Productie en toediening van therapeutische mesenchymale stamcellen / Stromal Cell (MSC) sferoïden primer in 3-D Cultures Onder Xeno-free Voorwaarden

Abstract

Mesenchymale stamcellen / stromale cellen (MSC) houdt een grote belofte in biotechnologie en regeneratieve geneeskunde. MSC's kunnen uit verschillende volwassen weefsels worden geïsoleerd door hun sterke hechting aan weefselkweek plastic en vervolgens verder uitgebreid in vitro, meestal via foetaal runderserum (FBS). Omdat FBS kunnen veroorzaken MSCs op immunogene worden, zijn aanwezigheid in MSC kweken beperkt zowel klinische en experimentele toepassingen van de cellen. Daarom is het in dienst hebben studies chemisch gedefinieerde xeno-vrij (XF) media voor MSC culturen zijn zeer waardevol. Vele gunstige effecten van MSC's zijn toegeschreven aan hun vermogen om ontsteking en immuniteit regelen, vooral door secretie van immunomodulerende factoren zoals tumor necrosis factor-gestimuleerde gen 6 (TSG6) en prostaglandine E2 (PGE2). Echter, MSC's moeten worden geactiveerd om deze factoren produceren en omdat het effect van MSCs dikwijls voorbijgaande, grote belangstelling ontstaan ​​om manieren pre-activering van de cellen prio ontdekkenr het gebruik ervan, zodat het niet langer de vertragingstijd voor activering in vivo. Hier presenteren we protocollen om efficiënt te activeren of prime MSC's in de driedimensionale (3D) culturen onder chemisch welbepaald XF voorwaarden en deze pre-geactiveerde MSC's in vivo toe te dienen. In het bijzonder, we eerst beschrijven methoden om sferische MSC micro-weefsels of 'bolletjes' in opknoping druppels gebruik XF medium te genereren en laten zien hoe de sferen en geconditioneerd medium (CM) voor verschillende toepassingen kunnen worden geoogst. Ten tweede, beschrijven we genexpressie schermen en in vitro functionele testen om snel het niveau van MSC activering in sferoïden beoordelen, met nadruk op de anti-inflammatoire en anti-kanker potentieel van de cellen. Ten derde, beschrijven we een nieuwe methode om intacte MSC sferoïden injecteren in de peritoneale holte muis in vivo testen. Over het geheel genomen de protocollen hierin te overwinnen grote uitdagingen van het verkrijgen van pre-geactiveerde MSC onder chemisch welbepaald XF convoorwaarden en een flexibel systeem MSC sferoïden administreren therapieën.

Introduction

Mesenchymale stamcellen / stromale cellen (MSC) hebben laten zien een groot potentieel voor diverse regeneratieve geneeskunde benaderingen. MSCs werden aanvankelijk geïsoleerd als een stromale component van beenmerg maar zijn inmiddels verkregen zoveel andere volwassen weefsels, zoals vetweefsel ^{1, 2, 3.} Interessant is dat de belangrijkste isolatiewerkwijze omarmt de opmerkelijke eigenschap van MSCs strak hechten aan weefselkweek kunststof in de aanwezigheid van foetaal runderserum (FBS). Hoewel dit traditionele isolatietechniek maakt gemakkelijke en snelle expansie van MSCs in tweedimensionale (2D) cultuur, is ook erg kunstmatige en voorbij betekenis van de natieve driedimensionale (3D) omgeving waarvoor eventueel verlies van belangrijke cellulaire elementen ^{4, 5 , 6.} Daarom is de studie van MSCs in 3D culturen, diezijn meer fysiologische dan de traditionele 2D-culturen, is ontstaan ​​in de zoektocht naar "verloren / verminderd" MSC kenmerken. Bovendien heeft grote belangstelling gestegen tot xeno-vrij (XF) chemisch welbepaalde voorwaarden te identificeren voor MSC cultuur en activering, en zodoende de cellen meer vatbaar voor klinische toepassingen.

Veel studies zijn gepubliceerd waaruit de 3D cultuur van MSC's zowel in biomaterialen en als bolvormige aggregaten of sferoïden. MSCs in biomaterialen werden oorspronkelijk ontworpen voor weefselengineering om beschadigde weefsels te vervangen cel geplaatste steigers, terwijl sferoïde culturen van MSC's werden als manier om MSC gedrag in vivo na toediening van de cellen voor therapieën in preklinische of klinische proeven begrijpen ^{4, 5, 7.} Interessant is dat MSC vorm bolletjes spontaan bij hechting aan weefselkweek plastic is niet toegestaan^{8, 9, 10.} Traditioneel werd celaggregatie vergemakkelijkt door centrifugekolf methoden of vloeibare overlaytechnieken, die aanvankelijk zijn gebruikt in kankerbiologie bij pogingen om te proberen de tumor micro-omgeving nabootsen. Meer recent zijn andere methoden opgedoken die aantonen celaggregatie in kweekschalen vooraf gecoat met specifieke chemicaliën om cel-adhesie kunststof ^{4, 5, 6} voorkomen. Een van de eenvoudigste en goedkoopste methode MSC sferoïden te genereren is om ze in cultuur opknoping druppels, een techniek die vaak werd gebruikt om embryoiden organen uit embryonale stamcellen. Met opknoping druppel cultuur techniek wordt celhechting de weefselkweekkunststof voorkomen door suspenderen van de cellen in een medium druppel op de onderkant van een weefselkweekplaat deksel en waardoor zwaartekracht cel vergemakkelijken aggregatie in de top van de druppel. De sferoïde grootte kan gemakkelijk worden gemanipuleerd door het veranderen van de celconcentratie of druppelvolume, waardoor hangende druppel culturen bijzonder eenvoudig te bedienen.

Vroege studies op de 3D cultuur van MSC's aangetoond radicale verschillen in de eigenschappen van de cellen in 3D vergelijking met hun tegenhangers 2D ^{6, 8, 9.} Tegelijkertijd, rapporten aangetoond dat de gunstige effecten van MSC's in vivo gesteund op hun vermogen om geactiveerd door micro-omgevingsfactoren en in reactie worden, produceren anti-inflammatoire en immunomodulerende factoren ^11. Interessant, veel van deze factoren, zoals prostaglandine E2 (PGE2), tumornecrose-factor gestimuleerde gen 6 (TSG6) en hepatocyt groeifactor (HGF) werden geproduceerd in veel grotere hoeveelheden door MSC sferoïden dan traditionele 2D MSC weg vrijmaakt voor de idee vangebruiken 3D culturen naar cellen ^{8, 12, 13} te activeren. Bovendien genactivering in 3D culturen bleek mechanismen herhalen, ten minste gedeeltelijk, van celactivering na injectie in muizen ^12. Door het activeren van MSCs vóór hun gebruik in experimenten kunnen effecten van de cellen verlengd en prominent als de traditionele MSC effect in vivo vaak vertraagd en voorbijgaand en kan worden omschreven als "hit and run". Gedurende de afgelopen jaren belangrijke onderbouwd met MSC sferoïden hebben aangetoond dat zij ontstekingsreacties kunnen onderdrukken en moduleren immuniteit in vivo door beïnvloeding effectorcellen zoals macrofagen, dendritische cellen, neutrofielen, en T-cellen die sferoïden een aantrekkelijke vorm van geprimede MSCs ^{2 , 3.} Bovendien productie van anti-kanker moleculen, zoals interleukin-24 (IL-24) en tumor necrosis factor-gerelateerde apoptose inducerende ligand (TRAIL), zijn verhoogd bij 3D culturen van MSC's ten opzichte van MSC monolaag, een fenomeen dat kan worden benut voor gerichte kankertherapieën ^{8, 10, 14.}

