Summary
Epigenetiska faktorer kan interagera med genetiska program att modulera genuttryck och reglera B cellsfunktion. Genom att kombinera in vitro B-cell stimulering, qRT-PCR, och hög genomströmning mikroRNA-sekvens och mRNA-sekvens tillvägagångssätt, kan vi analysera de epigenetiska moduleringen av miRNA och gen uttryck i B-celler.
Abstract
Antikroppssvar är fulländade genom flera kritiska B cell-inneboende processer, inklusive somatisk hypermutation (SHM), klass-switch DNA-rekombination (CSR) och plasma celldifferentiering. Under de senaste åren har epigenetiska modifieringar eller faktorer, såsom Histon deacetylering och mikroRNA (Mirna), visats interagera med B-cells genetiska program till formen antikroppssvar, medan dysfunktion av epigenetiska faktorer har visat sig leda till autoantikropp svaren. Analysera genome-wide miRNA och mRNA uttryck i B-celler som svar på epigenetisk modulatorer är viktigt för att förstå epigenetisk reglering av B-cells funktion och antikropp svar. Här visar vi ett protokoll för inducerande B-celler genomgår CSR och plasma cell differentiering, behandling av dessa B-celler med Histon histondeacetylas (HDAC)-hämmare (HDI) och analysera mRNA och mikroRNA uttryck. I detta protokoll, analyserar vi direkt kompletterande DNA (cDNA) sekvenser med nästa generations mRNA sekvensering (mRNA-seq) och miRNA-seq teknik, kartläggning av sekvensering läser till genomet och kvantitativa omvänd Transkription (qRT)-PCR. Med dessa metoder, har vi fastställt att, i B-celler inducerad genomgå CSR och plasma celldifferentiering, HDI, en epigenetisk regulator, selektivt modulerar miRNA och mRNA uttryck och förändrar CSR och plasma cell differentiering.
Introduction
Epigenetiska märken eller faktorer, såsom DNA-metylering, Histon posttranslationell ändringar och icke-kodande RNAs (inklusive mikroRNA), modulera cellens funktion genom att ändra gen uttryck1. Epigenetiska förändringar reglera B-lymfocyter funktion, till exempel immunglobulin klass-switch DNA-rekombination (CSR), somatisk hypermutation (SHM) och differentiering till B-minnesceller eller plasmaceller, därigenom modulera den antikropp och autoantikroppar svar2,3. CSR och SHM kräver kritiskt aktivering-inducerad cytidindeaminas (stöd, kodad som Aicda), som mycket framkallas i B-celler som svar på T-beroende och T-oberoende antigen4. Klass-bytte/hypermutated B-celler ytterligare differentieras till plasmaceller, som utsöndrar stora mängder antikroppar i ett mode som är kritiskt beroende av B-lymfocyter-inducerad mognad protein 1 (Blimp1, Prdm1-kodad)5. Onormala epigenetiska förändringar i B-celler kan leda till avvikande antikropp/autoantikroppar svar, vilket kan leda till allergisk reaktion eller autoimmunitet1,4. Förstå hur epigenetiska faktorer, såsom MicroRNA, modulera B cell-inneboende genuttryck är inte bara viktigt för utvecklingen av vaccin, men är också viktigt att avslöja mekanismerna av potentiella onormala antikroppar/autoantikroppar svaren.
Histon acetylering och deacetylering är ändringar av lysin rester på Histon proteiner normalt katalyseras av Histon kolinacetyltransferas (HAT) och Histon histondeacetylas (HDAC). Dessa ändringar leder till ökande eller minskande tillgänglighet av kromatin och ytterligare tillåta eller förhindra bindning av transkriptionsfaktorer eller proteiner till DNA och förändringen av genen uttryck5,6, 7 , 8. HDAC-hämmare (HDI) är en klass av föreningar som stör funktionen av HDAC. Här, brukade vi HDI (VPA) adress regleringen av HDAC på inneboende gen uttryck profilen av B-celler och på dess mekanism.
