Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Published: February 17, 2017 doi: 10.3791/55143
Automatic Translation
1,2,3, 4, 5
1Koch Institute for Integrative Cancer Research, Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 2Howard Hughes Medical Institute, 3Division of Health Sciences and Technology, Harvard Medical School, 4The Barbara K. Ostrom (1978) Bioinformatics and Computing Facility in the Swanson Biotechnology Center, Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 5BioMicro Center, Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology

Summary

Одно секвенирование клетка становится все более популярным и доступным инструментом для решения геномных изменений при высоком разрешении. Мы предоставляем протокол, который использует одноклеточной секвенирования для идентификации числа копий изменений в одиночных камерах.

Abstract

Обнаружение геномных изменений в одной резолюции ячейки имеет важное значение для характеристики генетической гетерогенности и эволюции в нормальных тканях, рака и микробных популяций. Традиционные методы оценки генетической гетерогенности были ограничены низким разрешением, низкой чувствительностью и / или низкой специфичности. Одно секвенирование клетка стала мощным инструментом для обнаружения генетической гетерогенности с высокой разрешающей способностью, высокой чувствительностью и, когда надлежащим образом проанализированы, высокой специфичности. Здесь мы приводим протокол для выделения, амплификации целого генома, секвенирование и анализ отдельных клеток. Наш подход позволяет надежной идентификации Мегабазе масштаба варианты количества копий в одиночных камерах. Тем не менее, аспекты данного протокола также могут быть применены для исследования других типов генетических изменений в отдельные клетки.

Introduction

Изменения в ДНК число копий может варьироваться в размерах от нескольких пар оснований (число копий вариантов) (ВКК) для целых хромосом (анеуплоидии). Скопировать номер изменения , затрагивающие большие участки генома может иметь серьезные последствия фенотипические путем изменения экспрессии до тысяч генов 1, 2. ВКК , которые присутствуют во всех клетках популяции могут быть обнаружены с помощью объемной секвенирование или микрочипов методов 3, 4. Тем не менее, население также может быть генетически гетерогенную, с ВКК существующих в подгруппе населения или даже отдельных клеток. Генетическая гетерогенность является общим при раке, вождение эволюции опухоли, а также присутствует в нормальных тканях, с неизвестным следствие 5, 6, 7, 8, 9 10.

Традиционно, генетическая гетерогенность была оценена либо цитологических подходов или навального секвенирования. Цитологические подходы, такие как флуоресценции в гибридизация (FISH), хромосомных спредов и спектральное кариотипирование (SKY) в, имеют преимущество , идентифицирующих изменений , присутствующих в отдельных клетках , но имеют высокий процент ошибок из - за артефактов гибридизации и распространения 11. Эти подходы также ограничены в своей резолюции только выявить изменения количества копий, охватывающих несколько megabases. Секвенирование или микрочипы сыпучего ДНК, хотя и выше, в точности и разрешающей способности, является менее чувствительным. Для того чтобы обнаружить генетическую гетерогенность подходами, популяционных, варианты должны присутствовать в существенной доли клеток в популяции. Появление методов для амплификации геномной ДНК из отдельных клеток позволило последовательности генома отдельных клеток. Одноместный seque ячейкаncing имеет преимущества высокого разрешения, высокой чувствительностью, и, когда применяются соответствующие методы контроля качества, высокая точность 12.

Здесь мы опишем метод обнаружения Мегабазе масштаба изменения в количестве копий в одиночных камерах. Выделим отдельные клетки с помощью микроаспирацией, амплификации геномной ДНК с использованием линкер-адаптер PCR, подготовить библиотеки для следующего поколения секвенирования, и обнаружить число копий варианты обеими скрытой марковской модели и круговой бинарной сегментации.