Aangezien de traditionele cultuur MSC vereist niet alleen het gebruik van weefselkweek plastic maar FBS, andere hindernis MSC sferoïden ontvankelijker te maken voor klinisch gebruik moesten worden overwonnen. Om deze hindernis te pakken, hebben we onlangs toonde vorming van MSC sferoïden onder specifieke omstandigheden chemisch gedefinieerde XF en vastgesteld dat de verkregen MSC sferoïden werden geactiveerd met dezelfde anti-inflammatoire en anti-kanker moleculen als sferoïden gegenereerd onder omstandigheden met FBS ¹⁴ produceren. Hier worden deze bevindingen in een aantal gedetailleerde protocollen die de generatie van de pre-geactiveerde MSC's te tonen in 3D culturen met behulp XFmedia. Daarnaast zijn protocollen geleverd dat manieren om het activeringsniveaus van de MSC's met betrekking tot hun ontstekingsremmende, immunomodulerende en anti-kanker effecten te evalueren, alsmede een praktische methode om de intacte bolletjes geven in muizen beschreven.

Protocol

1. MSC Isolatie en uitbreiding

1. Verkrijgen vroege passage MSC's van Centrum voor de bereiding en verdeling van volwassen stamcellen ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ) ¹⁵ als bevroren flesjes. Als alternatief, isoleren MSCs uit beenmerg zuigt na een routine-protocol ¹⁴ en op te slaan als bevroren flesjes.
2. Bereid compleet cultuurmedium (CCM), die minimaal essentieel medium alfa (aMEM) gesupplementeerd met 15-20% premium selecteren FBS, 2 mM L-glutamine, en 1 x penicilline-streptomycine. Steriliseer het medium door filtratie.
3. Breng 30 ml CCM in een 150 mm kweekschaal cellen en incubeer de schaal gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met _5% CO2.
4. Incubeer de bevroren flacon ongeveer 10 ⁶ MSCs gedurende 2 min in een 37 ° C waterbad.
5. De inhoud van de ampul aan de kweekschaal met een 5 ml serologische pipet en was de cuvette enkele malen met 1-2 ml CCM van de schotel om achtergebleven cellen te vangen. Zet de schaal 's nachts in een geschikt incubator.
6. Was de cultuur tweemaal met kamertemperatuur fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en maak de MSC's met 3 ml voorverwarmde / ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) oplossing van 0,25% trypsine. Detachment duurt meestal ongeveer 3-4 min in de incubator.
7. Neutraliseer de trypsine in de schaal met 6 ml CCM voorverwarmd tot 37 ° C en breng de celsuspensie in een 50 ml conische buis. Combineer met wasbeurten PBS naar cel opbrengst te maximaliseren.
8. Centrifugeer de cellen (450 x g) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en zuig de supernatant.
9. Resuspendeer de cellen in een klein volume CCM en tel de levensvatbare cellen met een hemocytometer en trypan blauw.
10. Zaad een geschikt aantal van 150 mm schalen bij 100 cellen / ^cm2
11. Oogst de cellen zoals hierboven beschreven met trypsine / EDTA en combineren alle cellen in een conische buis met het geschikte medium. Centrifugeer opnieuw en resuspendeer de cellen in een klein volume van hetzelfde medium voor celtellingen. Gebruik standaard CCM (bevattende FBS) of diverse commercieel verkrijgbare XF mediumformuleringen, hier aangeduid als XF middellange-1 (XFM-1) en XF gemiddeld-2 (XFM-2), zowel met als zonder menselijke serumalbumine (HSA, 13 mg / ml) suppletie.

2. Voorbereiding van de geactiveerde MSC sferoïden in 3-D Opknoping Drop culturen onder XF Voorwaarden

1. Om sferoïden van ongeveer 25.000 cellen te verdunnen geoogst MSC's in CCM, XFM-1, XFM-1 + HSA (13 mg / ml), XFM-2 of XFM-2 + HSA (13 mg / ml) en 714 cellen / ul.
2. Pipetteer 35 ul / dalingen van de cellen opde onderkant van een omgekeerde kweekschaal deksel 150 mm. Meerdere druppels kunnen gemakkelijk worden gepipetteerd met behulp van een multichannel pipet.
   LET OP: Als groter of kleiner sferoïden gewenst zijn, verandert de cel concentratie of de daling van volume (25-45 pi) op ​​de juiste wijze.
3. Transfer 20 ml PBS kamertemperatuur in de basis van de schotel en in een continue en constante beweging draai de deksel met de druppels, waardoor de druppel toppen naar beneden wijst. Plaats het deksel voorzichtig op de bodem van de kweekschaal.
4. Breng het gerecht in de incubator voor 3 dagen zonder te storen passende sfeer montage mogelijk te maken.
5. Na 72 uur, beginnen de bolvormige oogst door voorzichtig het deksel te verwijderen en om te klappen, zodat de druppels opnieuw bovenzijde bevinden.
6. Hoek het deksel tot ongeveer 10-20 ° en duw de druppels, die de bolletjes, aan de plaat rand met behulp van een cel lifter.
7. Breng de bollen en medium in een 15 ml conische buis met een 1.000 III pijptte. Gebruik kamertemperatuur PBS en de pipet met dezelfde tip om de plaat te wassen en te zorgen voor een maximale herstel van de bolletjes.
8. Voor real-time PCR assays (protocol 3) Centrifugeer de bol suspensie bij 450 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en zuig de supernatant. Was de sferoïden met PBS en herhaal zowel de centrifugering en aspiratie stappen. Voor levering in dieren (protocol 8), laat bollen om zich te vestigen in de bodem van de buis (~ 3-4 min) zonder centrifugeren.

3. Realtime PCR of anti-inflammatoire en anti-kanker Markers

1. Met de RNA extractie kit met homogenisator kolommen en RNase-vrije DNase set DNA-vrij totaal RNA uit monolaag MSC's (Protocol 1) en MSC sferoïden (protocol 2) die werden gewassen met PBS en gecentrifugeerd isoleren.
2. Lyse tenminste 100.000 monolaag MSC en 20 sferoïden van elke conditie in afzonderlijke 15 ml conische buizen met RLT buffer die β-mercaptoethanol (1: 100).
3. Transfer de lysaten grondig gemengd in 1,5 ml RNase-vrij buizen en plaats in een vriezer (-80 ° C) gedurende ten minste 3 uur te helpen bij bolvormige lysis.
4. Ontdooi de lysaten op ijs, kort vortexen, en de instructies van de fabrikant voor RNA-isolatie met een algemeen verkrijgbare zoogdierlijke totale RNA isolatie kit.
5. Kwantificeren en de kwaliteit van het geïsoleerde RNA met een spectrofotometer te bepalen.
6. Met de hoge capaciteit cDNA Reverse Transcription Kit of gelijkwaardig volgens de instructies van de fabrikant om cDNA te genereren van real-time PCR.
7. Plaats cDNA monsters, commercieel gemaakt real-time PCR-primers / probes (Gene Expression Assays) en PCR Master Mix op ijs. Gebruik primers / probes voor GAPDH (controle), PTGS2 (COX-2, anti-inflammatoire), TNFAIP6 (TSG6, ontstekingsremmend), TRAIL (anti-kanker), en IL-24 (anti-kanker).
8. Bereid de real-time PCR reacties volgens de instructies van de fabrikant Gene Expression Assays en Fast Universal Master Mix.
9. Volg de richtlijnen voor de real-time PCR-instrument voor het genereren van het experiment documenten en het uitvoeren van de vlucht.
10. Analyseer de gegevens met de ΔΔC _T-werkwijze door de relatieve veranderingen (belangrijkheid, RQ) in genexpressie via GAPDH als endogene controle en monolaag MSCs als basis ^{8, 14.}

