Summary
Murine full tykkelse hud transplantasjon er en veletablert modell for å studere avslag i en alloimmun omgivelser. Her gir vi en tutorial av hvert trinn er involvert i å utføre et BALB / c -> C57BL / 6 full tykkelse hud transplantasjon.
Abstract
Murine full tykkelse hud transplantasjon er en godt etablert in vivo modell for å studere alloimmun respons og transplantat avvisning. Til tross for sin begrensede søknad til mennesker, har hud transplantasjon hos mus vært mye brukt for transplantasjon forskning. Fremgangsmåten er enkel å lære og utføre, og det krever ikke delikate mikrokirurgiske teknikker eller omfattende opplæring. Dessuten, graft avvisning i denne modellen skjer på en meget reproduserbar immunologisk reaksjon, og blir lett overvåket ved direkte inspeksjon og palpasjon. I tillegg kan sekundær hud transplantasjon med donor-matchet eller tredjeparts hud grafts utføres på flere komplekse transplanterte modeller som et alternativ og ukomplisert metode for å vurdere donor-spesifikke toleranse. Komplikasjoner er lav og er generelt begrenset til anestesi overdose eller åndenød etter inngrepet. Graft svikt, på den annen side, forekommer ofte som et resultat av dårlig fremstilling av grakterut, uriktig posisjonering i transplantatet sengen, eller uhensiktsmessig plassering av bandasjen. I denne artikkelen presenterer vi en protokoll for full tykkelse hud transplantasjon hos mus og beskrive viktige skritt som er nødvendige for en vellykket prosedyre.
Introduction
Organtransplantasjon er behandling av valg for pasienter med sluttstadiet organsvikt, og resultatene har bedret seg bemerkelsesverdig med utviklingen innen kirurgiske prosedyrer og immunsuppresjonsteknikker protokoller. Imidlertid er langsiktig immunsuppresjon forbundet med betydelige bivirkninger, og utvikling av nye strategier som fremmer toleranse er fortsatt målet for moderne transplantasjon forskning.
Mange dyremodeller har blitt utviklet for grunnforskning i transplantasjon, for å studere mekanismene for allotransplantatavvisning og for å teste immunsuppresjon tilnærminger for å hindre avstøting av transplantat og for å fremme langsiktig toleranse 1-3. Musemodeller har blitt den viktigste immunologiske forskning på grunn av det eksklusive og store tilgjengeligheten av diagnostiske og terapeutiske antistoffer og veldefinerte innavlede og transgene stammer. Skin transplantasjon er en enkel prosedyre som ikke krever spesielle mikroferdigheter og kanenkelt overvåkes postoperativt. Til sammen har mus hud transplantasjon vært en eksepsjonell verktøy for å studere mange aspekter involvert i alloimmun respons, inkludert antigen levering, celle trafficking, og ødeleggelse vev under pode avvisning 4,5.
Her viser vi trinn-for-trinn fremgangsmåte for full tykkelse hudtransplantasjon ved hjelp av musemodellen, og vi beskriver de viktige trinnene som er nødvendige for en vellykket innpoding av den transplanterte huden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i National Institute of Health (NIH), og ble godkjent av Johns Hopkins University Animal Care og bruk Committee (JHUACUC). De spesifikke prosedyrer ble utført under godkjente ACUC protokoller MO13M292 og MO13M370.
1. Donor Skin Harvests
- Anesthetize donor mus med isofluran (induksjon fordamper ved 4%, vedlikehold på 1-2% gjennom mus kjegle). Bruk tå klype uttak refleks for å overvåke anestesidybden.
- Ved hjelp av en elektrisk barbermaskin, barbere ryggen av dyret og desinfisere det med 10% povidon-jod (som Betadine).
- Ved å bruke steril saks, hansker og aseptisk teknikk, innhøsting donor tilbake hud fra hoften til halsen, med sløv disseksjon ved nivået for den areolar bindevev.
- Avlive dyret ved halshugging etter høstinghudtransplantasjon.
- Under et mikroskop, skille bindevev, fettvev, og panniculus carnosus fra baksiden huden ved hjelp av gode tenotomy saks. Den panniculus carnosus er en tynn, gjennomsiktig muskler ansvarlig for hud rykninger bevegelser.
- Ved å bruke steril teknikk instrumenter, kuttet ut 15 mm x 15 mm implantater fra baksiden huden for en 10 mm x 10 mm til 15 mm x 15 mm pode seng.
- Oppbevar grafts på nettverksmaterialer fuktet med steril fosfatbufret saltløsning (PBS) i en petriskål på is.
MERK: 8 - 10 grafts kan fås fra en donor mus.