MicroRNA är små, icke-kodande RNAs cirka 18 till 22 nukleotider i längd som genereras genom flera stadier. miRNA värd gener transkriberas och bilda hårnål primära mikroRNA (pri-MicroRNA). De exporteras till cytoplasman, där pri-MicroRNA vidarebearbetas till föregångare MicroRNA (pre-MicroRNA). Slutligen bildas mogna MicroRNA genom klyvning av den pre-microRNA. MicroRNA igen de kompletterande sekvenserna inom 3' oöversatta regionen av deras mål mRNA6,7. Genom post-transcriptional ljuddämpning, reglera MicroRNA cellulär aktivitet, såsom proliferation, differentiering och apoptos10,11. Eftersom flera MicroRNA kan rikta samma mRNA, och en enda miRNA kan potentiellt rikta flera mRNA, är det viktigt att ha en sammanhangsberoende utsikt över miRNA uttryck profilen att förstå värdet av enskilda och kollektiva effekten av microRNA. MicroRNA har visat sig vara inblandade i B-cells utveckling och perifera differentiering, samt B-cellen scenen-specifika differentiering, antikroppssvar och autoimmunitet1,4,9. I de 3' UTR Aicda och Prdm1finns det flera validerade eller förutsedd evolutionärt bevarade webbplatser som kan riktas av MicroRNA8.
Epigenetiska modulering, inklusive Histon efter transkriptionen modifiering och MicroRNA, Visa ett cell-typ och cellen scenen-specifik förordning mönster av gen uttryck9. Här, beskriver vi metoder för att definiera HDI-medierad moduleringen av miRNA och mRNA uttryck, CSR och plasma celldifferentiering. Dessa inkluderar protokoll för att inducera B-celler genomgår CSR och plasma celldifferentiering; för behandling av B-celler med HDI; och för att analysera miRNA och mRNA uttryck av qRT-PCR, miRNA-seq och mRNA-seq10,11,12,8,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
protokollet följer djurvård riktlinjer The institutionsvård av djur och användning kommittéer vid University of Texas Health Science Center på San Antonio.
1. stimulering av mus B celler för CSR, Plasma celldifferentiering och HDI behandling
- beredning av mjälte cellsuspensioner
Obs: utföra alla steg i en LAF förutom mus dödshjälp och dissektion.- Euthanize den specifikt patogenfria C57BL/6J mus (8-12 veckors ålder) av CO 2 inandning.
- Lägga musen dissekera ombord med buken uppåt. Fästa alla fyra fötter av musen med 18 gauge, 1,5 - i injektionssprutor.
- Sterilisera huden med 70% etanol-indränkt våtservetter.
- Använda en uppsättning Ånghärdad kirurgiska verktyg (tången och dissekera saxen) för att skära igenom huden precis nedanför bröstkorgen att visualisera mjälte (på vänster sida av magen, precis under levern).
- Använder en annan steril pincett och sax för att extrahera mjälten, som ligger under den större krökningen i magen, av fastspänning mjälte försiktigt med pincett och skära av alla anslutande vävnaden med dissekera sax. Se till att ta bort alla anslutande vävnaden.
- Placera mjälte i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör innehållande 1000 µL av komplett RPMI1640 medium (RPMI 1640 medium kompletteras med 10% Värmeinaktiverade fetalt kalvserum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 µg/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 0,25 µg/mL amfotericin B och 50 µM β-merkaptoetanol).
- Placera en 70 µm cell SIL i en 50 mL polypropylen koniskt centrifugrör och häll mjälte från mikrocentrifug röret på cell Silen. Använd spetsen på en 15 mL polypropylen koniskt centrifugrör att försiktigt mosa mjälte genom Silen. Skölj cellen silen med 15 till 20 mL komplett medium.
- Snurra ner cellerna vid 350 x g i 5 min och Kassera supernatanten.
- Ta bort de röda blodkropparna från de mjälte cellsuspensioner. Återsuspendera cellpelleten i ACK lyseringsbuffert (5 mL per mjälte). Inkubera i 4 min i rumstemperatur med enstaka skakar och sedan släcka med 25 mL av komplett medium.
- Snurra ner cellerna vid 350 x g i 5 min och kasta bort supernatanten. Återsuspendera cellpelleten i 1 eller 10 mL komplett medium. Räkna de viabla celler som använder en hemocytometer.