Protocol

1. Изолировать отдельные клетки

  1. Подготовьте microaspirator
    1. Снимите прозрачную пластиковую конец от узла аспиратор трубки и вставьте узкий конец в один конец 1 футов длиной ПВХ трубы с 3/16 "внутреннего диаметра.
    2. Вставьте выходное отверстие шприцевой фильтр 0,2 мкм в другом конце 1 футов длиной ПВХ трубки с 3/6 "с внутренним диаметром.
    3. Вставьте впуск шприцевой фильтр с размером пор 0,2 мкм в один конец 6 дюймов длиной ПВХ трубки с 5/16 "внутренним диаметром.
    4. Дополнительно: Разрежьте 6 дюймов длиной ПВХ трубы с 5/16 "внутренним диаметром пополам и вставить в линию ловушку воды между двумя половинами.
    5. Перерыв 5 мл пластмассовую серологической пипеткой на мл градации 1 и вставьте конец шнура в открытый конец трубки из ПВХ с 5/16 "внутреннего диаметра.
    6. Вставьте выпускное отверстие 5 мл пластиковой серологической пипеткой в ​​гибкий конец сборки аспиратор трубки (где прозрачный пластиковый конецбыли удалены).
    7. Для хранения, накрыть красную мундштук узла аспиратор трубки со стерильной пластиковой трубкой.
    8. Почерпните стеклянной капиллярной трубки с внутренним диаметром 10-30 мкм, путем приведения в середину трубки вблизи пламени горелки Бунзена и прикладывать напряжение на обоих концах трубки. Разбейте нарисованный трубку в середине, чтобы создать два потенциальных иглы аспиратора. Повторите этот шаг с несколькими трубками, как только некоторые трубы будут в конечном итоге с внутренним диаметром, который подходит для получения отдельных клеток.
    9. Для хранения, поместите две полоски пластилина в 15 см чашку Петри и закрепить иглы аспиратора поперек полос.
  2. Выберите клетки
    1. Подготовка суспензии отдельных клеток в зависимости от обстоятельств для типа клеток и эксперимента. Например, чтобы подготовить прилипшие клетки, такие как линии человеческих фибробластов, урожай клеток с помощью обработки трипсином и переноса клеток в коническую пробирку, содержащую соответствующий носитель.
    2. До, во время, илиосле получения одноклеточной суспензии (в зависимости от того, сколько времени потребуется, чтобы подготовить одноклеточной суспензии), установки капотом для всего генома амплификации.
      1. Спрей вниз поверхность капота, наконечник пипетки коробки и пипеток с 10% хлорной и протереть бумажным полотенцем. Повторите этот шаг с 70% этанола.
      2. Добавить 8 мкл воды из Амплификация полного генома (WGA) набор для отдельные лунки 96-луночного ПЦР планшета, один хорошо для каждой ячейки, чтобы быть секвенированы. Накройте 96-луночного ПЦР планшета с крышкой из пластины для тканевой культуры в 96-луночный и место на льду.
    3. Добавьте 1000 клеток в 10 мл среды или фосфатном буферном растворе (PBS) в 15 см чашки Петри и помещают блюдо на льду, чтобы предотвратить клетки от присоединения к чашке.
    4. Доведите клетки в чашке Петри и 96-луночного ПЦР планшета с крышкой на льду к световым микроскопом с целью 10X.
    5. Увеличение открытие аспиратора иглы, осторожно коснувшись вытянутый конец йе аспиратор иглы на твердую поверхность таким образом, чтобы кончик отламывается. Вставьте широкий конец аспиратора иглы в чистую конце microaspirator.
    6. Поместите чашку Петри, содержащую клетки на стадии микроскопа. Поместите красный мундштук аспиратора во рту. Используйте одну руку, чтобы переместить аспиратор иглу и, с другой стороны, чтобы переместить чашку Петри, содержащую клетки. Определить отдельные клетки, подлежащие секвенированию.
    7. Использование всасывания рот, нарисуйте одну ячейку в аспиратор иглу вместе с ~ 1-2 мкл среды или PBS. Перенести клетки в 8 мкл воды внутри одной лунке 96-луночного планшета для ПЦР. Избегайте введения пузырьков при переносе клетки.
    8. Повторите шаг 1.2.7, пока нужное количество клеток не были изолированы. Держите пластину ПЦР на льду и покрыта крышкой между собирание клетками. Отметьте скважины, которые получили клетки.
      1. Хотя выбирая отдельные клетки, растопить 10X одного лизис клеток и фрагментации буфера от целого гenome амплификации комплект. После выбора нужного количества клеток, немедленно приступить к амплификации целого генома.