4. Het verzamelen van CM voor Testen van Immuunmodulerende en anti-kanker Potentiële

1. Oogst de sferoïden en CM zoals hierboven beschreven in een 15 ml conische buis, met behulp van een cel lifter en een pipet, maar zonder de schotel deksels niet wassen met PBS omdat dit de CM verdunt.
2. Centrifugeer bij 450 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, zorgvuldig verzamelen celvrije supernatant met een pipet, en breng het supernatans in 1,5 ml buizen.
3. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur, zorgvuldig verzamelen clarified CM met een pipet, en breng de CM in nieuwe 1,5 ml buizen voor opslag in een vriezer (-80 ° C). Aliquots van de CM vóór het invriezen als deze voor meerdere assays.
   Opmerking: alvorens met de stroomafwaartse testen, PGE2 concentratie, een goede indicatie van anti-inflammatoire potentieel van CM, kan worden bepaald met een commerciële ELISA-kit volgens de instructies van de fabrikant. TSG6 concentratie kan worden bepaald onder toepassing van een gepubliceerde protocol ^14.

5. macrofagen Assay aan de anti-inflammatoire potentieel van MSC-CM Assess

1. Bereid macrofaag medium bestaande uit Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met L-alanyl-L-glutamine en aangevuld met 10% FBS premium selecteren en 1 x penicilline-streptomycine. Filter-steriliseren van het medium.
2. Het verkrijgen van een bevroren flesje van ongeveer 10 ⁶ J774 muis macrofagen en incubeer het flesje gedurende 2 minuten in een 37 ° C waterbad.
3. Zuig het supernatant, schorten de macrofagen in 1 ml macrofaag medium, en de overdracht van de macrofagen in een 150 mm petrischaaltje met 30 ml van macrofagen medium.
4. Verander het medium elke 2 dagen en incubeer de cellen in de incubator tot ongeveer 70-80% confluent.
   LET OP: De macrofagen niet strak houden aan de petrischaal, dus zorg mag niet worden genomen om cellen te verliezen met een gemiddelde verandering.
5. Oogst de macrofagen door sproeien de macrofaag medium op de cellen met een pipet. Breng de cellen in een 50 ml conische buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200-300 xg en kamertemperatuur.
6. Zuig het supernatant en suspendeer de cellen in een kleine hoeveelheid macrofaag medium voor celtellingen met een hemocytometer. Stel de concentratie tot 200.000 cellen / ml met macrofaag meDIUM.
7. Om te beginnen met de set-up voor de macrofaag-test, voeg 480 ul van macrofagen medium in putjes van een 12-well plaat.
8. Voeg 20 ul van macrofagen medium in niet-gestimuleerde controleputjes toegevoegd en 20 pl niet-geconditioneerde of MSC-geconditioneerd medium, hierboven bereid, in experimentele putjes. Meng het medium in de putjes van de plaat te tikken.
9. Transfer 500 pi van de celsuspensie macrofaag de niet-gestimuleerde macrofaag controleputjes.
10. Stimuleren van de resterende macrofagen onder toevoeging van 1: 500-1: 1000 van 0,1 mg / ml lipopolysaccharide (LPS) en incubeer 5-10 minuten bij kamertemperatuur.
11. Transfer 500 ul van de gestimuleerde macrofagen in de putjes met niet-voorziene of MSC-geconditioneerd medium. Meng de putten door gestaag meerdere malen het schommelen van de plaat.
12. Breng de plaat naar een incubator voor 16-18 uur.
13. Oogst de macrofaag geconditioneerde medium en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
14. Overdrachtde supernatant naar nieuwe buizen en analyse voor tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) en interleukine-10 (IL-10) bevat commerciële ELISA-kits volgens de instructies van de fabrikant.

6. splenocyten Assay aan de Immuunmodulerende potentieel van Sferoïde-CM Assess

1. Bereid splenocyten compleet medium, bestaande uit Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 medium aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd FBS, 1 x penicilline-streptomycine, en 2-mercaptoethanol. Filter-steriliseren van het medium.
2. Oogst de milt van euthanized mannelijke BALB / c-muizen door een incisie opgesteld aan de linkerzijde van de buik via milt, ongeveer halverwege tussen de voor- en achterpoten ^14. Breng de milt een 70 um cel zeef om de splenocyten ¹⁴ isoleren.
3. Isoleer de splenocyten / lymfocyten door op de milt door de 70 urn zeef in een steriele petrischaal using het zachte rubber / plastic uiteinde van een zuiger van een 2-3 ml spuit ^14. Gebruik een knarsend cirkelvormige beweging naar de milt distantiëren.
4. Was de zeef cel enkele malen met koud PBS en cellen brengen van de petrischaal in een 50 ml conische buis. De buis met koude PBS en gecentrifugeerd (500 xg) bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
5. Zuig het supernatant en duidelijk de cellen van erytrocyten door incubatie met 5-10 ml rode bloedcellen lysis oplossing (per milt) gedurende 5-10 min.
6. Stop de lysis door het toevoegen van koud PBS aan de buis en centrifugeer gedurende 5-10 minuten bij 500 xg en 4 ° C.
7. Hang de geïsoleerde cellen in volledige splenocyten medium, filteren door middel van een 40 pm zeef, en tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Voeg splenocyten medium aan de celsuspensie tot een uiteindelijke celconcentratie van 10 ⁶ cellen / ml bereiken
   LET OP: Deze techniek meestal levert ongeveer 3 x 10 ⁷ splenocyten per muis milt.
OPMERKING: De hoeveelheid splenocyten vereist afhankelijk van het aantal experimentele condities zoals bepaald door de onderzoeker (zie stap 6,9). Voor elke experimentele monster / goed, 10 ⁶ splenocyten zijn vereist.
8. Transfer 10 ⁶ splenocyten (gestimuleerde of niet-gestimuleerde) in putjes van een 12-well plaat en voeg niet-geconditioneerde (controles) of MSC-CM in putjes uiteindelijke verdunning van 1: 10-1: 20.
9. Oogst de splenocyten CM na 24 uur en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
10. Breng de bovenstaande in nieuwe buizen en analyse voor interferon gamma (IFN-γ) bevat commerciële ELISA kit volgens de instructies van de fabrikant.