- B-cell isolering
Obs: isolera B-celler av negativa urval efter tillverkaren ' anvisningar. Icke-B-cellerna är måltavlan för borttagning med biotinylerade antikroppar riktade mot icke-B celler (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6C/G (Gr-1) och TER119) och streptividin-belagda magnetiska partiklar.- Förbered en 0,25 till 2 mL cellsuspension av 1 x 10 8 celler/mL i komplett medium i en steril 5 mL (12 x 75 mm) polystyren runda-botten röret. Lägga till normala råtta serum (50 µL/mL) i provet.
- Lägga till 50 µL/mL isolering cocktail till provet. Blanda cellerna genom att försiktigt pipettering upp och ner 2 - 3 gånger och inkubera i rumstemperatur i 10 min.
- Tillsätt 75 µL/mL streptividin-belagda magnetiska partiklar. Mixa blandningen genom att försiktigt upp och ner med 2 - 3 gånger och inkubera i 2,5 minuter i rumstemperatur.
- Lägga till komplett RPMI 1640 medium. Blanda cellerna genom pipettering försiktigt upp och ner 2 - 3 gånger.
- Ställ röret (utan lock) i magneten och inkubera vid rumstemperatur för 2,5 min. Häll bort supernatanten innehållande orörd B-celler till en ny 15 mL koniska rör.
- Räknas de viabla celler med hjälp av en hemocytometer och Trypan blå fläck. Bedöma renheten av de B-cellerna av flödescytometri Flödesanalys av B-cells yta markörer, såsom B220 och CD19.
- B-cell stimulering och HDI behandling
- resuspendera renat B cellerna i komplett RPMI 1640 medium med en slutlig koncentration på 0,3 x 10 6 celler/mL.
- Använder en 48-väl cell kultur platta för cellodling. För varje brunn, tillsätt 1 mL renat B-cellsuspension (0,3 x 10 6 celler/mL), LPS (3 µg/mL koncentration) från Escherichia coli, IL-4 (5 ng/mL koncentration) och 0 eller 500 µM HDI (valproinsyra; VPA).
- Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO 2 för 60 h för qRT-PCR och hög genomströmning mRNA - och miRNA-sekvensering analys eller 96 h för flödescytometri Flödesanalys.
- Flow flödescytometri analys av CSR och plasma celldifferentiering
- efter 96 h av kultur, lossa cellerna från varje brunn genom pipettering cellerna upp och ner flera gånger. Överföra cellsuspensionen i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Snurra ner cellerna vid 350 x g i 5 min med en Bänkcentrifug och kasta bort supernatanten.
- Omsuspendera cellerna med 100 µL av HBSS buffert innehållande 1% BSA och 0,5 ng/mL fluorescein (FITC) - konjugerade get anti – mus IgM antikropp (Ab) , 0,2 ng/mL allophycocyanin (APC)-konjugerade råtta antimus IgG1 monoklonala Ab (mAb), 0,2 ng/mL fykoerytrin (PE)-konjugerad råtta antimus B220 mAb, 0,2 ng/mL PE-Cy7-konjugerad råtta antimus CD138 mAb och 2 ng/mL 7-aminoactinomycin D (7-AAD).
- Inkubera cellerna med fluorescens-konjugerade antikroppar (steg 1.4.2) i mörker vid rumstemperatur i 30 min.
- Tvätta cellerna med 1 mL HBSS med 1% BSA.
- Snurra ner cellerna vid 1500 x g i 5 min med en bänkmonterade centrifug och Kassera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 300 µL av HBSS med 1% BSA och överföra cellsuspensionen till en runda-botten polystyren tube. Täcka röret med folie för att undvika ljusexponering.
- Utför Flödesanalys flödescytometri på en enskild cell suspension. Samla in 50.000 händelser för varje prov som kompensation och 250.000 händelser för andra prover. Analysera data med hjälp av utrustning programvara.
- Eliminera skräp och midjekort jacka med hjälp av en puls geometri grind (FSC-H x FSC-A och SSC-H x SSC-A). På lämpligt sätt gate tomten på 7-AAD att utesluta döda celler.
2. Hög genomströmning mRNA-Seq
- efter 60 h av kultur, extrahera den total-RNA från 2-4 × 10 6 celler med hjälp av ett totalt RNA isolering kit som kan återställa små RNA efter tillverkaren ' anvisningar. Inkluderar ett DNAS jag behandling steg.
- Verifierar RNA integritet med hjälp av en bioanalyzer, efter tillverkaren ' anvisningar.