2. Амплификация полного генома

  1. Для предотвращения загрязнения в течение всего генома амплификации, добавить все реагенты внутри капот культуре ткани, используйте пипеток с фильтрами, а также изменить кончик пипетки между скважинами.
  2. Подготовка рабочего раствора для лизиса и фрагментации буфера из комплекта Амплификация полного генома (WGA). Для каждого набора до 32 ячеек, объединить 32 мкл 10х одного лизиса клеток и фрагментации буфера и 2 мкл раствора протеиназы К в микроцентрифужных трубки. Vortex трубку для смешивания растворов.
  3. Добавить 1 мкл рабочего лизиса и фрагментации буферного раствора в каждую лунку и пипетку вверх и вниз, перемешать.
  4. Закройте планшет и запечатать все лунки с пластиковой пленкой. Кратко центрифуге пластину в мини-пластины блесны.
  5. Термический цикл, как ФолляРМО: 50 ° С, 1 ч и 99 ° С, 4 мин.
  6. Охлаждают пластину на льду и кратко центрифуге пластину в мини-пластины блесны.
  7. Подготовьте рабочую библиотеку буферного раствора препарата из набора генома амплификации целого. Для каждой ячейки, объединить 2 мкл 1x одной библиотеки ячейки буфера подготовки и 1 мкл библиотеки раствора стабилизации в микроцентрифужных трубки. Подготовка рабочего раствора для нескольких ячеек в той же самой трубки микроцентрифужных.
  8. Удалите пластиковую пленку и добавьте 3 мкл рабочей библиотеки буферного раствора препарата в каждую лунку. Пипетировать содержимое скважины вверх и вниз, перемешать. Замените пластиковую пленку.
    Примечание: Пластиковая пленка может быть повторно использована в течение всего процесса амплификации генома, пока лунки не начнут бурить отверстия в пленке. Когда это происходит, переключиться на новую пластиковую пленку.
  9. Кратко центрифугировать пластины в мини-пластины обтекателя втулки и инкубировать при 95 ° С в течение 2 мин.
  10. Охлаждают пластину на льду и краткоцентрифугировать пластину в мини пластины блесны.
  11. Удалите пластиковую пленку, добавить 1 мкл библиотеки Ферментный препарат в каждую лунку, и пипеткой содержимое скважины вверх и вниз, перемешать. Держите библиотеку фермента подготовки на льду или в холодном блоке на протяжении всего этого шага. Замените пластиковую пленку.
  12. Кратко центрифугировать пластину в мини-пластины обтекателя втулки и термического цикла следующим образом: 16 ° C, 20 мин, 24 ° C, 20 мин, 37 ° С, 20 мин, 75 ° С, 5 мин, и держать при температуре 4 ° С.
  13. Охлаждают пластину на льду и кратко центрифуге пластину в мини-пластины блесны.
  14. Подготовить рабочую смесь из амплификации набора генома амплификации целого. Для каждой ячейки, объединить 48,5 мкл воды, 7,5 мкл 10х усиления основной смеси и 5 мкл WGA ДНК-полимеразы в микроцентрифужных трубки. Подготовка рабочей смеси для нескольких ячеек в той же самой трубки микроцентрифужных. Держите рабочую смесь на льду.
  15. Удалите пластиковую пленку, добавить 61 мкл рабочего амплификации смесив каждую лунку и содержание пипетка также вверх и вниз, перемешать. Держите рабочую смесь амплификации на льду или в холодном блоке на протяжении всего этого шага. Замените пластиковую пленку.
  16. Кратко центрифугировать пластины в мини-пластины обтекателя втулки и термического цикла следующим образом: 95 ° С, 3 мин, 25 циклов при 94 ° С, 30 сек и 65 ° С, 5 мин, и держать при температуре 4 ° С.
  17. Передача 60 мкл каждого образца в отдельную пробирку микроцентрифужных и хранить при - 20 ° C для использования на стадии 3.
  18. Добавить загрузки ДНК красителя оставшегося объема каждого образца (то есть 3 мкл ДНК - 6х красителем до 15 мкл образца) и пробегать по 5 мкл от каждой реакции на агарозном геле 1%.
    Примечание: Клетки, которые успешно Усиленные будет выглядеть как мазок от 250 до 1000 пар оснований. Образцы, которые не показывают мазок или только показывают слабый мазок вряд ли даст полезные данные секвенирования.