7. Prostate Cancer Assay aan de anti-kanker potentieel van Sferoïde-CM Assess

1. Bereid volledig RPMI groeimedium dat RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FBS, 1 x penicilline-streptomycine.
2. Het verkrijgen van een bevroren flesje LNCaP prostaatkankercellen en incubeer het flesje gedurende 2 minuten in een 37 ° C waterbad.
3. De inhoud van het flesje in een kweekschaal met 30 ml compleet RPMI groeimedium met een gemotoriseerde pipet en een 5 ml serologische pipet. Was de flacon meerdere malen met het medium van de schaal en zet de schaal in de incubator.
4. Vlak voor de cellen confluentie bereiken, was de cultuur tweemaal met PBS kamertemperatuur en verwijder de LNCaP cellen met 3 ml voorverwarmde 0,25% trypsine / EDTA-oplossing.
5. Neutraliseren van de trypsine in de schaal met de volledige RPMI groeimedium en de overdracht van de cellen samen met wast in een 50 ml conische buis.
6. Centrifugeer de cellen bij 450 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur en zuig de supernatant.
7. Resuspendeer de cellen in kleine volume van de volledige RPMI groeimedium en tel de kankercellen met behulp van een hemocytometer.
8. Een celgroei assay gebruik van een celproliferatie assay kit voeren, zuig het medium uit de putjes en breng de plaat in een vriezer (-80 ° C) gedurende ten minste 3 uur.
   1. Ontdooi de plaat en lyseren de cellen in elk putje door het toevoegen van 100 ui lysis reagens dat 180 mM NaCl, 1 mM EDTA en 0,2 mg / ml RNase A.
   2. Een standaardcurve lyse bekende hoeveelheden LNCaP cellen zoals hierboven beschreven.
   3. Na 1 uur, voeg 100 gl van 1x cellysis buffer die 1: 100 verdunning van celproliferatie assay reagens en meet de fluorescentie in elk putje om de cellen tarief vast.

8. Intraperitoneale Levering van Intact sferoïden

1. Bereid spheroïde MSC's zoals hierboven (protocol 2) en resuspendeer t beschrevenHij bollen in steriele Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), aangevuld met 0,2-0,5% HSA aan XF omstandigheden te handhaven. HSA in de oplossing maakt bol hechting aan kunststof bij injectie te voorkomen.
2. Transfer 40-120 sferoïden in 15 ml conische buizen en was de cellen door toevoeging van 6 ml HBSS / HSA aan de buizen. Laat 3-4 min voor sferen af ​​te dalen. Bereid een onafhankelijke conische buis van sferoïden per dier. Ook bereiden extra buizen van sferoïden voor assays bepalen van sferoïde retentie (zie 8.18 hieronder) en de productie van therapeutische factoren na de overdracht (zie 8.19 hieronder) indien gewenst.
3. Zuig het supernatant, bedekken de sferoïden 100-200 uit steriel HBSS aangevuld met 0,2-0,5% HSA en plaats de buizen op ijs.
4. Kort verdoven van de dieren met 2% isofluraan in 100% zuurstof tot het verdwijnen van pinch-teen reflex ongeveer 2 min in de inductie kamer.
5. Plaats het dier in de BSL-2 kabinet, dorsale aspect omlaag (ventrale zijde naar boven), met de continue stroom van 1,5% isofluraan / zuurstof mengsel via een neuskegel.
6. Maak de onderste muis achterlijf met een antiseptisch middel, zoals 70% alcohol.
7. Verwijder de dop van de 20 G intraveneuze (IV) katheter en het uitvoeren van de intraperitoneale injectie met de katheter-stiletto montage. Met één hand de muis huid wordt geplaatst en een andere voor de injectie uit te voeren. Zoek het punt van injectie ongeveer in het midden van een kunstmatige lijn tussen een gebogen kniegewricht en genitale gebied met de naald wijst naar de middellijn.
   LET OP: De katheter-stiletto samenstel heeft een hogere weerstand dan een gewone naald, dus zorg moet worden genomen als niet om de naald te diep injecteren in de buik, wat kan leiden tot letsel aan interne organen. Penetratie van de huid en spieren / peritoneale membraan kan worden gevoeld tijdens katheter.
8. Verwijder voorzichtig de metalen stiletto / naald uit de katheter-stiletto montage. check de stiletto voor bloed, urine en ontlasting en gooi deze weg. Bloed op de naald wijst punctie van de interne organen (s).
9. Houd de plastic katheter in de verticale positie staat de injecties om fluïdumstroom toe te staan.
10. Bevestig de juiste plaatsing van de plastic katheter door injectie van ongeveer 100 gl steriel HBSS / HSA door de katheter met een pipet met een 100-200 pi tip. Het uiteinde van de pipetpunt in de katheter spuitadapter vormen van een afdichting. Injecteer langzaam de vloeistof in de peritoneale holte.
    OPMERKING: De vloeistof in een juiste positie katheter stroomt vrij in de peritoneale holte met slechts kleine aanpassing van de katheter. Onjuiste plaatsing van de katheter (subcutaan of intra-intestinale of wanneer de punt van de naald gewonden peritoneale organen zoals nieren) weerstand zal toenemen en stroom verminderen. Subcutane plaatsing resulteert in een vorming van een duidelijke "bubble" onder de huid.
11. Verzamel tHij msc sferoïden, bereid in 100-200 ui HBSS / HSA (stap 8,3), met een 200 ul pipetpunt en dragen het gehele volume van bollen (40-120 bolletjes) in de buikholte door de katheter zoals hierboven beschreven.
12. Was de buis met bollen met 100 pi HBSS / HSA met dezelfde tip als hierboven om eventuele sferoïden verzamelen en injecteren in de peritoneale holte.
13. (Optioneel) Injecteer nog eens 100 ui HBSS / HSA in de peritoneale holte van de katheter te wassen.
14. Plaats het gaasje gedrenkt in antiseptische over de katheter en langzaam verwijderen van de katheter uit de buikholte en gooi deze weg.
15. Zachtjes masseren van de buikholte met de vingers om een ​​gelijkmatige verdeling van de sferoïden te waarborgen.
16. Laat het dier te herstellen onder streng toezicht en kijk voor bloeden uit de injectieplaats.
17. Inspecteer de katheter en 15 ml buis gedurende de resterende sferoïden. Het is normaal om een ​​paar gebieden in het observerenkatheter / buis.
    OPMERKING: De techniek beschreven MSC sferoïde levering kan voor normale dieren of in verschillende modellen schade vastgesteld. Deze techniek is met succes gebruikt om sferoïden bij muizen cornealetsel en endotoxemie modellen injecteren, en in een zymosan-geïnduceerde peritonitis model ^8.
18. Om het aantal van ingehouden sferoïden (optioneel) te kwantificeren, maken gebruik van een DNA-gebaseerde mobiele nummer kwantificering kit / reagens. Houd de gebruikte katheter via 15 ml buisje en heftig afgeven HBSS / HSA door de katheter om alle resterende gebieden terug in de 15 ml buis dwingen.
    1. Centrifugeer de 15 ml buis bij 500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en zuig de supernatant. Breng de buis met het bolvormige pellet in een vriezer (-80 ° C) gedurende ten minste 3 uur.
    2. Ontdooi de buis en lyseren de sferen door toevoeging van 500 pl cellysis reagens dat 180 mM NaCl, 1 mM EDTA en 0,2 mg / ml RNase A.
    3. Voor een controle, freeze lyse en een bekende hoeveelheid sferoïden (bij voorkeur gelijk aan het aantal sferoïden voorbereid voor een enkele injectie) zoals hierboven beschreven.
    4. Na 1 uur werd 100 ul overdracht van het cellysaat, in duplo, in een 96-well microplaat toevoegen aan elk putje 100 pl 1x cellysis buffer met een 1:50 verdunning van celproliferatie assay reagens uit de set. Na 10 min, het meten van de fluorescentie van elk putje van het aantal sferen die niet geïnjecteerd door vergelijking van de experimentele monster (s) met het controle monster.
19. Evalueer de activering niveau van sferoïden bereid voor injectie (optioneel) door het meten van de concentratie van PGE2 en TSG6 geproduceerd door overgedragen bollen. Overdracht 40-120 bollen door de katheter, zoals hierboven beschreven, in een 12-well of 6-putjes bevattende 1 of 2 ml aMEM gesupplementeerd met 2% FBS en 1 x penicilline / streptomycine. Plaats de platen in de incubator gedurende 6 uur.
    1. Transfer het mediumde putjes na 6 uur in 1,5 of 15 ml en centrifugeer de buizen bij 450 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Breng de celvrije supernatant aan verse 1,5 ml buisjes met een pipet en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Breng de geklaarde CM (supernatant) in nieuwe 1,5 ml buisjes en bepaling voor PGE2 concentratie (betekenis zijn anti-inflammatoire potentieel van CM) met een commerciële ELISA-kit volgens de instructies van de fabrikant. TSG6 concentratie kan worden bepaald onder toepassing van een gepubliceerde protocol ^14.

