Summary
transplante de pele de espessura total murino é um modelo bem estabelecido para estudar a rejeição em um ambiente alloimmune. Aqui, nós fornecemos um tutorial de cada etapa envolvida na realização de um / c BALB -> C57BL / 6 transplante de pele de espessura total.
Abstract
O transplante de pele de espessura total de murino é um modelo bem estabelecido para o estudo in vivo de resposta aloimune e rejeição de enxerto. Apesar da sua aplicação limitada a seres humanos, o transplante de pele em ratinhos tem sido amplamente utilizada para a pesquisa em transplantes. O procedimento é fácil de aprender e executar, e não requer técnicas de microcirurgia delicada, nem treinamento extensivo. Além disso, a rejeição do enxerto neste modelo ocorre em uma reacção imunológica muito reprodutível e é facilmente monitorizado por inspecção e palpação directa. Além disso, o transplante de pele secundário combinados com enxertos de pele de doadores ou de terceiros pode ser realizada em modelos de transplante mais complexos como um método alternativo e simples para avaliar a tolerância específica do dador. As complicações são baixos e são, em geral, limitado a uma overdose de anestesia ou angústia respiratória após o procedimento. falha do enxerto, por outro lado, ocorre geralmente como um resultado da má preparação da Grpopa, posicionamento incorreto no leito do enxerto, ou posicionamento inadequado de o curativo. Neste artigo, apresentamos um protocolo para o transplante de pele de espessura total em ratos e descrever os passos importantes necessários para o sucesso do procedimento.
Introduction
O transplante de órgãos é o tratamento de escolha para pacientes com casos de insuficiência terminal de órgãos, e os resultados têm melhorado notavelmente com os avanços em procedimentos cirúrgicos e protocolos de imunossupressão. No entanto, a imunossupressão a longo prazo está associada a efeitos colaterais significativos, e o desenvolvimento de novas estratégias que promovem a tolerância continua a ser o objectivo da investigação moderna transplante.
Numerosos modelos animais têm sido desenvolvidos para a pesquisa básica em transplante, para estudar os mecanismos da rejeição do enxerto e para testar se aproxima de imunossupressão para a prevenção da rejeição de enxertos e para promover a tolerância a longo prazo 1-3. mouse modelos tornaram-se o esteio da pesquisa imunológica devido à disponibilidade exclusiva e vasta de anticorpos diagnósticos e terapêuticos e estirpes puras e transgênicas bem definidas. transplante de pele é um procedimento simples que não requer habilidades especiais de microcirurgia e podeser facilmente monitorizado no pós-operatório. Tomados em conjunto, o transplante de pele de ratinho tem sido uma ferramenta excepcional para estudar muitos aspectos envolvidos na resposta aloimune, incluindo a entrega de antigénio, o tráfico de células, e a destruição do tecido durante a rejeição de enxerto de 4,5.
Aqui, mostramos o procedimento passo-a-passo para o transplante de pele de espessura total utilizando o modelo de rato, e descrevemos as etapas importantes necessárias para um enxerto bem-sucedida da pele transplantada.
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Protocol
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde (NIH) e foram aprovados pela Comissão de Johns Hopkins University animal Cuidado e Uso (JHUACUC). Os procedimentos específicos foram realizados sob a MO13M292 protocolos ACUC aprovado e MO13M370.
1. Donor Colheita da pele
- Anestesiar o rato doador com isoflurano (vaporizador de indução a 4%, manutenção a 1 - 2% através do cone mouse). Use o dedo retirada pitada reflexo para monitorizar a profundidade de anestesia.
- Usando uma máquina de barbear, a barba do dorso do animal e desinfecção com 10% de iodo de povidona (por exemplo, Betadine).
- Com uma tesoura estéril, luvas e técnica asséptica, colheita doador de pele de volta a partir do quadril para o pescoço, com dissecção romba ao nível do tecido conjuntivo areolar.
- Eutanásia do animal por deslocamento cervical após a colheita daenxerto de pele.
- Sob um microscópio, separar o tecido conjuntivo, tecido adiposo, e panículo carnoso da pele do dorso utilizando tesouras finas Tenotomia. O panículo carnoso é um músculo fino e transparente responsáveis por movimentos espasmos pele.
- Utilizando uma técnica estéril instrumentos, cortar enxertos de 15 mm x 15 mm a partir da pele de volta para uma de 10 mm x 10 mm para a cama enxerto de 15 mm x 15 mm.