3. Секвенирование

  1. Очищают образцы с парамагнитными гранулами.
    1. ThaW образцы ДНК на льду. Vortex парамагнитные шарики до тех пор, пока раствор не станет однородным и инкубировать бусинки при комнатной температуре в течение не менее 30 мин.
    2. Перенесите 20 мкл каждого образца ДНК в чистую центрифужную пробирку. Остальная часть образца можно хранить при -20 ° С.
    3. Добавить 30 мкл (1.5x) парамагнитных шариков для каждого образца ДНК и вихря перемешать. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 мин. Оставьте маточный раствор гранул при комнатной температуре для использования на стадии 3.4.
    4. Место труб на полоске магнитной трубки в течение 2 мин, или до тех пор, пока гранулы образуют осадок и надосадочную жидкость ясна.
    5. Использование P200 пипетки, удалить как можно больше супернатанта, насколько это возможно, не нарушая бусинки.
    6. Добавьте 180 мкл 80% этанола к ДНК-бусинка смеси. Поворот в трубки несколько раз по отношению к магниту, чтобы "прополоскать" бусинки через раствор этанола.
    7. Использование P200 пипетки, удалить как можно больше стирке этанола в качестве возможBLE, не нарушая бусинки.
    8. Повторить 3.1.6 и 3.1.7.
    9. Воздух сухой шарики в течение приблизительно 10 минут или пока не больше этанола не видно. Перейдите к следующему шагу, когда шарики появляются трещины или отвалиться стенки трубы.
    10. Удалить образцы с магнитной полосы. Добавить 40 мкл 10 мМ Трис, рН 8,0 до элюции ДНК из гранул и вихревые образцы для ресуспендирования бусин. Инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре.
    11. Кратко Центрифуга образцов для сбора жидкости в нижней части трубы и поместить пробирки на полосу магнитной трубки в течение не менее двух минут. Передача элюента в чистые микропробирок, не нарушая бусинки.
  2. Пример нормализации
    1. Вычислить концентрацию каждого образца с использованием спектрофотометра. Концентрации должен находиться в диапазоне от 10 до 30 нг / мкл.
    2. Развести каждый образец до 0,2 нг / мкл с использованием 10 мМ Трис рН 8,0. Следующие шаги потребуют минимального INput 5 мкл из этого раствора.
  3. подготовка Библиотека
    1. Подготовка библиотек секвенирования, следуя инструкциям подготовки комплекта 13 библиотеки.
  4. Заключительная уборка
    1. Очистите образцы в соответствии с этапом 3.1. Для считывания длиной 50 б.п., 75 б.п., или 150 б.п., использовать соотношение шарика к образцу объема 1.5x, 1x или 0.6x, соответственно. Элюировать 15 мкл 10 мМ Трис, рН 8,0.
    2. Запуск образцов на анализаторе фрагмента , чтобы проверить распределение размера библиотеки 14. Распределение по размерам должна быть равномерно распределена от 150 до 900 пар оснований.
  5. Количественно образцов с использованием КПЦР
    1. Использование библиотеки набора квантификации, настроить реакцию КПЦР согласно инструкции к набору 15. Оставьте столбец пустым, чтобы добавить положительные стандарты (стандарты ДНК из набора) и отрицательные стандарты (воды или другого раствора бланка).
    2. Термический цикл, как ВОЛПминимумы: 95 ° C, 5 мин (градиент скорости от 4,8 ° С / сек) и 35 циклов при 95 ° С, 30 сек (градиент скорости 4,8 ° С / с) и 60 ° С, 45 сек (градиент скорости 2,5 ° С / сек).
  6. объединение
    1. Определите, как требуется много полос на проточной ячейке и разделить образцы на группы, с одной группой на дорожку.
    2. Для каждой группы образцов, выбрать образец с самой низкой концентрацией, основываясь на данных КПЦР с этапа 3.5.2 и нормализовать все образцы в этой группе к этой концентрации с использованием 10 мМ Трис рН 8,0.
    3. Объединяют образцы в каждой группе вместе.
  7. Последовательность действий
    1. Нагрузка на бассейны секвенирования машины следующего поколения в соответствии со стандартными процедурами 16.

Анализ 4. Данные

Примечание: Среда Unix на основе требуется для запуска программ и скриптов в этом разделе. Установите программное обеспечение, указанное в протоколе после их в систему трализованную установку направляющих. Все сценарии можно найти на сайте https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/.