Representative Results

In het huidige werk, waren opknoping druppel culturen gebruikt om compacte sferische micro-weefsels of 'bolletjes' geactiveerde MSC onder XF omstandigheden te genereren. Het onderzoek routekaart in figuur 1 toont dat MSCs worden aangemoedigd om zelfassemblage tot sferoïden bij suspensie in opknoping druppels gedurende 72 uur, waarna de sferoïden, of CM geladen met bol afgeleide therapeutische factoren, kan worden verzameld en mogelijk gebruikt in beide onderzoek en klinische toepassingen. Het groot aantal cellen nodig is voor productie gebied kan binnen een week worden verkregen door enten de MSC's bij lage dichtheid, gewoonlijk 100-200 cellen per cm ^2, en de uitbreiding van cellen gedurende 6-7 dagen tot ongeveer 80% confluent (Figuur 2 ). Celgroei kinetiek, bepaald door het tellen van levensvatbare cellen per dag, gaf aan dat een robuuste expansiefase (dag 3-7) volgt een korte vertraging fase van 1-2 dagen (figuur 2C </ Strong>). MSCs in passage 2 of 3 levert doorgaans 50-100.000.000 cellen uit één flacon 1.000.000 gecryopreserveerde cellen wanneer gekweekt in CCM.

Na expansie en oogst worden de MSC's wordt om hoge celconcentratie te sferoïden, typisch 500-1000 cellen per pl genereren. Opknoping druppel kweken worden bereid door het overbrengen van 25-40 pl druppels medium dat de MSCs op de onderzijde van een weefsel- kweekplaat deksel, dat vervolgens wordt omgedraaid en geschikte positie op de basis van de schaal (figuur 3). Wanneer gesuspendeerd in 35 pl druppels CCM 714 cellen per pi (bijvoorbeeld 25.000 cellen per druppel), MSC eerste assembleren in kleine aggregaten die uiteindelijk samensmelten tot een compacte bol genereren bij 72 uur in de apex van de druppel (figuur 3C). Sferoïden vormen ook meer dan 72 uur in verschillende soorten commercieel verkrijgbare media XF geoptimaliseerd MSC expansie, Hier aangeduid als XFM-1 en XFM-2. Maar de vorming van enkele compacte bollen in XFM-1 vereist dat suppletie met 13 mg / ml humaan serumalbumine (HSA), een concentratie die de geschatte totale eiwitgehalte in CCM (figuur 3D) weerspiegelt. Compacte bollen niet gemakkelijk te vormen in basis XFM-1 zonder HSA of in eiwitvrij aMEM (Figuur 3D). Tijdens bol montage MSC fenotype verandert drastisch (figuur 4), en wanneer de geschikte chemisch gedefinieerde XF medium (dwz XFM-1 + HSA), expressie van talrijke anti-ontstekingsfactoren opgereguleerd zoals PGE2 en TSG6 (Figuur 4C). De productie van TSG6 en PGE2 is niet wezenlijk verhoogd in MSC's gekweekt zoals bollen in XFM-2 of XFM-1 zonder HSA (Figuur 4C). Met name deze anti-ontstekingsfactoren, en de anti-kanker TRAIL factoren en IL-24 werden sterk opgereguleerd in bolvormige MSC opzichte van MSC monolaag, op thij bolletjes werden gekweekt in XFM-1, aangevuld met ofwel recombinant HSA (rHSA) of klinische kwaliteit HSA (CHSA) bereid uit menselijk bloed (Figuur 4D).

Om het therapeutisch potentieel van MSC bolletjes bereid in verschillende media formuleringen te evalueren, zijn een aantal praktische tests (figuur 5). Het immuun-modulerende eigenschappen van sferoïden worden eerst in vitro bepaald door het meten van de effecten van bol CM op niveaus van cytokinen geproduceerd door LPS gestimuleerde macrofagen en CD3-gestimuleerde splenocyten / lymfocyten (Figuur 5). CM van MSC gebieden gekweekt in CCM en XFM-1 / HSA duidelijk onderdrukt productie van macrofaag TNFa en IFNy splenocyten, terwijl tegelijkertijd verhoogde niveaus van het ontstekingsremmende cytokine IL-10 (figuur 5A en 5B). Het anti-kanker eigenschappen van bolletjes worden geëvalueerd door het meten van de effecten van bol CM on groei en morfologie van LNCaP prostaatkankercellen. De XF medium XFM-1 / HSA effectief gereduceerd LNCaP proliferatie Soortgelijke FBS bevattende CCM (Figuur 5C en 5D).

Belangrijker, kan intact MSC bolletjes worden toegediend in de peritoneale holte van muizen om de anti-inflammatoire activiteit van de cellen in vivo testen (figuur 6). Voor deze experimenten worden bolletjes bereid voor injectie in HBSS met een lage concentratie van HSA, waarvan hechting minimaliseert plastic buizen met behoud van XF staat. Vervolgens kunnen gebieden gemakkelijk worden geïnjecteerd na overschakeling van de verzamelbuis (figuur 6A) met behulp van een pipet (figuur 6B), via een naald / kathetersamenstel (Figuur 6C en 6D) geschikte positie voor een standaard intraperitoneale injectie. Met deze aanpak kan MSC sferoïden regelmatig zijnovergebracht in een rendement van meer dan 90% (figuur 6E en 6F) zonder verstoring van de integriteit (figuur 6G en 6H). Onjuiste plaatsing van de catheter tip binnen de buikholte leidt tot een slechte sfeer levering en hoge retentie (figuur 6F). Belangrijker, mate van retentie gebied binnen de pipet / katheter kwalitatief worden bepaald door visueel onderzoek of kwantitatief verzameld / lyseren van de vastgehouden bollen en meetcel getal met een commercieel verkrijgbare DNA-cell kwantificatie reagens / kit (figuur 6F). Post-injectie bol retentie analyse helpt bij het creëren insluiting / uitsluiting criteria tijdens het experimenteren. Met name de mogelijkheid voor CCM en XFM-1 / HSA sferoïden om hoge TSG6 en PGE2 scheiden worden gehandhaafd minstens 6 uur na overdracht van de bollen van opknoping druppel kweken (figuur 6I). Vergelijkbaar met de in vitro effects, XFM-1 / HSA bollen geïnjecteerd in de peritoneale holte van muizen onmiddellijk na inductie van systemische ontsteking door intraveneuze toediening van LPS, verbeterde PGE2 en IL-10 niveaus in het peritoneum met minder pro-inflammatoire TNFa (figuur 6J).