2. Mottaker Skin Transplant
- Anesthetize mottaker mus med isofluran (induksjon fordamper ved 4%, vedlikehold på 1-2% gjennom mus kjegle). Bruk tå klype uttak refleks for å overvåke anestesidybden.
- Administrer 0,02 mg / kg kroppsvekt av Buprenorfin for postoperativ smertelindring.
- Barbere side av ryggen av dyret, hvor transplantatet will være satt inn og desinfisere med 10% povidonjodid.
- Ved hjelp av saks, klippe en 10 mm x 10 mm til 15 mm x 15 mm kvadratet av huden. Feilen størrelse bør være litt større (10%) enn transplantatet. Skjær så overfladisk som mulig. Vær nøye med å bevare panniculus carnosus og fartøy. Den panniculus carnosus kan skilles fra den underliggende fascia av sin mobilitet og blodårene som kjører overfladisk til det.
- Plasser pode på pode sengen, unngå folder langs kantene.
- Plasser 8 sting på hjørnene og på midten av hver kant. For hver sutur, passerer nålen gjennom pode og deretter gjennom panniculus carnosus av graftet seng under den omkringliggende mottakeren huden.
- Fjern bedøvelse maske og la dyret komme seg delvis fra anestesi før påføring av selvklebende bandasje.
- Pakk mottakeren mus i et plaster med brettet gasbind over pode. Gjør bandasjen ved å kombinere to bandasjer, skjæringden klebende del av en og plassere de to absorberende puter sammen.
- Overvåk musen nøye under utvinning for å sikre at bandasjen ikke begrenser thorax ekskursjon og puste. Fjern bandasjen hvis respirasjonsfrekvens avtar eller dyret begynner å gispe eller pust grunt.
3. Postoperativ Care
- Administrer Enrofloxacin 5 mg / kg etter operasjonen for infeksjonsprofylakse.
- Plasser transplantert mus i et rent bur over en mikrobølge oppvarming puten før det fullt gjenoppretter fra anestesi.
- Observer mus for en time etter operasjonen før du returnerer den til boliger anlegget.
- Syv dager etter operasjonen, bedøve mus som i trinn 2.1. Fjerne bandasjen ved å skjære gjennom bare den ventrale side av bandasjen.
- Observer og palpere pode på den påfølgende dagen etter tegn til avskalling, sammentrekning, eller hardhet. Hvis til stede, kan pode ikke har oppnådd riktig vascularizasjon og bør betraktes som en teknisk svikt.
- Overvåk daglig for tegn på avvisning. Tenk grafts avvist når ≥90% av pode vev blir nekrotisk.
- Avlive avvist dyr og høste dem for analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Plasseringen av bandasjen på mottakerens mus er et viktig trinn i prosedyren. Den hudtransplantat er plassert på mottaker stammen, mellom skulderen, hofte, ryggrad og (figur 1). Bandasjen er laget med brettet gasbind og kombinasjonen av to plast plaster. Mottakeren mus blir plassert med den pode ned over gasbind på midten av bandasjen. Ved hjelp av to buede mikro tang, er den nedre ende av bandasjen trukket først, og deretter toppen av bandasjen vikles over musen til magen.
I komplett mismatch modeller, er full tykkelse hud grafts vanligvis avvist i 8 til 12 dager. I mindre mismatch modeller, avvisning svar er tregere, mer variable, og huden pode utseende er preget av mindre tydelige endringer, for eksempel sammentrekning eller tap av hår (figur 2). Akutt transplantat avvisning slekterlly begynner med hevelse og erytem på pode. Disse hendelsene blir fulgt av pode uttørking, krymping, og skorpedannelse (figur 2B og C). Avhengig av graden av MHC mistilpasning og den immunsuppresjon-protokollen, kan avvisning forekomme ved en subakutt prosess, preget av subtile endringer som tap av hår, pigmentering, dermal rygger, og pode volum. I disse tilfellene, vises et avvist pode skinnende, hvit, og hårløs, med ujevne kanter (figur 2f) 14.
Utnytte denne modellen av hud transplantasjon, undersøkte vi en ny tilnærming rettet mot T-celle metabolisme for å hindre avstøting av transplantat 15. Det er velkjent at metabolske signalveier spiller avgjørende roller i dikterer utfallet av T-celle responser 16. Naive T-celler er avhengige av mitokondriell oksidativ fosforylering å generere energi er nødvendig for grunnleggende immun overvåking. Derimot,ved aktivering, effektor T-celler metabolsk omprogrammere til aerob glykolyse og viser økt glutamin metabolisme 16,17. Bruke Balb / c som givere og C57BL / 6 som mottakere, vi observert at hemme glykolyse og oksidativ fosforylering (2DG + metformin) eller glutamin metabolisme alene (DON) forlenget hud pode overlevelse, men blokkerer de tre baner samtidig resultert i betydelig-økt pode overlevelse (Figur 3C). Videre trippel metabolsk terapi var mer effektiv enn konvensjonelle ciklosporin eller rapamycin (figur 3A og B). Permanent aksept ble ikke nådd, og videre strategier, inkludert uttømming terapi, ko-stimulering blokade eller nyere metabolske terapier, kan fremme bedre induksjon av transplantasjon toleranse. Men studien forutsatt to nye innsikter: bruk av ikke-spesifikke hemmere å målrette selektive immunceller med økt metabolske krav, samt krav t o blokkere de tre metabolske veier samtidig for å oppnå mer robust immunsuppresjon i pode avvisning.