- Använda 500-1 000 ng av hög kvalitet total-RNA (RNA integritet nummer RIN > 8.0) för RNA-seq bibliotek preparationen med en kommersiell RNA prov prep kit efter tillverkaren ' anvisningar.
- Pool de enskilda mRNA-seq bibliotek baserat på deras respektive 6-bp index portionr av adaptrarna och sekvens biblioteken vid 50 bp/sekvens. Använda en hög genomströmning DNA system enligt tillverkaren ' s protokoll.
- Efter sekvensering flykt, multiplex med CASAVA att generera filen fastq för varje prov. Utföra läsningar kartläggning och bioinformatik analys, som tidigare skisserat 11.
- Justera alla sekvensering läsningar med deras referens genom (UCSC mus genomet bygga mm9) använder TopHat2 standard inställningar 14. Bearbeta bam filerna från justering använder HTSeq-räkna för att erhålla räkningarna per genen i alla prover.
3. Hög genomströmning miRNA-Seq
- användning 100 ng-1 µg av hög kvalitet total-RNA, som förberett i steg 2.1, för små RNA-seq bibliotek beredning med hjälp av ett kommersiellt litet RNA-seq kit.
- Ligate den degenererade 3 ' adaptern på 5 ′ ändarna av de Start små RNA-molekylerna med en kommersiell ligering kit. Ligera den degenererade 5 ' adaptern på 3 ′ ändarna av de Start små RNA-molekylerna med en kommersiell ligering kit. Konvertera RNA till cDNA med omvänd Transkription och förstärka små RNA-seq biblioteket av PCR-amplifiering med kommersiella kit.
- Använder en gel som 6% TBE infödda sida för att isolera det slutliga litet RNA-seq biblioteket. Kör gelen med 1 X TBE buffert på 200 V tills bromofenolblått spårning dye bandet närmar sig botten av gelen (0,5 - 1 cm).
- Gelen från glasplattorna och fläcken med etidiumbromid (0,5 µg/mL i vatten) i en ren behållare för 2-3 min. visualisera gelen band på en UV-transilluminator eller annat gel dokumentation instrument.
- Skära ut ~ 150-bp bandet med en ren rakhyvel och placera det i en 1,7 mL tub.
- Extrahera DNA med en gel utvinning kit per tillverkarens anvisningar.
- Kontrollera storlek distribution av det slutliga biblioteket med en kommersiell högkänslig DNA analys och koncentration med en kommersiell dsDNA analys per tillverkare ' instruktionerna.
- Pool biblioteken för förstärkning och en efterföljande sekvensering köra med en kommersiell hög genomströmning DNA sekvensering system per tillverkaren ' s protokoll.
- Demultiplex med CASAVA att generera filen fastq för varje prov per tillverkaren ' s protokoll.
- För små RNA-seq analys av varje prov, använda flimmer för små RNA justering per tillverkaren ' s protokoll.
- Ta bort läsningar som anpassas till föroreningar, såsom mitokondrier, rRNA, grundfärger, och så vidare.
- Justera data att mogna miRNA sekvenser.
- Justera data till hårnål loop sekvenser (föregångare miRNA).
- Justera data till andra små RNA-sekvenser (med den fRNA databasen) 15.
- När alla prover är kvantifierade, definiera de differentiella uttryckt MicroRNA mellan olika grupper/prover. Förutsäga MicroRNA att inrikta valda mRNA eller mRNA som kan riktas av en selektiv miRNA använder online miRNA mål förutsägelse verktyg, såsom TargetScan 16, mikrokosmos 17 och PicTar 18 .
- Om funktionell anteckning eller väg analys behövs, lämna de förutspådda generna uppfinningsrikedom väg analys (IPA) eller DAVID.
4. Kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR) av mRNA och MicroRNA
- qRT-PCR-analys av mRNA
- extrahera RNA från 0.2-5 × 10 6 celler med en kommersiell totala RNA isolering kit som kan återställa små RNA, efter den tillverkaren ' anvisningar. Inkluderar ett DNAS jag behandling steg.
- Syntetisera cDNA från total-RNA med en första-strand cDNA syntes system med oligo-dT primer.
- Kvantifiera cDNA med qRT-PCR med lämplig grundfärg, med 2 x realtids PCR master mix med följande protokoll: 95 ° C under 15 s, 40 cykler av 94 ° C för 10 s, 60 ° C under 30 s och 72 ° C under 30 s.
