapianti di pelle trattati con ciclosporina e rapamicina sono stati 17 e 16 giorni, rispettivamente. In confronto, i destinatari trattati con inibitori metabolici che inibiscono la glicolisi delle cellule T, fosforilazione ossidativa mitocondriale e metabolismo della glutammina avevano prolungato la sopravvivenza: la sopravvivenza del trapianto mediana è stata di 29 giorni. Inoltre, l'istologia di innesti cutanei del gruppo di terapia metabolica esposto allineamento dei tessuti più intatti e meno infiltrato infiammatorio linfocitica (Figura 4).
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Figura 1: Il rivestimento della Graft con il bendaggio. Graft (A) Pelle posizionato sul tronco destra. (B) fasciatura fornito con una garza piegato e due strisce bende plastica. Mouse (C) Destinatario posta sulla garza. (DF) Bandage avvolto intorno al mouse. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Skin Graft Aspetto durante acuta e rigetto cronico. (A) Balb / c per C57BL / 6 (mancata corrispondenza completa) il trapianto a tutto spessore della pelle, senza evidenza di rifiuto (giorno 8). (B) Balb / c per C57BL / 6 trapianto di pelle a tutto spessore con il 50% rigetto del trapianto (giorno 13). (C) Balb / c per C57BL / 6 trapianto a tutto spessore della pelle con il rigetto del trapianto completo (giorno 18). (D) il trapianto di pelle a tutto spessore Singenico (giorno 8). Il trapianto (E) Singenico a tutto spessore della pelle (giorno 30). (F) C57BL / 10 a C57BL / 6 (mancata corrispondenza minore) il trapianto a tutto spessore della pelle con rigetto cronico (giorno 100). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Balb / c per C57BL / 6 Pelle sopravvivenza del trapianto. (A) Il trattamento con ciclosporina (25 mg / kg QD). (B) Il trattamento con rapamicina (3 mg / kg QD). (C) Il trattamento con inibitori metabolici, 2-deossi-D-glucosio (2DG) 500mg / kg QD, metformina 150 mg / kg QD, e 6-diazo-5-oxo-L-norleucina (DON) 1,6 mg / kg QOD. Tutti i trattamenti sono stati somministrati dal giorno del trapianto fino a rifiuto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: ematossilina e eosina (a destra, X100, sinistra, X200) di pelle innesta con metabolica terapia postoperatoria al 7 ° giorno. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Dalla sua introduzione da Medawar, prima in studi sull'uomo e poi nei conigli e topi, il trapianto di pelle è stato un modello prezioso per lo studio delle risposte immunitarie allogeniche 6,7. In questo manoscritto, vi presentiamo un modello di grandi dimensioni, non vascolarizzato, il trapianto a tutto spessore della pelle con la pelle posteriore superiore e inferiore. Vari metodi alternativi, tra cui l'uso della pelle coda o la pelle dell'orecchio del mouse come fonte innesto di tessuto, sono stati segnalati fino ad oggi 8,9. Questi modelli presentano il vantaggio della semplicità tecnica e consentono il throughput alto volume. Il deficit relativo di cellule di Langerhans epidermiche e cellule dendritiche dermiche in trapianti di pelle coda, tuttavia, porta a ritardo rifiuto nonché all'accettazione innesto facilitato dall'host, particolarmente in minori modelli disallineamento MHC 10,11. Pertanto, tutto spessore innesto cutaneo tronco è considerato un modello più robusto e più adatto per lo studio delle cellule T-mediaTed rigetto acuto 12.
Inoltre, il nostro modello utilizza tecniche semplici e non richiede abilità microchirurgia avanzata. Il tempo di funzionamento è breve (~ 10 min per mouse dal l'insorgenza di anestesia al completamento della procedura), e la morbilità e la mortalità postoperatoria è trascurabile. La mortalità operatoria globale (morte entro 24 ore dopo l'intervento chirurgico più la morte prima della rimozione del bendaggio) è stato segnalato per essere 3,8% 13. La maggior parte delle complicazioni derivano da overdose di anestesia o bende eccessivamente restrittivi, che può essere facilmente prevenuta con un attento monitoraggio della funzione respiratoria durante il periodo post-operatorio immediato e da una rapida rimozione del bendaggio ai primi segni di distress respiratorio 6,17.