Figuur 1: Schematische weergave van het platform ontwikkeld voor het benutten van de secretoom van MSCs geprimed sferische micro-weefsel onder omstandigheden XF. Na expansie als monolaagkweken (1), worden de MSC's gesuspendeerd in opknoping vallen van het deksel van een kweekschaal (2) bij een hoge celconcentratie te activeren / primaire cellen. Na 72 uur, zowel de (3) geconditioneerd medium (CM) en (4) intact bolletjes kunnen van de druppels worden geoogst en gebruikt in verschillende downstream-toepassingen. De CM is rijk aan immuun-modulerende factoren, evenals andere therapeutische compoenten. De compacte sferoïden die zich in opknoping druppels kunnen eenvoudig worden overgebracht met een pipet (5) en doeltreffend in vivo toegediend via een katheter (6). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Groei kenmerken van beenmerg afgeleide MSC's in monolaag culturen. MSCs in passage 2 werden uitgezaaid met lage dichtheid (100 cellen per ^cm2) in 15 cm schalen (15.000 cellen per schaal) en gekweekt gedurende 7 dagen in CCM. Het medium werd vervangen op dag 3 en daarna opnieuw op dag 5 of 6 (24-48 uur voorafgaand aan de oogst). Representatieve fase-contrast microfoto's van MSC 3 dagen (A) en 7 dagen (B) na het uitplaten van de cellen. Schaal bar = 200 micrometer. (C) Groeikinetiek van MSCsverkregen uit 3 donoren werden bepaald door dagelijkse tellen van het aantal levensvatbare hechtende cellen van dag 2 tot dag 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Voorbereiding van de opknoping druppel culturen voor het vullen van MSC sferoïden in XF medium. (A) Foto die de techniek snel laag opknoping druppels op de onderkant van een weefselcultuurschaal deksel. (B) illustreert Photo hangende druppels na inversie en positionering van het deksel op de schaal basis. (C) tijdsafhankelijke veranderingen in de aggregatie van 25.000 MSCs in een opknoping druppen gevisualiseerd door fasecontrast microscopie. De doelstelling was gericht op de top van de druppel. Schaal bar = 500 pm. (D) Images van MSC bolletjes gevormd na 3 dagen kweken opknoping druppel via uiteenlopende media formuleringen waaronder aMEM met en zonder FBS (dwz CCM), XFM-1 met en zonder HSA en XFM-2 met en zonder HSA. Schaal bar = 200 micrometer. De gegevens in panel D werden verkregen uit het oorspronkelijke artikel met toestemming van de uitgever ^14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Evaluatie van MSC activatie in 3-D XF culturen. (A) Spheres / CM worden geoogst na 72 uur door het omkeren / kantelen van de schaal deksel en het dwingen van de druppels aan de rand met behulp van een cel lifter. Bollen opgebouwd uit 25.000 cellen kunnen gemakkelijk worden gevisualiseerd tijdens het verzamelen. (B) Foto van onderlingeveer 500 bollen verzameld van deksels van talrijke weefselkweekplaten. Spheres snel afdalen naar de bodem van de buis zonder centrifugeren. (C) Aantal PGE2 uitgescheiden door MSC bolletjes na 72 uur werd gemeten met ELISA. Real-time RT-PCR werd gebruikt om TSG6 te meten. Zowel TSG6 en PGE2 zijn waardevol voor het screenen merkers MSC activering in sferoïden. De XF medium XFM-1 + HSA vertoonde hoog niveau van PGE2 en TSG6 productie (rode dozen). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD en werden geanalyseerd door t-test van Student (*** p <0,001 vergeleken met aMEM monster). (D) PGE2 ELISA en real-time RT-PCR-analyses van sferen geproduceerd CCM en XFM-1 specifiek gesupplementeerd met 13 mg / ml recombinant HSA (rHSA) of klinische kwaliteit HSA (CHSA) bereid uit menselijk veneus bloed. Veelvoudveranderingen werden bepaald uit hechtende monolaag MSC (RQ = 1). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD en werden geanalyseerd door t-test van Student (p ** <0,01, *** p <0,001, in vergelijking metmonolaag MSC's). Bepaalde gegevens in panelen C en D werden verkregen uit het oorspronkelijke artikel met toestemming van de uitgever ^14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: In vitro functionele testen voor het evalueren van de anti-inflammatoire en anti-kanker eigenschappen van MSC-CM vanuit opknoping druppel culturen. (A) Representatieve resultaten van ELISA die de effecten van bol CM (CCM en XFM-1 / HSA) op de productie van TNFa en IL-10 door LPS gestimuleerde muizenmacrofagen (MQ). (B) Representatieve resultaten van ELISA die de effecten van bol CM (CCM en XFM-1 / HSA) op de productie van IFNy door muis splenocyten (Spl) gestimuleerd met anti-CD3 antilichaam. (C) Fase contrast microfoto van LNCaP prostaatkankercellen behandeld met basis CCM en XFM-1 / HSA of geconditioneerd medium (CM) van MSC bollen opgesteld in CCM en XFM-1 / HSA. LNCaP-cellen werden gekweekt in RPMI medium (controle). Schaal bar is 200 pm. (D) Kwantitatieve veranderingen in de groei van LNCaP prostaatkankercellen werd bepaald met een commercieel verkrijgbare DNA-cell kwantificatie reagens / kit. Stippellijn geeft zaaien dichtheid van 5.000 cellen per putje. Gegevens in alle panelen zijn weergegeven als gemiddelde ± SD en werden geanalyseerd met Student's t-test (*** p <0,001). Sommige gegevens in alle panelen werden verkregen uit de originele artikelen met toestemming van de uitgever ^14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

load / 55126 / 55126fig6.jpg "/>
Figuur 6: Efficiënte overdracht van intacte MSC sferoïden, opgesteld onder XF omstandigheden, met behulp van een 20G iv naald / kathetersysteem. (A) Representatieve foto van een 15 ml conische buis met XFM-1 / HSA MSC bolletjes bereid voor injectie in HBSS dat 0,2% HSA. (B) Representatieve foto van de MSC sferen na inademing in een 200 ul pipetpunt. (C) Afbeelding van de 20 G-naald / kathetersamenstel gebruikt om intact MSC bolletjes te beheren in muizen. (D) Image demonstreren juiste positionering van de pipetpunt in de adapter van het polyurethaan katheter. (E) Afbeelding van de MSC bollen direct na hen passeren van de katheter in een cultuur schotel. Ongeveer 95 sferen van de 100 werden overgebracht. (F) Efficiëntie van bol plaatsing in de peritoneale holte van muizen werd bepaald door het verzamelen / lyseren bollen in de bewaardepipet / katheter en meetcel nummers via commerciële DNA-kwantificering cell assay ten opzichte van het aantal cellen verkregen uit een volledige aanvulling van gelyseerde bollen. Gestippelde rode lijn geeft een overdracht rendement van 90%. Slechte levering bol (71%) werd waargenomen met één injectie (pijl). (G) Phase-contrast microfoto van gebieden in paneel E (vergrote weergave). Schaal bar = 200 micrometer. (H) Phase-contrast microfoto van een XFM-1 / HSA bol 16 uur na de overdracht op een weefselkweek schotel. De fibroblastische, spoelvormige morfologie van MSCs wordt gehandhaafd in cellen die migreren uit de bol. Schaal bar = 200 micrometer. (I) ELISA assays voor anti-ontstekingsfactoren TSG6 en PGE2 werden uitgevoerd op verzamelde CM 6 uur na overdracht van de bollen in 6-well platen met 2 ml aMEM / 2% FBS. Spheres bereid in de XF medium XFM-1 / HSA vertoonde hoogste niveau van TSG6 en PGE2 secretie (rode dozen). Gegevens, uitgedrukt als gemiddelde± SD werden geanalyseerd door t-test van Student (*** p <0,001 vergeleken met aMEM monster). Sommige gegevens zijn afkomstig van het oorspronkelijke artikel met toestemming van de uitgever ^14. (J) Vertegenwoordiger grafieken die het vermogen van sferoïden, geïnjecteerd in de peritoneale holte, peritoneale PGE2 en IL-10 verhogen en dalende TNFa bij muizen uitgedaagd door intraveneuze injectie van endotoxine (LPS). De monsters werden verkregen door middel van peritoneale lavage 6 uur na inductie van de ontsteking en de levering van 80 bolletjes. Gegevens, uitgedrukt als gemiddelde ± SD werden geanalyseerd door t-test van Student (* p <0,05, ** p <0,01 vergeleken met controle). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De optimale MSC voor gebruik in sommige onderzoek en klinische toepassingen moet sterk worden geactiveerd om hun voordeel te maximaliseren, en bij voorkeur opgesteld onder chemisch gedefinieerde XF voorwaarden voor de afgifte van potentiële antigenen van xenogene mediumbestanddelen zoals FBS minimaliseren. In de hier beschreven protocollen hebben we aangetoond methoden 1) activeren MSCs in 3D cultuur door de vorming van sferoïden, 2) bereiken de 3D activatie van MSCs onder omstandigheden XF, 3) hoe de activering niveaus van sferoïde MSC's met betrekking tot hun anti- inflammatoire, immuun-modulerende, anti-kanker potentieel, en 4) hetzij geactiveerde MSC als intacte bolletjes in muizen.

MSCs zijn multipotente stamcellen die via plastic hechting kan worden geïsoleerd uit verschillende volwassen weefsels zoals beenmerg en vetweefsel. MSC's zijn gemakkelijk gepropageerd op weefselkweek plastic onder relatief hoog (10-20%) FBS concentraties, drukken een afzonderlijke reeks van oppervlakte markers, enkunnen worden gedifferentieerd in tenminste adipogenic, osteogene, chondrogene en lijnen ^{1, 16, 17, 18.} MSCs is aangetoond dat gunstige effecten bij verschillende diermodellen van menselijke ziekten uitoefenen, hoewel ze lijken slechts tijdelijk aanhouden na toediening in vivo. Het effect van MSCs Derhalve is genoemd "hit and run" en wordt vaak veroorzaakt door de anti-inflammatoire en immunomodulerende paracriene factoren, zoals PGE2, TSG-6 en indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), uitgescheiden door MSC ^{2 , 3, 11, 19, 20, 21.} Echter, om deze factoren produceren, MSC's moeten worden geactiveerd, of door signalen van een beschadigd weefsel of immune cellen van de ontvanger. Vervolgens is er een groeiende belangstelling voor MSC pre-activering of priming protocollen te ontwikkelen voor de levering van de cellen in dieren of patiënten die ²² geweest. Ook is de aanwezigheid van FBS antigene componenten in standaard MSC preparaten bezorgdheid. Derhalve zijn studies uitgevoerd om optimale chemisch gedefinieerde voorwaarden XF MSC kweken bepalen. In onze recente werk hebben we aangetoond dat MSC's eerst in 3D kan worden geactiveerd door vorming van sferoïden, en ontdekten dat celactivering ook onder specifieke omstandigheden XF ^{8, 12, 13, 14} worden bereikt.

3D celkweek zijn toegepast decennia met als doel het bieden echte fysiologische omstandigheden in celgebaseerde onderzoek. Culturen in 2D negeren de 3D-karakter van weefsels en daarom niet altijd herhalende cel-cel en cel-matrix interacties belangrijk cell signaling. Vele 3D cultuur technieken roterende vaten, spinner flessen of verschillende niet-hechtende oppervlakken, echter, het grootste nadeel in veel van deze werkwijzen is de heterogeniteit van de gegenereerde bolvormige afmeting en / of het vereiste specifieke dure apparatuur. Onderzoek is ook uitgevoerd met behulp hangende druppel culturen die hoofdzakelijk MSCs stimuleren om spontaan in een enkel sferoïde ^{4, 5, 6, 7, 8, 9, 23.} Met name opknoping druppel culturen steunsamenstel van relatief uniforme micro-weefsels / aggregaten, met het extra voordeel van de mogelijkheid om eenvoudig formaat van celaggregatie manipuleren door het aanpassen celconcentratie en / of druppelvolume. Bovendien, beheersing van de hangende drop cultuur techniek geen uitgebreide training nodig. Druppels 25-40 pl kunnen gemakkelijk worden bereid met MSC's bij hoge cel concentraties, kenmerkend 500-1000 cellen per pl. Druppels kleiner dan 20 pi hebben de neiging om snel verdampen, en die groter zijn dan 45 ul smeren vaak over het deksel tijdens de inversie. Echter, wanneer het opgooien van een deksel met druppeltjes van elke omvang, snelheid en richting zijn kritische parameters te overwegen voor het behoud van de oppervlaktespanning en passende vorm van de druppel / sferoïde. Ononderbroken cultuur en goede luchtstroom in de incubator zijn belangrijk voor het waarborgen van de MSC's in een enkel gebied in elke druppel.

Een nadeel van deze techniek is dat platen die opknoping druppels niet worden gestapeld in de incubator of verstelling bij montage bol, waardoor opschaling patiënt therapieën moeilijk. Bovendien, het veranderen van medium in opknoping druppel culturen is zeer uitdagend, waardoor lange-termijn culturen moeten av zijnoided. Bovendien kan de lage media tot cel verhouding opknoping druppels tekort aan nutriënten en afval accumulatie uiteindelijk leiden tot het verlies van belangrijke cellulaire functies en / of celdood veroorzaken.

Echter, met de juiste aanhangende techniek, hebben we aangetoond dat MSC's in sferoïden worden zeer actieve of geprimed, doordat de cellen fabrieken van het krachtige anti-inflammatoire moleculen PGE2 en TSG6, evenals de anti-kanker moleculen IL-24 en TRAIL. We hebben aangetoond dat MSC sferoïden inderdaad anti-ontstekings- en immunomodulerende en anti-kanker eigenschappen superieur aan hun tegenhangers in 2D monolaag verschillende functionele bepalingen met gekweekte macrofagen, splenocyten en prostaatkankercellen ^{8, 12, 13, 14.} Verder hebben we aangetoond dat MSC sferoïden krachtige anti-inflammatoire effecten kunnen uitoefenen wanneer toegediendin de peritoneale holte van muizen met peritonitis ^8. Specifiek hebben we aangetoond dat grote sferoïden van ongeveer 400-500 micrometer in diameter (25.000-30.000 MSC elk) efficiënt in een klein volume HBSS kunnen worden geleverd met behulp van een 20G naald / kathetersamenstel en een standaard pipet. Met deze techniek, onjuiste plaatsing van de katheter, waardoor een hoge weerstand tegen vloeistofstroming, kan eenvoudig worden bepaald vóór overdracht sferoïde door eerst een klein volume HBSS / HSA injecteren, zoals beschreven in de protocollen. De sferoïden in een juiste positie katheter stroomt vrij, mits de HBSS aangevuld met HSA bol hechting minimalisering plastic buizen, en kan gemakkelijk worden gevisualiseerd. Bovendien is deze techniek voorkomt schuifspanning op cellen die kunnen optreden met een standaard naald / spuit voor injectie, en vermijdt de noodzaak van een chirurgische incisie die een hoger risico op infectie draagt ​​en is technisch uitdagend. Een groot nadeel is that grote aantallen sferoïden kunnen alleen worden geïnjecteerd in ruime lichaamsholten, zoals de buikholte, de weerstand tegen bol doorvoersnelheid over de katheter hoog vernauwde gebieden.

We hebben onlangs aangetoond dat hetzelfde MSC activering in sferoïden kan worden bereikt door een specifiek commercieel verkrijgbare XF medium, hier aangeduid XFM-1, zolang deze werd aangevuld met HSA verkregen uit menselijk bloed of bereid door middel van recombinanttechnieken ^14. Het is belangrijk op te merken dat MSC sferoïden geen hoge niveaus van PGE2 en TSG6 produceren alle soorten media XF ^14, waarschijnlijk omdat de meeste XF media voor MSCs aanvankelijk geformuleerd voor optimale groei van de cellen in 2D. Het is ook belangrijk op te merken dat verschillende soorten HSA variëren in hun kracht ^14. Bovendien, het absolute niveau van PGE2 gedetecteerd in CM geactiveerde sferoïden kunnen lichte verschillenly als ELISA toegepast voor PGE2 inderdaad een competitie assay. Het is dus essentieel om de juiste controles in elke PGE2 ELISA en direct niet vergelijken gegevens tussen monsters geanalyseerd op verschillende tijdstippen of in verschillende platen. Bovendien moet MSCs grondig gewassen XF medium alvorens met hangende druppels om resterende CCM en derhalve grens overdracht van FBS componenten te verwijderen. De hier beschreven protocollen kunnen gemakkelijk worden genomen om andere media formuleringen op de vorming van een bol en een therapeutische genexpressie te evalueren.

Het is duidelijk dat een groot aantal cel-signalering gebeurtenissen die normaal niet voorkomen in 2D MSC's in gang gezet toen MSC's worden gekweekt in 3D. Cel-cel en cel-matrix interacties gemedieerd door cadherins en integrinen gids sferoïde vorming en verdichting ^{24, 25, 26} en zijn waarschijnlijk essentieel voor sferoïde therapie. Aangezien de cellen aggregaat en covan effectbeoordelingen in sferoïden, verschillende stress-signalen, inclusief kleinere apoptose steun bezig MSC activatie die resulteert in de productie van een groot aantal mogelijke therapeutische factoren ^{4, 5.} We toonden eerder aan de kritische rol van autocriene IL-1 signalering in MSC activering en productie van PGE2 en TSG6 ^12. Hoewel veel onbekend is over de verschillende signaalwegen die helpen bij MSC activering, de hangende druppel cultuur platform biedt een praktische manier om dit fenomeen te bestuderen en verbeteren van MSC-gebaseerde therapieën. Samengevat hebben wij beschreven in de protocollen hier de middelen activeren of priming MSCs in 3D culturen onder chemisch gedefinieerde XF omstandigheden, ontstekingsremmende, immunomodulerende en anti-kanker factoren. We hebben ook beschreven hoe deze intact MSC sferoïden in vivo kan worden afgegeven.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM-α (minimal essential medium alpha)	ThermoFisher/Gibco	12561049; 12561056; 12561072	minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select	Atlanta Biologicals	S11595; S11510; S11550; S11595-24	component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine	ThermoFisher/Gibco	25030081; 25030149; 25030164	component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher/Gibco	15070063	component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane	MilliporeSigma	SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE	media sterilization
150 mm cell culture dish	Nunc	D8554 SIGMA	cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator	Thermo Fisher	Model 3110	incubation of cultured cells
Early passage MCSs	Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White	NA	preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath	VWR	89501-468	warming media to 37 °C
Pipettes	Eppendorf	492000904	manual liquid handling
Pipete-Aid	Drummond Scientific Company	4-000-300	handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)	Corning	4487; 4101; 4251; 4490	liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4	ThermoFisher/Gibco	10010023; 10010072; 10010031; 10010049	cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution	ThermoFisher/Gibco	25200056; 25200072; 25200114	lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352097	cell centrifugation
50 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352098	cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge	Eppendorf/Fisher Scientific	Model 5810R	cell centrifugation
hemocytometer	Fisher Scientific	26716	cell counting
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154 SIGMA	dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)	ThermoFisher/Gibco	A1067501	Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)	Stem Cell Technologies	5420	Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin)	Gemini	800-120	Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin)	Sigma-Aldrich	A9731 SIGMA	Component of xeno-free MSC media
Total RNA isolation Mini Kit	Qiagen	74104	Total RNA extraction
Qiashredder	Qiagen	79654	Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set	Qiagen	79254	On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250 ALDRICH	inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex	VWR	97043-562	mixing sample
Spectrophotometer	Biorad	NA	RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher/Applied Biosystems	4368814	transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays	ThermoFisher/Applied Biosystems	varies	primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix	ThermoFisher/Applied Biosystems	4352042; 4364103; 4366073; 4367846	master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)	ABI Prizm	NA	real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube	Eppendorf	22364111	cell centrifugation, sample collection and storage
(-80 °C) freezer	Thermo Fisher	Model Thermo Forma 8695	sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit	R&D Systems	KGE004B	estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)	ThermoFisher/Gibco	10566-016; 10566-024;10566-032	macrophage culture media
J774 mouse macrophages	ATCC	TIB-67	mouse macrophage cell line
12-well plate	Corning	3513	in vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide)	Sigma-aldrich	L4130	in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit	R&D Systems	MTA00B	estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit	R&D Systems	M1000B	estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium	ThermoFisher/Gibco	11875-085	splenocyte culture media
BALB/c mice	The Jackson Laboratory	651	in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified	eBioscience	145-2C11	in vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer	Corning	352350	Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x)	Affymetrix eBioscience	00-4333	removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit	R&D Systems	MIF 00	estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells	ATCC	CRL-1740	study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit	ThermoFisher	C7026	cell number measurement based on DNA content
NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	ThermoFisher	FERR1021	calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A	Qiagen	19101	RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader	BMG Technology	NA	Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher/Gibco	14175079	resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane	MWI Vet Supply	502017	Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas	Praxair	NA	For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet	Thermo Fisher	Model 1385	Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch	Terumo	SR*FNP2025	Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips	Eppendorf	varies	liquid/cells handling