- Datainsamling under 72 ° C förlängning steg och utföra smältande kurva analys från 72 till 95 ° C.
- qRT-PCR-analys av miRNA
- alikvotens RNA från de prover som bereddes i steg 4.1.1.
- Omvänd-transkribera RNA till cDNA. Använda en kommersiell mikroRNA omvänd Transkription kit, efter tillverkaren ' anvisningar.
- Utför realtids-PCR för mikroRNA använda en SYBR Green real-time PCR master mix med 250 nM mogen miRNA framåt grundfärger i samband med en universell reverse primer.
- Tina 2 x PCR Master Mix, miRNA-specifika framåt primer och universell reverse primer vid rumstemperatur. Blanda de individuella lösningarna.
- Förbereda en reaktionsblandning som följer en 25 µL-per-bra reaktionsvolym (används i 96 brunnar PCR-plattor):
2 x PCR Master Mix 12,5 µL
miRNA vidarebefordra primers (2,5 μM) 2,5 µL
Universal reverse primer (2,5 μM) 2,5 µL
RN ASE-fri water5 µL - lägga till 22,5 μL av reaktionsblandning till en PCR-plattan med 96 brunnar. Tillsätt 2,5 µL mall cDNA (50 pg-3 ng) i enskilda plattan brunnarna.
- Tätning tätt plattan filmen. Centrifugera plattan för 1 min på 1 000 x g och rumstemperatur.
- Placera plattan i den realtid apparat och starta programmet följande cykling: 95 ° C i 5 min, 40 cykler av 94 ° C för 15 s, 55 ° C för 30 s och 72 ° C under 30 s.
- Använda metoden ΔΔCt för qRT-PCR analys med ett kalkylblad. Normalisera uttrycket av den relevanta MicroRNA till uttryck för små nukleära/nukleolära RNAs Rnu6/RNU61/2, Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68 och Snord70/SNORD70.
- Statistisk analys
- utföra statistisk analys för att fastställa de p-värdena av Parade och oparade Student ' s t - test med användning av ett kalkylblad och överväga p värden < 0,05 som betydande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med våra protokoll, renat B-celler placeras med LPS (3 µg/mL) och IL-4 (5 ng/mL) för 96 h kan inducera 30-40% av kemikaliesäkerhetsrapporten till IgG1 och ~ 10% av plasma celldifferentiering. Efter behandling med HDI (500µM VPA), kemikaliesäkerhetsrapporten till IgG1 minskat till 10-20%, medan plasma celldifferentiering minskade till ~ 2% (figur 1). HDI-medierad hämning av CSR bekräftades ytterligare minskade antalet efter rekombination Iμ-Cγ1 och mogen VHDJH-Cγ1 avskrifter, som kännetecknar avslutade CSR. Mätt med qRT-PCR, visades ett uttryck för Aicda, vilket är avgörande för CSR/SHM, och Prdm1 och Xbp1, som är viktiga för plasma celldifferentiering, hämmas av VPA (figur 2).
Moduleringen av mRNA-uttryck av HDI i B-celler var mycket selektiv. Mätt som mRNA-seq i B-celler stimuleras med LPS och IL-4, endast 0,3% av dessa starkt uttryckt mRNA var uppreglerad av HDI mer än två gånger, och endast 0,36% av den starkt uttryckt (> 20 kopior/cell i B-celler utan HDI behandling) mRNA, inklusive Aicda, Prdm1, och Xbp1, minskades med HDI mer än 50% (figur 3).
Nedreglering av Aicda, Prdm1och Xbp1 uttryck kan potentiellt vara medieras av MicroRNA, som är negativa regulatorer av genuttryck. Med hjälp av miRNA inriktning prognosverktyg (TargetScan.org, miRNA.org och miRbase.org), identifierat vi flera MicroRNA som potentiellt kan rikta Aicda eller Prdm1. MiRNA-seq analysen av miRNA profilering i B-celler behandlas med HDI eller nil visade att HDI selektivt upregulate Aicda - och Prdm1 -inriktning MicroRNA (siffrorna 4-6).
Figur 1. Yta uttryck för B-cells markör B220 ytan antikropp IgG1 och plasma-cell markör CD138 analyserades av flödescytometri.