Kalsineurinhemmere og mammalian target of rapamycin (mTOR-hemmere) utgjør det meste av konvensjonell immunsuppressiv behandling som brukes i klinisk transplantasjon. Median pode overlevelse av Balb / c til C57BL / 6 delhudstransplantat behandlet med ciklosporin og rapamycin var 17 og 16 dager, henholdsvis. Til sammenligning mottagere behandlet med metabolske inhibitorer som inhiberer T-celle-glykolyse, mitokondrisk oksidativ fosforylering, og glutamin metabolisme hadde forlenget overlevelse: medianen transplantatoverlevelse var 29 dager. Videre histologi av hudtransplantater fra metabolsk terapi gruppen oppviste mer intakt vev innretting og mindre lymfatisk inflammatorisk infiltrat (figur 4).
105 / 55105fig1.jpg "/>
Figur 1: Tildekking av Graft med bandasje. (A) Hudtranspl plasseres på høyre stammen. (B) bandasje laget med en brettet gasbind og to plast strimler bandasjer. (C) Mottaker mus plassert på gasbind. (DF) bandasje surret rundt musen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Skin Graft Utseende under akutte og kroniske avvisning. (A) Balb / c til C57BL / 6 (komplett mismatch) full-tykkelse hudtransplantasjon uten tegn på avvisning (dag 8). (B) Balb / c til C57BL / 6 full tykkelse hudtransplantasjon med 50% avstøting (dag 13). (C) Balb / c til C57BL / 6 full tykkelse hudtransplantasjon med fullstendig transplantatawisning (dag 18). (D) syngeniske full tykkelse hud transplantasjon (dag 8). (E) syngeniske full tykkelse hud transplantasjon (dag 30). (F) C57BL / 10 til C57BL / 6 (mindre mismatch) full-tykkelse hud transplantasjon med kronisk avstøting (dag 100). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Balb / c til C57BL / 6 Skin Graft Survival. (A) Behandling med cyklosporin (25 mg / kg en gang daglig). (B) Behandling med rapamycin (3 mg / kg QD). (C) Behandling med metabolske inhibitorer, 2-deoksy-D-glukose (2DG) 500mg / kg QD, metformin 150 mg / kg en gang daglig, og 6-diazo-5-okso-L-norleucin (DON) 1,6 mg / kg qod. Alle behandlinger ble administrert fra dagen for transplantasjon til avvisning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Hematoxylin og eosin Stain (høyre, X100, venstre, X200) av hud grafts med Metabolsk terapi ved Postoperativ Dag 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Siden introduksjonen av Medawar, først i humane studier og deretter i kaniner og mus, har hudtransplantasjon vært en uvurderlig modell for studiet av allogene immunresponser 6,7. I dette manuskriptet, presenterer vi en modell av store, ikke-vaskularisert, full-tykkelse hud transplantasjon med øvre og nedre del av ryggen huden. Ulike alternative fremgangsmåter, inkludert bruken av halen hud eller øre huden på mus som pode vev kilden, er blitt rapportert å date 8,9. Disse modellene presentere den klare fordelen av teknisk enkelhet og gir mulighet for høy-volum gjennomstrømming. Den relative mangel av epidermale Langerhans-celler og dendrittiske celler dermale i halen hudtransplantasjoner, men fører til forsinket avvisning, så vel som for å mulig pode aksept av verten, spesielt i mindre MHC mismatch modeller 10,11. Derfor er full tykkelse trunk hudtransplantasjon ansett som en mer robust modell og mer egnet til å studere T-celle-mediated akutt avstøting 12.
I tillegg vår modell benytter enkle teknikker og krever ikke avanserte mikroferdigheter. Driftstiden er kort (~ 10 min per mus fra starten av anestesi til gjennomføring av prosedyren), og den postoperative sykelighet og dødelighet er ubetydelig. Den samlede operative dødelighet (død innen 24 timer etter operasjonen pluss døden før fjerning av bandasjen) har blitt rapportert å være 3,8% 13. De fleste av de komplikasjoner oppstår fra anestesi overdose eller altfor restriktive bandasjer, som lett kan forebygges ved tett oppfølging av lungefunksjon under den umiddelbare postoperative perioden, og ved rask fjerning av bandasjen på de tidligste tegn på åndenød 6,17.