- Armazenar os enxertos em gazes impregnadas com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) numa placa de petri em gelo.
NOTA: 8 - 10 enxertos pode ser obtido a partir de um rato dador.
Transplante de pele 2. Destinatário
- Anestesiar o mouse destinatário com isoflurano (vaporizador de indução a 4%, manutenção a 1 - 2% através do cone mouse). Use o dedo retirada pitada reflexo para monitorizar a profundidade de anestesia.
- Administrar 0,02 mg / kg de peso corporal de buprenorfina para o alívio da dor pós-operatória.
- Raspar o lado das costas do animal, onde o wi enxertoll ser inserido e desinfectar com 10% de iodopovidona.
- Com uma tesoura, corte de 10 mm x 10 mm a 15 mm x 15 mm quadrado de pele. O tamanho de defeito deve ser ligeiramente maior (10%) do que o enxerto. Corte o mais superficialmente possível. Tome cuidado para preservar o panículo carnoso e vasos. O panículo carnoso pode ser distinguida da fáscia subjacente por sua mobilidade e os vasos sanguíneos superficiais que executam a ele.
- Posicionar o enxerto no leito de enxerto, evitando dobras ao longo das bordas.
- Coloque 8 suturas nos cantos e no meio de cada borda. Para cada fio de sutura, a agulha passar através do enxerto e, em seguida, através do panículo carnoso do enxerto de leito inferior a pele circundante destinatário.
- Retire a máscara de anestésico e deixar o animal recuperar parcialmente da anestesia antes de aplicar a bandagem adesiva.
- Enrole o mouse destinatário em uma bandagem adesiva com gaze dobrada sobre o enxerto. Faça o curativo pela combinação de duas ataduras, cortandoa parte adesiva de um e colocando as duas almofadas absorventes em conjunto.
- Monitorar o mouse de perto durante a recuperação para garantir que o curativo não está restringindo tórax excursão e respirar. Remover o curativo, se a taxa respiratória diminui ou o animal começa a ofegar ou respiração superficial.
3. Cuidados Pós-Operatórios
- Administrar enrofloxacina 5 mg / kg após a cirurgia para a profilaxia da infecção.
- Posicione o mouse transplantado em uma gaiola limpa sobre uma almofada de aquecimento no forno até que se recupere totalmente da anestesia.
- Observe o mouse por 1 hora de pós-operatório antes de retornar para a instalação de habitação.
- Sete dias após a cirurgia, anestesiar o rato como no Passo 2.1. Remover o curativo, cortando apenas através do lado ventral do curativo.
- Observar e palpar o enxerto no dia seguinte para sinais de formação de crostas, contração ou dureza. Se estiver presente, o enxerto pode não ter alcançado vasculariza adequadação e deve ser considerada uma falha técnica.
- Monitorizar diariamente quanto a sinais de rejeição. Considere enxertos rejeitada quando ≥90% do tecido do enxerto torna-se necrótica.
- Eutanásia dos animais rejeitados e colhê-las para análise.
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Representative Results
A colocação do curativo sobre o mouse destinatário é um passo importante do processo. O enxerto de pele é posicionada no tronco recipiente, entre o ombro, anca e espinha (Figura 1). A ligadura é feita com gaze dobrada e a combinação de duas ataduras adesivas de plástico. O rato receptor é colocado com o enxerto para baixo sobre a gaze sobre o centro da ligadura. Usando dois micro pinças curvas, a extremidade inferior da ligadura é primeiro removido, e em seguida, a parte superior da faixa é enrolado sobre o rato para o abdómen.
Em modelos de desadaptação completas, de espessura total enxertos de pele são geralmente rejeitada em 8 a 12 dias. Em modelos de incompatibilidade de menores, respostas de rejeição são mais lentos, mais variável, e o aparecimento de enxerto de pele é caracterizada por mudanças menos distintas, tais como contração ou perda de cabelo (Figura 2). aguda do enxerto rejeição gêneroslly começa com edema e eritema do enxerto. Estes eventos são seguidos por dessecação do enxerto, o encolhimento e formação de crosta (Figura 2B e C). Dependendo do grau de MHC de incompatibilidade e o protocolo de imunossupressão, a rejeição pode ocorrer por um processo subaguda, marcada por alterações subtis tais como perda de cabelo, pigmentação, sulcos dérmicos, e volume do enxerto. Nestes casos, um enxerto rejeitado aparece brilhante, branco e calvo, com bordas irregulares (Figura 2F) 14.