B220+ IgG1+ celler var B-celler som bytte till IgG1. B220lågCD138+ celler var plasmaceller. Procentandelen av IgG1-bytte B och plasma celler från B-celler stimuleras med LPS och IL-4 i närvaro av nil eller HDI (VPA, 500 M) för 96 h anges som siffrorna inom grindarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Uttryck av kännetecknen för slutförda CSR; mogen VHDJH-Cγ1 avskrifter och efter rekombination Iμ-Cγ1 avskrifter; och Aicda, Prdm1, Xbp1 var analyseras av qRT-PCR, normaliserade till Cd79b avskrifter och visas i ett histogram.
Genuttryck i B-celler stimuleras med LPS och IL-4 i närvaro av 500 µM VPA och relevant för genuttrycket i B celler med de samma stimuli i närvaro av nil var avbildad som 1. Uppgifterna är från tre oberoende experiment. p -värden, Parade t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. B-celler var stimuleras med LPS och IL-4 och behandlade med HDI (VPA, 500 µM) eller nil för 60 h. mRNA uttryck analyserades av mRNA-följande punkter
(A) genomsnittliga mRNA-uttrycksnivåerna i tre oberoende experiment (läsningar per kilobase per miljon mappade läsningar, RPKMs) var avbildad i spridningsdiagram. Varje tomt motsvarar en mRNA uttryck individnivå. De två streckade linjerna är tvåfaldigt linjer. Scatter tomter ligger ovanför den övre streckade linjen eller nedanför botten streckad linje indikerar mRNA som uttrycker mer än två gånger eller mindre än hälften när induceras av VPA och nil, respektive. (B) stolpdiagram skildra den genomsnittliga förändringen i mRNA-uttrycksnivåerna (genomsnittliga RPKMs från tre oberoende experiment) i LPS och IL-4-stimuleras B-celler behandlas med HDI, jämfört med dem i B-celler behandlas med noll. Endast mRNA vid en genomsnittlig RPKM > 20 i LPS och IL-4-stimulerad B celler behandlas med noll ingår. MRNA uttrycket i varje enskilt experiment, som framgår av ett spridningsdiagram (C) eller stapeldiagram (D), avbildas på samma sätt som i (A) och (B). p -värden, Parade t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. B-celler var stimuleras med LPS och IL-4 och behandlade med HDI (VPA, 500 µM) eller nil för 60 h. miRNA uttryck analyserades av miRNA-följande punkter
(A) förändringen i de genomsnittliga miRNA uttrycksnivåerna i B-celler behandlas med HDI jämfört som i B-celler behandlas med noll var avbildad av stapeldiagram. (B) ändringen i miRNA uttrycksnivåerna i B celler behandlas med HDI jämfört som i B-celler behandlas med noll i tre oberoende experiment var avbildad av stapeldiagram. Endast MicroRNA vid genomsnittliga RPM > 0,5 i LPS och IL-4-stimulerad B celler behandlas med noll ingår. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. HDI ökar uttrycket av Aicda -inriktning MicroRNA, vilket framgår av miRNA-följande punkter
(A) sequence alignment MicroRNA och deras mål webbplatser i de 3' UTR av Aicda mRNA. (B) B-celler odlades med LPS och IL-4 i närvaro eller frånvaro av HDI (VPA, 500 M) för 60 h. Ett uttryck för den MicroRNA som förutspådde att rikta Aicda 3' UTR var analyseras av miRNA-seq och skildras som RPM. p -värden, Parade t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. HDI ökar uttrycket av Prdm1 -inriktning MicroRNA, vilket framgår av miRNA-följande punkter
(A) sequence alignment MicroRNA och deras mål webbplatser i de 3' UTR av Prdm1 mRNA. (B) B-celler odlades med LPS och IL-4 i närvaro eller frånvaro av HDI (VPA, 500 M) för 60 h. uttryck för den MicroRNA som förutspådde att rikta Prdm1 3' UTR var analyseras av miRNA-seq och skildras som RPM. p -värden, Parade t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här protokollet ger omfattande strategier för att framkalla B cell klass växling och plasma celldifferentiering; att analysera deras inverkan av epigenetiska modulatorer, nämligen HDI; och för att påvisa effekten av HDI på mRNA och miRNA uttryck i dessa celler. De flesta av dessa metoder kan också användas för att analysera effekterna av epigenetiska faktor på mänskliga B-cells funktion och mRNA/miRNA uttryck. De qRT-PCR och mRNA-seq/miRNA-seq metoder kan också användas för att analysera B-celler som isolerats från möss som behandlats med epigenetiska modulatorer, såsom HDI.