  1. Обрежьте читает 40-нт с использованием fastx_trimmer из FASTX-Toolkit версии 0.0.13 17.
    fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq
  2. Совместите читает соответствующий референсный геном (ММ9 для мыши, hg19 для человека) с использованием BWA версии 0.6.1 с параметрами по умолчанию 18.
    BWA AlN mm9.fa example.trim.fastq> example.sai
    BWA samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq> example.sam
  3. Удалить выравнивания для CHRM и случайных хромосом, а затем сортировать и индекс полученный BAM файл , используя SAMTools версию 0.1.19 19.
    Grep -v -w CHRM example.sam | ГРЭП -v случайное> example.filtered.sam
    samtools просмотра -uSh example.filtered.sam | samtools сортировать - example.filtered
    samtools индекс example.filtered.bam
  4. Запуск HMMcopy для обнаружения ВКК= "Xref"> 20
    1. Используйте gcCounter в HMMcopy, чтобы создать ссылочный файл процент GC для генома. Используйте опцию "-w 500000", чтобы указать размер окна. Используйте ту же версию эталонного FASTA файла, используемого на стадии 4.2, но убедитесь, что CHRM и случайные хромосомы удалены из файла Fasta.
      gcCounter -w +500000 mm9.fa> mm9_gc.wig
    2. Используйте generateMap.pl в HMMcopy для создания файла покачивания для mappability. Используйте опцию "-w 40", чтобы указать длину чтения. Используйте тот же опорный FASTA файл, используемый на этапе 4.4.1.
      generateMap.pl -b mm9.fa
      generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig
    3. Используйте mapCounter в HMMcopy, чтобы создать ссылочный файл mappability для генома. Используйте опцию "-w 500000", чтобы указать размер окна.
      mapCounter -w +500000 mm9.bigwig> mm9_map.wig
    4. Используйте readCounter в HMMcopy для создания файла покачивания для каждого файла БАМ.
      readCounter -w +500000 example.filtered.bam> input.wig Изменение пути к файлам в справочных сценариях R (run_hmmcopy.mm9.r или run_hmmcopy.hg19.r), используйте файлы , созданные выше в 4.4.1 (например, mm9_gc.wig) и 4.4.3 (например, mm9_map. парик) для gfile и MFile переменных, которые относятся к файлу процент GC ссылка файла и эталонной mappability соответственно. Затем запустите предоставленный сценарий R "run_hmmcopy.mm9.r" или "run_hmmcopy.hg19.r".
      R CMD BATCH run_hmmcopy.mm9.r
      или
      R CMD BATCH run_hmmcopy.hg19.r
    5. Для пакетной обработки набора BAM файлов, поместить файлы БАМ в одну папку и запустите предоставленный сценарий "HMMpipe.pl" в пакете для вызова сегментов и вычислить изменчивость оценок (VS). Следуйте формату:
      Perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles MM9
  5. Запуск DNAcopy для обнаружения ВКК 21.
    1. Используйте SAMtools версию 0.1.19 для извлечения однозначно сопоставляются считывает из каждого файла БАМ.
      samtools просмотра -h -F 0x0004 example.filtered.bam | -i задать расширенное "^ @ | XT: A: U" | samtools смотреть -Shu -> example.mapped.bam
    2. Используйте MarkDuplicates в Picard версии 1.94 , чтобы отметить ПЦР дубликатов в БАМ файл 22.
      Java -jar MarkDuplicates.jar ВХОД = example.mapped.bam ВЫХОД = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = верно
    3. Используйте coveragebed в bedtools версии 2.17.0 для подсчета отображенных читает в каждом из предопределенных динамического 500kb отображаемыми окна в файл BED при условии "mm9.500k.dynamic.win.bed" или "hg19.500k.dynamic.win.bed" 23 ,
      coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | сортировать -k1,1 -k2,2n> example.nondup.counts
    4. Используйте прилагаемый Perl скрипт "normalizeGC.pl" нормализовать счетчики чтения на основе при условии, ссылка файлов содержания GC "mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt" или "hg19.500k.dynamic.win.fa. gc.txt ".
      Perl normalizeGC.пл mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts> example.bam.norm.counts
    5. Используйте прилагаемый R скрипт "dnacopy.r" для вызова сегментов.
      R CMD BATCH dnacopy.r
  6. Определение ВКК
    1. Исключить клетки, для которых VS рассчитывается в 4.4.6 превышает 0,26.
    2. Фильтр сегментов , вызываемые HMMcopy в 4.4.6 , чтобы включить только те , для которых средний логарифм отношения 2 больше , чем 0,4 (предполагаемый коэффициент усиления) или менее -0,35 (предполагаемая потеря).
    3. Фильтр сегментов, вызываемые DNAcopy в 4.5.5, чтобы включить только те, для которых отрезок означают больше, чем 1,32 или менее 0,6.
    4. Перекрытие сегментов из 4.6.2 и 4.6.3, вызывая ВКК только в тех регионах, где оба HMMcopy и DNAcopy идентифицируют предполагаемую прибыль или предполагаемую потерю.

Representative Results

Собранный аспиратор должен появиться похожий на тот , на рисунке 1А. Игла должна быть обращено таким образом, что она достаточно широкая для одной ячейки, но не настолько широк, что большой объем составлен с одной ячейкой. Аспирационные отдельные клетки легче , когда есть от одного до пяти ячеек в поле 10X (Рисунок 1В).

Если весь геном амплификации является успешным, образец будет выглядеть как мазок на агарозном геле (рис 2, полосы 1, 2, 4, 5, 6 и 7). Слабое или отсутствие мазка указывает неудавшуюся реакции амплификации , и образец не должен быть секвенирован (рисунок 2, полосы 3 и 8).