Den mest kritiske faktor i prosessen med innpoding er revaskularisering av pode vevet ved at det gror av vertfartøy for å pode 6. Den høstet hud trengers grundige forberedelser, og disseksjon av panniculus carnosus er et kritisk punkt. Vi foretrekker å fjerne de panniculus carnosus under et mikroskop. Det er anbefalt å starte disseksjon fra en av kantene, og for å fremme langsomt ved å skyve muskel og skiller den fra huden med bladet av en buet tenotomy vinklet. Stedet for pode sengen bør være langt fra ledd og ryggraden. Før lage skår i mottakeren mus, bør skulderen og hoften bli flyttet for å visualisere hudfolder som bidrar til å avgrense nivået av leddene. Når du fjerner mottaker huden, er det viktig å unngå å skade blodårene som går overfladisk til panniculus carnosus. Hvis blødningen oppstår, gjelder lokal kompresjon og fjerne blod og blodpropper som kan forstyrre engraftment. Til slutt bør bandasjen ikke føre til pustevansker som kompromiss utvinning, selv om det må være tilstrekkelig konstriktiv for å forhindre forskyvning av graftet og auto-mutilation under prosessen med revaskularisering. Plastic Strips Band-Aids er tilhenger og sterk nok til dette formålet. Vi kombinerer to bandasjer for fullstendig å vikle musen midjen og å tillate plassering av en foldet gasbind mellom bandasjen og pode (figur 1). Bandasjen fjernes ved å kutte den ventrale side av den, og resten fjernes ved hjelp av dyret, for å unngå å forstyrre implantatet under forsøk på å fjerne bandasjen manuelt.
I sammendraget, full-tykkelse hud transplantasjon er en veletablert modell med rikelig referanser i litteraturen. Fremgangsmåten er lett å utføre, er driftstiden kort, og de postoperative komplikasjoner er begrenset. De kritiske trinn er knyttet til nitid donor hud høst og riktig plassering av mottakeren bandasje. Fremtidige studier med biomaterialer som fremmer angiogenese og reparasjon av vev kan ytterligere forbedre suksessen rate av prosedyren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av NIH stipend R01AI077610.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro forceps | Sigma | F4017 | |
| Curved micro forceps | Aesculap | BD333R | |
| Curved Stevens tenotomy scissors | Aesculap | BC905R | |
| Mayo dissecting scissors | Sigma | S3146 | |
| Micro needle holder | Aesculap | BM563R | |
| Sterile gauze | Covidien | 441218 | |
| 6-0 Nylon suture | MWI | 31849 | |
| Plastic Strips Band-Aid | Johnson & Johnson | Obtained from pharmacy | |
| 10 cm Petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| PBS | Quality Biological | 119069131 | |
| Buprenorphine | DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy | ||
| Enrofloxacin | Bayer Health Care | 186599 |
References
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. J Vis Exp. , (2016).
- Oh, B., et al. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J Vis Exp. , (2016).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , e50753 (2014).
- Jones, T. R., Shirasugi, N., Adams, A. B., Pearson, T. C., Larsen, C. P. Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts. J Clin Invest. 112, 1714-1723 (2003).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17, 744-749 (2011).
- Medawar, P. B. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits: A report to the War Wounds Committee of the Medical Research Council. J Anat. 78, 176-199 (1944).
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B., Sparrow, E. M. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. I. The survival times of skin homografts exchanged between members of different inbred strains of mice. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 143, 43-58 (1954).
- Garrod, K. R., Cahalan, M. D.
- Schmaler, M., Broggi, M. A., Rossi, S. W. Transplantation of tail skin to study allogeneic CD4 T cell responses in mice. J Vis Exp. , e51724 (2014).
- Bergstresser, P. R., Toews, G. B., Gilliam, J. N., Streilein, J. W. Unusual numbers and distribution of Langerhans cells in skin with unique immunologic properties. J Invest Dermatol. 74, 312-314 (1980).
- Chen, H. D., Silvers, W. K. Influence of Langerhans cells on the survival of H-Y incompatible skin grafts in rats. J Invest Dermatol. 81, 20-23 (1983).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a015495 (2013).
- Mayumi, H., Nomoto, K., Good, R. A. A surgical technique for experimental free skin grafting in mice. Jpn J Surg. 18, 548-557 (1988).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S.
- Lee, C. F., et al. Preventing Allograft Rejection by Targeting Immune Metabolism. Cell reports. 13, 760-770 (2015).
- Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342, 1242454 (2013).