Il fattore più critico nel processo di attecchimento è la rivascolarizzazione del tessuto dell'innesto dalla crescita interna dei vasi di accoglienza per l'innesto 6. La pelle raccolto richiedes preparazione accurata, e la dissezione del carnosus pannicolo è un passaggio fondamentale. Preferiamo rimuovere le carnosus Pannicolo al microscopio. Si raccomanda di iniziare la dissezione da uno dei bordi e per avanzare lentamente spingendo il muscolo separandola dalla pelle con la lama di un tenotomia curva leggermente inclinato. Il sito del letto innesto dovrebbe essere lontano da articolazioni e la colonna vertebrale. Prima di effettuare incisioni nel mouse ricevente, la spalla e l'anca devono essere spostati per visualizzare le pieghe della pelle che contribuiscono a delimitare il livello delle articolazioni. Quando si rimuove la pelle ricevente, è importante per evitare di danneggiare i vasi sanguigni che corrono superficiale al carnosus panniculus. In caso di emorragia, applicare la compressione locale e rimuovere il sangue e coaguli che possono interferire con l'attecchimento. Infine, il bendaggio non dovrebbe causare difficoltà respiratorie che il recupero compromesso, anche se deve essere sufficientemente limitano a impedire lo spostamento del trapianto e auto-muventila- durante il processo di rivascolarizzazione. Strisce di plastica cerotti sono aderenti e abbastanza forte per questo scopo. Uniamo due bende per avvolgere completamente i waist mouse e per consentire il posizionamento di una garza piegata tra la benda e l'innesto (figura 1). Il bendaggio viene rimosso tagliando la parte ventrale di esso, e il resto viene rimosso dall'animale, al fine di evitare di interrompere l'innesto nel tentativo di rimuovere il bendaggio manualmente.
In sintesi, il trapianto tutto spessore della pelle è un modello ben consolidato con abbondanti riferimenti nella letteratura. La procedura è facile da eseguire, il tempo di funzionamento è breve, e le complicazioni postoperatorie sono limitati. I punti critici sono riportate meticolosa raccolta pelle donatore e il corretto posizionamento del bendaggio destinatario. Gli studi futuri che coinvolgono biomateriali che promuovono l'angiogenesi e la riparazione dei tessuti possono migliorare ulteriormente il tasso di successo della procedura.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concedere R01AI077610.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro forceps | Sigma | F4017 | |
| Curved micro forceps | Aesculap | BD333R | |
| Curved Stevens tenotomy scissors | Aesculap | BC905R | |
| Mayo dissecting scissors | Sigma | S3146 | |
| Micro needle holder | Aesculap | BM563R | |
| Sterile gauze | Covidien | 441218 | |
| 6-0 Nylon suture | MWI | 31849 | |
| Plastic Strips Band-Aid | Johnson & Johnson | Obtained from pharmacy | |
| 10 cm Petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| PBS | Quality Biological | 119069131 | |
| Buprenorphine | DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy | ||
| Enrofloxacin | Bayer Health Care | 186599 |
References
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. J Vis Exp. , (2016).
- Oh, B., et al. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J Vis Exp. , (2016).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , e50753 (2014).
- Jones, T. R., Shirasugi, N., Adams, A. B., Pearson, T. C., Larsen, C. P. Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts. J Clin Invest. 112, 1714-1723 (2003).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17, 744-749 (2011).
- Medawar, P. B. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits: A report to the War Wounds Committee of the Medical Research Council. J Anat. 78, 176-199 (1944).
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B., Sparrow, E. M. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. I. The survival times of skin homografts exchanged between members of different inbred strains of mice. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 143, 43-58 (1954).
- Garrod, K. R., Cahalan, M. D.
- Schmaler, M., Broggi, M. A., Rossi, S. W. Transplantation of tail skin to study allogeneic CD4 T cell responses in mice. J Vis Exp. , e51724 (2014).
- Bergstresser, P. R., Toews, G. B., Gilliam, J. N., Streilein, J. W. Unusual numbers and distribution of Langerhans cells in skin with unique immunologic properties. J Invest Dermatol. 74, 312-314 (1980).
- Chen, H. D., Silvers, W. K. Influence of Langerhans cells on the survival of H-Y incompatible skin grafts in rats. J Invest Dermatol. 81, 20-23 (1983).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a015495 (2013).
- Mayumi, H., Nomoto, K., Good, R. A. A surgical technique for experimental free skin grafting in mice. Jpn J Surg. 18, 548-557 (1988).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S.
- Lee, C. F., et al. Preventing Allograft Rejection by Targeting Immune Metabolism. Cell reports. 13, 760-770 (2015).
- Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342, 1242454 (2013).