После подготовки библиотеки, распределение по размерам фрагмент образцов следует оценивать с помощью капиллярного электрофореза на анализатор фрагмента.Успешно подготовленные библиотеки будут иметь достаточно равномерное распределение размеров фрагментов от 150 до 900 пар оснований (фиг.3, А, В). Ошибка подготовка библиотеки приведет к неравномерным распределением размера фрагмента и такие библиотеки не должны быть секвенированы (3С).

Обработка данных секвенирования с помощью скрытой марковской модели (HMMcopy) и круговой бинарной сегментации (DNAcopy) будет анализировать геном каждой клетки на сегменты расчетного количества копий. Эти сегменты затем могут быть отфильтрованы , чтобы идентифицировать те , с предполагаемым числом копий в соответствии с коэффициентом усиления или потери в одной ячейке (таблица 1). Эти отфильтрованные сегменты из HMMcopy и DNAcopy должны затем быть перекрыты для выявления высокого доверия ВКК.

Рисунок 1
Рисунок 1. Одиночные изоляцию клеток. ( А) Собранный microaspirator. (B) 10X поле показ диссоциируют клеток (стрелки) и microaspirator иглы (нижний правый угол). Аспирационные отдельные клетки легче, когда есть от одного до пяти ячеек в поле 10Х. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Амплификация полного генома. Электрофорез в агарозном геле 5 мкл полного генома продуктов амплификации. Образцы, которые успешно усиливающие будут отображаться в виде ярких мазков из 100 б.п. до 1 кб (полосы 1, 2, 4, 5, 6 и 7) и могут быть упорядочены. Образцы, которые не успешно усиливающие будет производить слабые мазки или не мазок (полосы 3 и 8) и не должны быть секвенировали.large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Подготовка библиотеки. Типичные результаты анализатора фрагмента. Графики показывают, что размер фрагмента (в п.н.) по оси X и относительных единицах флуоресценции (РФС) по оси Y. Справа от каждого графика представляет собой инсценировку гель пер. (А) Результаты для идеального образца, с равномерным распределением от 150 до 900 пар оснований и без резких пиков или смещения в одну сторону. Этот пример является приемлемым для секвенирования. (B) Результаты в образце, ладно с распределением по размерам перекос в сторону меньших размеров фрагментов. Хотя это не является оптимальным, образец все еще может быть секвенирован. (C) Результаты с неисправного образца, с преобладанием небольших размеров фрагментов. Это, вероятно, вызвано длительной инкубации в течение стадии tagmentationподготовки библиотеки. Этот пример не должен быть секвенированы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

HMMcopy
Образец сегмент Chr Начало Конец состояние медиана
D15-4998 23 chr8 144500001 146500000 6 0.5008794
D15-4998 29 chr10 67000001 134500000 6 0.4031945
D15-4998 52 сhr19 1 20000000 6 0.4616884
D15-4998 57 chrY 1 59500000 2 -1,506532
DNAcopy
Образец Chrom Старт бен Конец бин Начало Конец Seg среднее Seg мед
D15-4998 chr10 88 197 62612945 129971511 1,4688 0,157
D15-4998 chr19 0 31 0 28416392 1,4141 0,1674
D15-4998 chrX 77 126 51659160 95343369 1,3548 0,1874
D15-4998 chrY 0 14 0 23805358 -2,7004 0,3591

Таблица 1. Анализ данных. Отфильтрованные сегменты, генерируемые HMMcopy и DNAcopy из одной ячейки. Перекрытие этих двух результатов показывает прирост на хромосоме 10 от 67 до 130 Мб, а также усиления на хромосоме 19 от 0 до 20 Мб. Мы обнаружили , что прибыль от проксимальной части хромосомы 19 являются артефактом одноклеточ- секвенирования 12.

Discussion

Традиционно, определение ВКК и анеуплоидии на уровне отдельных клеток, необходимых цитологические методы, такие как рыба и небо. Теперь одна клетка секвенирование возникла в качестве альтернативного подхода к таким вопросам. Single секвенирование ячейка имеет преимущества по сравнению с FISH и SKY, как это и геному и высокое разрешение. Кроме того, при применении соответствующих методов контроля качества, одна ячейка секвенирование может обеспечить более надежную оценку ВКК и анеуплоидии, как он не восприимчив к гибридизации и распространения артефактов, присущих FISH и SKY. Тем не менее, многие из недавних применений одноклеточной секвенирования не были подтверждены тщательной оценки чувствительности и специфичности методов и анализов. В самом деле, некоторые из аналитических подходов , используемых в других исследованиях, связанных с высокими частотами (> 50%) ложноположительных ХНОП вызовов 12. Подход, который мы описали были тщательно протестированы с использованием клеток кпсобственное бремя ХНОП для того , чтобы определить истинные и ложные скорости обнаружения и оптимизации чувствительности и специфичности обнаружения CNV 12. Используя контроль качества и аналитических подходов, описанных в данном протоколе, примерно на 20% 5 прироста Mb, 75% 5 потерь Мб, а все ВКК превышает 10 Мб может быть обнаружен. Хотя определение частоты ложных обнаружения одиночных клеток секвенирования трудно, мы подсчитали, что это будет меньше, чем на 25%. Этот протокол может быть применен к клеткам из разных источников, сценарии могут быть изменены, чтобы настроить разрешение обнаружения CNV, и протокол может быть адаптирован для идентификации других типов геномных изменений.