Den epigenetiska modulate kan påverka många olika cellfunktioner, såsom cellproliferation och livskraft, som skulle kunna påverka CSR och plasma cell differentiering. Därför, cellproliferation, livskraft, och cellen cyklar av de B-cellerna, med eller utan HDI behandling, bör analyseras. En av utmaningarna för att analysera moduleringen av mRNA och miRNA uttryck av HDI eller andra epigenetiska regulatorer av qRT-PCR är att välja en lämplig städning gen eller små RNA. Många gemensamma städning gener kan ändras till olika grader av epigenetiska modulatorer. Uttrycksnivåerna av många olika städning gener bör mätas och används för att normalisera det specifika genuttrycket av qRT-PCR. Problemet kan också hanteras av mRNA-seq och miRNA-seq, där uttrycket av enskilda mRNA eller MicroRNA kan normaliseras av genome-wide mRNA eller miRNA nivåer.
mRNA-seq kan inte bara definiera mRNA uttryck profilen med en lämplig bioinformatik pipeline, men denna metod kan också definiera länge kodande RNA (lncRNA) profilen. mRNA-seq oftast anrikningen av poly(A) + RNAs oligo(dT) urval. Som ett antal lncRNA är kända för att sakna poly(A) svansar, kan inte de mRNA-seq strategi som omfattar oligo (dT) urval avgöra den kompletta informationen lncRNA uttryck. För att uppnå fullständig täckning av både mRNA och lncRNA uttrycket profiler, bör en RNA-seq strategi som involverar rRNA utarmning användas. I de flesta av våra experiment använder vi ett kommersiella kit till extraktet den total-RNA, inklusive miRNA, för miRNA-seq, mRNA-seq och qRT-PCR. Före att bygga en hög genomströmning sekvensering bibliotek, verifieras totalt RNA kvaliteten genom att köra en alikvot på ett automatiserat RNA, DNA och protein prov QC system. Rekommendationen är att RNA prover har en RIN antal 7.0 eller högre om de ska användas för små RNA bibliotek förberedelse. Prover med lägre RIN nummer har en högre procent av försämrade RNA produkter i storleksintervallet av små RNA arter (15-30 nucleotides). När antalet RIN är under 7.0, blir täckningen inte lika bra. Ett annat alternativ för mindre-än-idealen RNA prover är att utföra en rRNA utarmning snarare än en mRNA isolering, men detta kräver att proverna vara minst 10 ng/mL.
Protokollen för mRNA-seq används här är optimerade för 100-1000 ng av total-RNA. För miRNA-seq med mindre än 100 ng av total-RNA, små RNA-seq bibliotek beredning bör följa ett mer känsliga små RNA-seq förberedelse protokoll, som tar fördel av den naturliga strukturen vanliga till de flesta kända mikroRNA-molekyler. Mest mogna MicroRNA har en 5'-fosfat och en 3'-hydroxylgrupp till följd av deras biogenes väg. På grund av detta, är 3' och 5' korten i detta kit direkt sammanskrivna till microRNA.
För att analysera effekterna av HDI på B-cellen mRNA och miRNA uttryck i vivo, kan möss behandlas med VPA eller andra HDI genom att lägga till denna HDI dricksvattnet och intraperitoneal injektion av dessa möss med T-beroende antigen NP-CGG eller T-oberoende antigen NP-LPS kan utföras. De B-cellerna kan renas från mjälten 10 dagar efter immunisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete fick stöd av NIH grants AI 105813 och AI 079705 (till PC), bevilja alliansen för Lupus forskning Target identifiering i Lupus Grant ALR 295955 (till PC) och artrit National Research Foundation forskningen (HZ). TS stöddes av Pediatrics Medical Center, andra Xiangya sjukhuset, Central South University, Changsha, Kina, i samband med Xiangya-UT skolan läkemedel San Antonio medicinsk student besöker programmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
- Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
- White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
- Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
- Martin, J. A., Wang, Z.
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
- Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
- Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).