Utilizando este modelo de transplante de pele, foi investigada uma abordagem nova segmentação metabolismo das células T para evitar a rejeição do enxerto 15. É bem conhecido que as vias de sinalização metabólicas desempenham papéis críticos na ditar os resultados de respostas de células T 16. células T naive contar com a fosforilação oxidativa mitocondrial para gerar a energia necessária para a vigilância imunológica básica. Contudo,após a activação, as células T efectoras metabolicamente reprogramar a glicólise aeróbica e exibem metabolismo aumentado de glutamina 16,17. Usando Balb / c como doadores e C57BL / 6 como destinatários, observou-se que a inibição da glicólise e fosforilação oxidativa metabolismo (2DG + metformina) ou glutamina sozinho (DON) prolongou a sobrevivência do enxerto de pele, mas bloqueando as três vias simultaneamente resultou em significativamente-aumento do enxerto sobrevivência (Figura 3C). Além disso, a terapêutica tripla metabólica foi mais eficaz do que a ciclosporina ou rapamicina convencional (Figura 3A e B). aceitação permanente não foi alcançada, e novas estratégias, incluindo a terapia de depleção, o bloqueio co-estimulação, ou terapias metabólicas mais recentes, podem promover uma melhor indução de tolerância de transplante. No entanto, o estudo forneceu duas novas perspectivas: a utilização de inibidores não-específicos para alvejar células imunitárias selectivos, com aumento das exigências metabólicas, bem como o requisito de t o bloquear os três vias metabólicas, simultaneamente, obter imunossupressão mais robusto na rejeição do enxerto.
Os inibidores de calcineurina e alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) inibidores constituem a maior parte da terapia imunossupressora convencional utilizado em transplantes clínicos. as taxas de sobrevivência de enxerto medianos de Balb / c para C57BL / 6 transplantes de pele tratados com ciclosporina e rapamicina foram 17 e 16 dias, respectivamente. Em comparação, os animais recebedores tratados com inibidores metabólicos, que inibem a glicólise das células T, a fosforilação oxidativa mitocondrial, e metabolismo de glutamina tinha prolongada sobrevivência: a sobrevivência do enxerto mediano foi de 29 dias. Além disso, a histologia dos enxertos de pele a partir do grupo de terapia metabólica exibiram alinhamento mais tecido intacto e menos infiltração inflamatória linfocítica (Figura 4).
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Figura 1: Cobertura do enxerto com o curativo. Enxerto (A) Pele colocado no tronco direita. (B) Ligadura feita com uma gaze dobrada e duas tiras de plástico ligaduras. Rato (C) Destinatário colocado sobre a gaze. (DF) atadura envolvida em torno do mouse. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Skin Graft aparição durante aguda e rejeição crónica. (A) Balb / c para C57BL / 6 (incompatibilidade completa) transplante de pele de espessura total, sem evidência de rejeição (dia 8). (B) Balb / c para C57BL / 6 transplante de pele de espessura total com 50% de rejeição do enxerto (dia 13). (C) Balb / c com 6 transplante de pele C57BL / de espessura total com a rejeição do enxerto completo (dia 18). (D) o transplante de pele de espessura total Singênico (dia 8). Transplante de (E) Singênico de espessura total da pele (dia 30). (F) C57BL / 10 a C57BL / 6 (incompatibilidade menor) transplante de pele de espessura total com a rejeição crônica do enxerto (dia 100). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Balb / c para ratinhos C57BL / 6 de sobrevivência do enxerto de pele. (A) O tratamento com ciclosporina (25 mg / kg QD). (B) tratamento com rapamicina (3 mg / kg QD). (C) O tratamento com inibidores metabólicos, 2-desoxi-D-glucose (2DG) 500mg / kg QD, metformina 150 mg / kg QD, e 6-diazo-5-oxo-L-norleucina (DON) 1,6 mg / kg QOD. Todos os tratamentos foram administrados a partir do dia do transplante até à rejeição. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: hematoxilina e eosina (à direita, X100; à esquerda, X200) da Pele Os enxertos com terapia metabólica no pós-operatório Dia 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Desde a sua introdução por Medawar, primeiro em estudos humanos e, em seguida, em coelhos e ratinhos, o transplante de pele tem sido um modelo de valor inestimável para o estudo das respostas imunitárias alogénicas 6,7. Neste artigo, apresentamos um modelo de grande escala, o transplante de pele não-vascularizado de espessura total com a pele para trás superior e inferior. Vários métodos alternativos, incluindo o uso da pele da cauda ou da pele da orelha de rato como fonte de tecido do enxerto, foram relatados até agora 8,9. Esses modelos têm a vantagem distinta de facilidade técnica e permitir a transferência de alto volume. A deficiência relativa das células de Langerhans epidérmicas e células dendríticas dérmicas em enxertos de pele da cauda, no entanto, conduz à rejeição retardada, bem como a aceitação do enxerto facilitada pelo hospedeiro, em particular em modelos menores de desadaptação do MHC 10,11. Portanto, o enxerto de pele tronco de espessura total é considerado um modelo mais robusto e mais adequado para estudar células T mediated rejeição aguda 12.