Есть множество средств отделяя свежих тканей на отдельные клетки, и многие публикации описывают процедуры , оптимизированные для конкретных тканей, таких как кожа 24 и 25 мозга. Мы предпочитаем, чтобы изолировать отдельные клетки с помощью микроаспирацией, поскольку она позволяет FO R визуальная оценка каждой ячейки для секвенирования. Тем не менее, также можно выделить отдельные клетки с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS) 26 и микроканалов устройств 27. Если одиночный изолятор и весь геном амплификации осуществляется вручную, целесообразно выделить и усилить до сорока клеток в один прием. Для получения высокого качества данных секвенирования одной клетки, очень важно, что усиление отдельных геномов клеток является равномерным и полным. Мы считаем, что качество отдельных клеток изолированы, а также эффективности лизиса и усиления оказывает значительное влияние на качество данных секвенирования. Таким образом, клетки должны быть собраны из их родной среды как раз до выделения и амплификации целого генома следует начинать сразу же после того, как клетки выделяют. Кроме того, лизис и фрагментация шаг следует следовать в точности, как описано в 2,3-2,6 шагов.

"> Алгоритмы могут быть скорректированы , чтобы изменить разрешение обнаружения CNV, с противоположными эффектами на чувствительность и специфичность 12. Кроме того , можно настроить пороговые значения для обнаружения целого хромосом анеуплоидии в установке тетраплоидия 11. Тем не менее, мы находим , что наш подход ограничивается обнаружением CNVs более 5 Мб, так как шум , вводимый в течение всего генома амплификации усложняет обнаружение небольших вариантов 12. Будущие улучшения в целом подходы генома амплификации должны в конечном итоге повысить разрешение обнаружения CNV использованием одноклеточной секвенирования.