Além disso, o nosso modelo emprega técnicas simples e não necessita de técnicas de microcirurgia avançada. O tempo de funcionamento é curto (~ 10 min por mouse a partir do início da anestesia para a realização do procedimento) e da morbidade e da mortalidade pós-operatória é insignificante. A mortalidade global (morte dentro de 24 horas após a cirurgia mais morte antes da remoção da ligadura) foi relatada como sendo 3.8% 13. A maioria das complicações surgem de overdose de anestesia ou ataduras excessivamente restritivas, o que pode ser facilmente prevenida pela cuidadosa monitorização da função respiratória durante o período pós-operatório imediato e pela rápida remoção do curativo nos primeiros sinais de dificuldade respiratória 6,17.
O fator mais crítico no processo de enxerto é a revascularização do tecido do enxerto pelo crescimento interno dos vasos do hospedeiro ao enxerto 6. A pele recolhida requeremé uma preparação cuidadosa e a dissecção do panículo carnoso é um passo crítico. Nós preferimos para remover os panículo carnoso sob um microscópio. Recomenda-se para iniciar a dissecção de uma das extremidades e para avançar lentamente, empurrando o músculo e separando-a da pele com a lâmina de uma curva em ângulo ligeiramente Tenotomia. O local do leito de enxerto deve ser medida a partir de articulações e da coluna vertebral. Antes de fazer incisões no rato receptor, o ombro e quadril deve ser movido para visualizar as dobras da pele que ajudam a delimitar o nível das articulações. Ao remover a pele destinatário, é importante para evitar danificar os vasos sanguíneos que funcionam superficial ao panículo carnoso. Se ocorrer sangramento, aplicar a compressão local e remover o sangue e coágulos que podem interferir com o enxerto. Finalmente, o curativo não deve causar dificuldades respiratórias que a recuperação compromisso, embora deva ser suficientemente constritiva para evitar o deslocamento do enxerto e auto-mutilação durante o processo de revascularização. Tiras de plástico Band-Aids são aderentes e forte o suficiente para esta finalidade. Nós combinamos duas ataduras para envolver completamente a cintura do mouse, para permitir a colocação de uma gaze dobrada entre o curativo e o enxerto (Figura 1). A ligadura é removida por corte do lado ventral do mesmo, e o restante é removido pelo animal, a fim de evitar a ruptura do enxerto durante a tentativa de remover a ligadura manualmente.
Em resumo, o transplante de pele de espessura total é um modelo bem estabelecido com referências abundantes na literatura. O procedimento é fácil de executar, o tempo de funcionamento é curto, e as complicações pós-operatórias são limitadas. As etapas críticas estão relacionadas com a colheita da pele do doador meticuloso e o posicionamento correto da bandagem destinatário. Futuros estudos envolvendo biomateriais que promovem a angiogênese e reparação de tecidos pode melhorar ainda mais a taxa de sucesso do procedimento.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01AI077610.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro forceps | Sigma | F4017 | |
| Curved micro forceps | Aesculap | BD333R | |
| Curved Stevens tenotomy scissors | Aesculap | BC905R | |
| Mayo dissecting scissors | Sigma | S3146 | |
| Micro needle holder | Aesculap | BM563R | |
| Sterile gauze | Covidien | 441218 | |
| 6-0 Nylon suture | MWI | 31849 | |
| Plastic Strips Band-Aid | Johnson & Johnson | Obtained from pharmacy | |
| 10 cm Petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| PBS | Quality Biological | 119069131 | |
| Buprenorphine | DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy | ||
| Enrofloxacin | Bayer Health Care | 186599 |
References
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