Одно секвенирование ячейка позволяет для исследования не только число копий изменений , но и отдельных вариаций 28 нуклеотидов, 29 и 30 структурных вариаций. Наш протокол для выделения одной ячейки могут быть применены, чтобы ответить на эти другие Questions. Тем не менее, выбор всего метода амплификации генома зависит от конкретного применения. Описанный в данном протоколе, который основан на полимеразной цепной реакции, лучше всего подходит для обнаружения изменений в количестве копий , поскольку оно связано с более низкими уровнями смещения 32 усиления. Для исследования других типов геномных изменений, таких как единичные нуклеотидные другие методы амплификации целого генома , как полагают, более подходящим 31, 32.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Стюарт Levine комментариев к этой рукописи. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения Грант GM056800 и Кэти и Curt Marble фонда исследования рака Ангелика Амон и частично Koch институт поддержки Грант P30-CA14051. Ангелика Амон также следователь Медицинского института Говарда Хьюза и Гленн фонда биомедицинских исследований. KAK поддерживается NIGMS Training Грант T32GM007753.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177
PVC tubing (ID 3/16", OD 5/16", ~1 foot) VWR 89068-500
PVC tubing (ID 5/16", OD 7/16", ~6 inches) VWR 89068-508
Acrodisc Syringe Filter with HT Tuffryn Membrane (diameter 25 mm, pore size 0.2 µm) VWR 28144-040
Serological pipette (5 mL) BioExpress P-2837-5 Any plastic 5 mL pipette should suffice
In-Line Water Trap for Oxygen Use Amazon.com 700220210813
Capillary Melting Point Tubes (ID 0.8-1.1 mm, 100 mm length) VWR 34502-99
Modeling clay VWR 470156-850
Petri dish (150 mm diameter) VWR 25384-326 Surface should be non-adherent to facilitate aspiration of single cells
Hard-Shell Full-Height 96-Well Semi-Skirted PCR Plates Bio-Rad HSS9601 Any 96-well PCR plate should suffice
96-well tissue culture plate VWR 62406-081 Any 96-well tissue culture plate should suffice
GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit Sigma WGA4
Microseal 'A' Film Bio-Rad MSA5001
Mini plate spinner Thomas Scientific 1225Z37
Thermal cycler Bio-Rad 1861096  Any thermal cycler should suffice so long as it can accommodate a 96-well PCR plate
Agencourt Ampure Beads Beckman Coulter A63880
Dynamag-2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Any similar magnetic tube strip should suffice
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1096
Nextera XT Index Kit Illumina FC-121-1012
Complete kit (optimized for Roche LightCycler 480) Kapa Biosystems KK4845  This kit is optimized for the Roche LightCycler 480 real-time PCR machine. If using a different machine, substitute a kit optimized for your machine.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kahlem, P. Transcript Level Alterations Reflect Gene Dosage Effects Across Multiple Tissues in a Mouse Model of Down Syndrome. Genome Res. 14 (7), 1258-1267 (2004).
  2. Torres, E. M. Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast. Science. 317 (5840), 916-924 (2007).
  3. Itsara, A. Population Analysis of Large Copy Number Variants and Hotspots of Human Genetic Disease. Am. J. Human Gen. 84 (2), 148-161 (2009).
  4. Sudmant, P. H. Global diversity, population stratification, and selection of human copy-number variation. Science. 349 (6253), aab3761 (2015).
  5. Navin, N. Inferring tumor progression from genomic heterogeneity. Genome Res. 20 (1), 68-80 (2010).
  6. Torres, L., Ribeiro, F. R., Pandis, N., Andersen, J. A., Heim, S., Teixeira, M. R. Intratumor genomic heterogeneity in breast cancer with clonal divergence between primary carcinomas and lymph node metastases. Breast cancer res and treat. 102 (2), 143-155 (2007).
  7. Yates, L. R. Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing. Nat. Med. 21 (7), 751-759 (2015).
  8. Forsberg, L. A. Age-related somatic structural changes in the nuclear genome of human blood cells. Am. J. Human Gen. 90 (2), 217-228 (2012).
  9. Laurie, C. C. Detectable clonal mosaicism from birth to old age and its relationship to cancer. Nat. Gen. 44 (6), 642-650 (2012).
  10. Jacobs, K. B. Detectable clonal mosaicism and its relationship to aging and cancer. Nat. Gen. 44 (6), 651-658 (2012).
  11. Knouse, K. A., Wu, J., Whittaker, C. A., Amon, A. Single cell sequencing reveals low levels of aneuploidy across mammalian tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (37), 13409-13414 (2014).
  12. Knouse, K. A., Wu, J., Amon, A. Assessment of megabase-scale somatic copy number variation using single-cell sequencing. Genome Res. 26 (3), 376-384 (2016).
  13. Nextera XT DNA Library Preparation Kit. at. , at: http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html (2016).
  14. Advanced Analytical Fragment Analyzer. , at: http://aati-us.com/product/fragment-analyzer (2016).
  15. KAPA Library Quantification Kit. , at: https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/ (2016).
  16. Illumina HiSeq 2000. , at: http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_instruments/hiseq_2000.html (2016).
  17. FASTX-Toolkit. , at: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2016).
  18. Burrows-Wheeler Aligner. , at: http://bio-bwa.sourceforge.net/ (2016).
  19. SAMTools. , at: http://samtools.sourceforge.net/ (2016).
  20. HMMcopy. , at: http://compbio.bccrc.ca/software/hmmcopy/ (2016).
  21. DNAcopy. , at: https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html (2016).
  22. Picard. , at: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2016).
  23. bedtools. , at: http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ (2016).
  24. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat. Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
  25. Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat. Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
  26. Navin, N. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).
  27. Szulwach, K. E., Chen, P. Single-Cell Genetic Analysis Using Automated Microfluidics to Resolve Somatic Mosaicism. PLoS ONE. 10 (8), e0135007 (2015).
  28. Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
  29. Wang, Y. Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing. Nature. 512 (7513), 155-160 (2014).
  30. Zhang, C. Z. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
  31. Macaulay, I. C., Voet, T. Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives. PLoS Genetics. 10 (1), e1004126 (2014).
  32. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nat. Rev. Gen. , 1-14 (2016).

Tags

Генетика выпуск 120 число копий изменений анеуплоидии геномная гетерогенность одну ячейку весь геном амплификации весь секвенирование генома
Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Knouse, K. A., Wu, J., Hendricks, A. … More

Knouse, K. A., Wu, J., Hendricks, A. Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing. J. Vis. Exp. (120), e55143, doi:10.3791/55143 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter