Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Påvisning af Copy Number Ændringer Brug Single Cell Sequencing

Published: February 17, 2017 doi: 10.3791/55143
Automatic Translation
1,2,3, 4, 5
1Koch Institute for Integrative Cancer Research, Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 2Howard Hughes Medical Institute, 3Division of Health Sciences and Technology, Harvard Medical School, 4The Barbara K. Ostrom (1978) Bioinformatics and Computing Facility in the Swanson Biotechnology Center, Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 5BioMicro Center, Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology

Summary

Enkelt celle sekventering er en stadig mere populær og tilgængelig redskab til at løse genomiske forandringer i høj opløsning. Vi giver en protokol, der anvender enkelt celle sekventering for at identificere kopital ændringer i enkeltceller.

Abstract

Påvisning af genomiske ændringer på enkelt celle opløsning er vigtig for karakterisering genetisk heterogenitet og evolution i normale væv, kræftformer og mikrobielle populationer. Traditionelle metoder til vurdering genetisk heterogenitet er blevet begrænset af lav opløsning, lav følsomhed, og / eller lav specificitet. Enkelt celle sekventering har vist sig som et effektivt værktøj til påvisning af genetisk heterogenitet med høj opløsning, høj følsomhed, og når, analyseres, høj specificitet. Her giver vi en protokol til isolering, hele genomet forstærkning, sekventering og analyse af enkelte celler. Vores tilgang giver mulighed for pålidelig identifikation af megabase skala kopi nummer varianter i enkelte celler. Imidlertid kan også anvendes aspekter af denne protokol til at undersøge andre typer af genetiske ændringer i enkeltceller.

Introduction

Ændringer i DNA kopital kan variere i størrelse fra flere basepar (kopital varianter) (CNVs) til hele kromosomer (aneuploidi). Kopital forandringer påvirker store områder af genomet kan have betydelige fænotypiske konsekvenser ved at ændre ekspression af op til tusinder af gener 1, 2. CNVs der er til stede i alle celler i en population kan detekteres ved bulk-sekventering eller microarray-baserede metoder 3, 4. Dog kan populationer også være genetisk heterogene, med CNVs eksisterende i en undergruppe af befolkningen eller endda enkeltceller. Genetisk heterogenitet er almindelig i kræft, kørsel tumor evolution, og også til stede i normale væv, med ukendt konsekvens 5, 6, 7, 8, 9 10.

Traditionelt var genetisk heterogenitet vurderet enten ved cytologiske metoder eller bulk-sekventering. Cytologiske metoder, såsom fluorescens in situ hybridisering (FISH), kromosomspredninger, og spektral karyotypebestemmelse (SKY), har gavn af identificere ændringer til stede i de enkelte celler, men har høje fejlprocenter grund artefakter af hybridisering og spredning 11. Disse tilgange er også begrænset i deres resolution kun afsløre kopi nummer ændringer spænder flere megabaser. Sekventering eller mikroarrays af bulk DNA, selvom højere i nøjagtighed og opløsning, er mindre følsomme. For at detektere genetisk heterogenitet ved befolkningsundersøgelser tilgange, skal varianterne være til stede i en væsentlig fraktion af celler i populationen. Fremkomsten af ​​metoder til at forstærke det genomiske DNA fra enkelte celler har gjort det muligt at genomet fra enkeltceller. Enkelt celle sequencing har fordelene ved høj opløsning, høj følsomhed, og når der anvendes egnede metoder til kvalitetskontrol, høj nøjagtighed 12.

Her beskriver vi en fremgangsmåde til påvisning megabase målestok kopital ændringer i enkeltceller. Vi isolere enkelte celler ved mikroudsugning, forstærke genomisk DNA ved hjælp af linker-adapter PCR, forberede biblioteker til næste generation sekventering, og opdage kopi nummer varianter af både skjulte Markov model og cirkulære binære segmentering.

Protocol

1. Isolering enkeltceller

  1. Forbered microaspirator
    1. Fjern det klare plastik ende fra sugerøret samling og indsæt den smalle ende i den ene ende af en 1 fods lange PVC-slanger med 3/16 "indvendig diameter.
    2. Indsæt udløbet af en 0,2 um sprøjte filter over i den anden ende af 1 mund- lange PVC rør med 3/6 "indvendig diameter.
    3. Indsæt indløb 0,2 um sprøjte filter over i den ene ende af en 6 inch lange PVC rør med 5/16 "indre diameter.
    4. Valgfrit: Skær 6 tommer lange PVC-slanger med 5/16 "indvendig diameter i halve og indsætte et in-line vandlås mellem de to halvdele.
    5. Bryde en 5 ml plast serologisk pipette på 1 ml graduering og indsætte den brudte ende ind i den åbne ende af PVC-slanger med 5/16 "indre diameter.
    6. Sæt udløbet fra 5 ml plast serologisk pipette ind i den fleksible ende af en aspirator slangesamlingen (hvor det klare plast endevar blevet fjernet).
    7. Til opbevaring, dække røde mundstykke sugerøret samling med en steril plastik rør.
    8. Trække et glas kapillarrør med en indvendig diameter på 10-30 um ved at bringe midten af ​​røret nær en bunsenbrænder flamme og tilførsel af spænding i begge ender af røret. Bræk trukket rør i midten for at skabe to potentielle emhætte nåle. Gentag dette trin med flere rør, som kun nogle rør vil ende op med en indre diameter, der er egnet til plukning enkelte celler.
    9. Til opbevaring, placere to strimler af modellervoks i en 15 cm petriskål og sikre emhætte nåle tværs strimlerne.
  2. Pick celler
    1. Forbered en enkelt celle suspension er relevant for celletype og eksperimentere. For eksempel for at fremstille adhærente celler såsom humane fibroblastcellelinier, høst celler ved trypsinisering og overførsel celler til et konisk rør indeholdende passende medier.
    2. Før, under eller enfter udarbejdelse af en enkelt celle suspension (afhængigt af hvor lang tid det tager at forberede enkelt celle suspension), opsætning motorhjelmen for hele genomet forstærkning.
      1. Spray ned overfladen af ​​hætte, pipette tip kasser, og pipettespidser med 10% blegemiddel og tørres af med et stykke køkkenrulle. Gentag dette trin med 70% ethanol.
      2. Tilsæt 8 pi vand fra hele genomet amplifikation (WGA) kit til individuelle brønde i en 96-brønds PCR-plade, til en brønd for hver celle sekventeres. Dæk 96-brønds PCR-plade med et låg fra en 96-brønds vævsdyrkningsplade og anbring på is.
    3. Tilføj 1000 celler til 10 ml medium eller phosphatbufret saltvand (PBS) i et 15 cm petriskål, og placer skålen på is for at forhindre cellerne i at klæbe til skålen.
    4. Bringe cellerne i petriskålen og 96-brønds PCR-plade med låg på is til et lysmikroskop med 10X objektiv.
    5. Forøg åbningen af ​​aspiratoren kanylen ved forsigtigt at banke den trukket ud slutningen af ​​the aspirator nål på en hård overflade, således at spidsen knækker. Sæt den brede ende af aspiratoren nålen ind i klare ende af microaspirator.
    6. Anbring petriskål indeholdende celler på objektbordet. Placer røde mundstykke aspiratoren i munden. Bruge den ene hånd til at flytte aspiratoren nål og den anden side for at flytte petriskål indeholdende celler. Identificere enkeltceller, der skal sekventeres.
    7. Brug af munden sugning, tegne en enkelt celle ind i sugeindretningen nål sammen med ~ 1-2 pi medier eller PBS. Overfør cellen i de 8 pi vand i en enkelt brønd i 96-brønds PCR-plade. Undgå at indføre bobler, når du overfører cellen.
    8. Gentag trin 1.2.7, indtil det ønskede antal celler er blevet isoleret. Hold PCR-plade på is og dækket med låg i mellem plukke celler. Markere de brønde, der har modtaget celler.
      1. Mens plukke enkelte celler, tø 10X enkelt celle lysis og fragmentering buffer fra hele genome amplificering kit. Efter plukning det ønskede antal celler, gå straks til hele genomet forstærkning.

2. Hele genomamplifikation

  1. For at undgå forurening under hele genomet forstærkning, tilføje alle reagenser inde i en vævskultur hætte, bruge pipettespidser med filtre, og ændre pipettespidsen mellem brønde.
  2. Forbered en arbejdsgruppe lyse og fragmentering bufferopløsning fra hele genomet forstærkning (WGA) kit. For hvert sæt af op til 32 celler, kombinere 32 pi 10x enkelt celle lysis og fragmentering buffer og 2 pi proteinase K-opløsning i et mikrocentrifugerør. Vortex røret for at blande opløsningerne.
  3. Tilsæt 1 pi af arbejdstiden lysis og fragmentering pufferopløsning til hver brønd og pipette op og ned for at blande.
  4. Dæk pladen og forsegle alle brønde med en plastfolie. Kort centrifugeres pladen i en mini plade spinner.
  5. Termisk cyklus som follOWS: 50 ° C, 1 time og 99 ° C, 4 min.
  6. Afkøl plade på is og kort centrifugere pladen i en mini plade spinner.
  7. Forbered en arbejdsgruppe bibliotek forberedelse bufferopløsning fra hele genomet forstærkning kit. For hver celle, kombinere 2 pi 1x enkelt celle bibliotek forberedelse buffer og 1 pi bibliotek stabilisering opløsning i et mikrocentrifugerør. Klargør arbejdsopløsningen i flere celler i samme mikrocentrifugerør.
  8. Fjern plastfilmen og tilsæt 3 pi arbejder bibliotek forberedelse pufferopløsning til hver brønd. Pipette indholdet af brønden op og ned for at blande. Erstat plastfolien.
    BEMÆRK: plastfilm kan genbruges gennem hele genomet amplifikationsprocessen indtil brøndene begynder at bore huller i filmen. Når dette sker, skifte til en ny plastfilm.
  9. Kort fortalt centrifugeres pladen i en mini plade spinner og inkuber ved 95 ° C i 2 min.
  10. Afkøl plade på is og kortcentrifugeres pladen i en mini plade spinner.
  11. Fjern plastfolie, tilsættes 1 pi bibliotek enzympræparat til hver brønd, og pipette indholdet af brønden op og ned for at blande. Hold biblioteket enzympræparatet på is eller i et koldt blok hele dette trin. Erstat plastfolien.
  12. Kort fortalt centrifugeres pladen i mini plade spinner og termisk cyklus som følger: 16 ° C, 20 min, 24 ° C, 20 min, 37 ° C, 20 min, 75 ° C, 5 min, og hold ved 4 ° C.
  13. Afkøl plade på is og kort centrifugere pladen i en mini plade spinner.
  14. Forbered en arbejdsgruppe forstærkning mix fra hele genomet forstærkning kit. For hver celle, kombinere 48,5 pi vand, 7,5 pi 10x amplifikation mastermix, og 5 pi WGA DNA-polymerase i et mikrocentrifugerør. Forbered arbejder mix for flere celler i samme mikrocentrifugerør. Hold arbejder mix på is.
  15. Fjern plastfolie, tilsættes 61 uL arbejder forstærkning mixTil hver brønd, og pipette indhold godt op og ned for at blande. Hold arbejder amplificeringsblandingen på is eller i et koldt blok hele dette trin. Erstat plastfolien.
  16. Kort fortalt centrifugeres pladen i en mini plade spinner og termisk cyklus som følger: 95 ° C, 3 min, 25 cyklusser ved 94 ° C, 30 sekunder og 65 ° C, 5 min, og hold ved 4 ° C.
  17. Overførsel 60 pi af hver prøve til et separat mikrocentrifugerør og opbevares ved - 20 ° C til anvendelse i trin 3.
  18. Tilføj DNA loading dye til den resterende mængde af hver prøve (dvs. 3 pi 6x DNA loading dye til 15 pi prøve) og køre 5 pi fra hver reaktion på en 1% agarosegel.
    BEMÆRK: Celler, der med held forstærkede vises som en podning fra 250 til 1000 bp. Prøver, som ikke viser en smøre eller kun viser en svag smear er usandsynligt at give brugbare sekventering data.

3. Sekventering

  1. Oprens prøver med paramagnetiske perler.
    1. thaw DNA-prøver på is. Vortex paramagnetiske kugler, indtil opløsningen er homogen og inkuber perlerne ved stuetemperatur i mindst 30 min.
    2. Overfør 20 pi af hver DNA-prøve til et rent mikrocentrifugerør. Resten af ​​prøven kan opbevares ved -20 ° C.
    3. Tilsæt 30 pi (1,5x) af paramagnetiske perler til hver DNA-prøve og vortex at blande. Inkuber prøverne ved stuetemperatur i 10 minutter. Efterlad stamopløsningen af ​​perler ved stuetemperatur i anvendelse i trin 3.4.
    4. Anbring glassene på et magnetisk rør strimmel i 2 min, eller indtil perlerne danner en pellet, og supernatanten er klar.
    5. Ved hjælp af en P200 pipette, fjerne så meget af supernatanten som muligt uden at forstyrre perlerne.
    6. Tilføj 180 pi af 80% ethanol til DNA-perleblanding. Rotere rørene flere gange i forhold til magneten til "skylle" perlerne gennem ethanolopløsningen.
    7. Ved hjælp af en P200 pipette, fjerne så meget af ethanolen vask som muble uden at forstyrre perlerne.
    8. Gentag 3.1.6 og 3.1.7.
    9. Lufttørre perlerne i ca. 10 min eller indtil der ikke mere ethanol er synlig. Fortsæt til det næste trin, når perlerne vises revnet eller falde ned fra væggen af ​​røret.
    10. Fjern prøverne fra magnetstriben. Tilsæt 40 ​​pi af 10 mM Tris pH 8,0 til eluering af DNA fra perlerne og vortex prøverne for at resuspendere perlerne. Inkuber i 2 minutter ved stuetemperatur.
    11. Kort fortalt centrifugeres prøverne til opsamling af væsken ved bunden af ​​røret og placere rørene på en magnetisk rør strimmel i mindst to minutter. Overfør eluenten i rene mikrocentrifugerør uden at forstyrre perlerne.
  2. Prøve normalisering
    1. Kvantificere koncentrationen af ​​hver prøve ved anvendelse af et spektrofotometer. Koncentrationerne bør ligge fra 10 til 30 ng / uL.
    2. Fortynd hver prøve til 0,2 ng / pi anvendelse af 10 mM Tris pH 8,0. De følgende trin vil kræve et minimum ikommet input af 5 pi fra denne fortynding.
  3. Bibliotek forberedelse
    1. Forbered sekventering biblioteker ved at følge instruktionerne i biblioteket forberedelse kit 13.
  4. Afsluttende oprydning
    1. Rens prøverne ifølge trin 3.1. For læste længder på 50 bp, 75 bp, eller 150 bp, bruge et forhold mellem perle at prøve volumen 1,5x, 1x eller 0,6x, hhv. Eluer med 15 pi af 10 mM Tris pH 8,0.
    2. Kør prøverne på et fragment analysator at kontrollere størrelsesfordelingen af biblioteket 14. Fordelingen størrelse bør være jævnt spredes fra 150 til 900 bp.
  5. Kvantificere prøver ved hjælp af qPCR
    1. Ved hjælp af et bibliotek kvantificering kit, nedsat en qPCR reaktion ifølge kit instruktioner 15. Efterlad en kolonne tomt for at tilføje positive standarder (DNA standarder fra sættet) og negative standarder (vand eller anden blank opløsning).
    2. Termisk cyklus som folmåde: 95 ° C, 5 min (stigningsgrad på 4,8 ° C / sekund) og 35 cykler ved 95 ° C, 30 sek (stigningsgrad på 4,8 ° C / sekund) og 60 ° C, 45 sek (stigningsgrad på 2,5 ° C / sek).
  6. pooling
    1. Bestem hvor mange baner på flow-cellen er nødvendige, og opdele prøverne i grupper, med en gruppe per bane.
    2. For hver gruppe af prøver, vælger prøven med den laveste koncentration baseret på qPCR data fra trin 3.5.2 og normalisere alle prøver i denne gruppe til at koncentration på 10 mM Tris pH 8,0.
    3. Pool prøverne i hver gruppe sammen.
  7. Sekventering
    1. Load pools på næste generation sekventering maskine efter standardprocedurer 16.

4. Data Analysis

BEMÆRK: En Unix-baserede miljø kræves for at køre programmer og scripts i denne sektion. Installer softwaren nævnt i protokollen efter deres i monterings- vejledninger. Alle scripts kan findes på https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/.

  1. Trim den læser til 40-nt hjælp fastx_trimmer fra FASTX-Toolkit-version 0.0.13 17.
    fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq
  2. Juster læser til den relevante henvisning genom (MM9 for mus, hg19 for menneskelig) ved hjælp af BWA-version 0.6.1 med standardindstillingerne 18.
    BWA ALN mm9.fa example.trim.fastq> example.sai
    BWA SAMSE mm9.fa example.sai example.trim.fastq> example.sam
  3. Fjern tilpasninger til chrM og tilfældige kromosomer, så sortere og indeksere den resulterende BAM filen ved hjælp SAMTools udgave 0.1.19 19.
    grep -v -w chrM example.sam | grep -v tilfældig> example.filtered.sam
    samtools se -uSh example.filtered.sam | samtools slags - example.filtered
    samtools indeks example.filtered.bam
  4. Kør HMMcopy at opdage CNVs= "Xref"> 20
    1. Brug gcCounter i HMMcopy at generere en GC procent referencefil for genomet. Brug indstillingen "-w 500000" for at angive vinduets størrelse. Brug den samme version af FASTA henvisningen fil, der bruges i trin 4.2, men sørg chrM og tilfældige kromosomer fjernes fra FASTA fil.
      gcCounter -w 500000 mm9.fa> mm9_gc.wig
    2. Brug generateMap.pl i HMMcopy at generere en vrikke fil til mappability. Brug indstillingen "-w 40" for at angive læse længde. Brug samme fasta henvisningen fil, der bruges i trin 4.4.1.
      generateMap.pl -b mm9.fa
      generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig
    3. Brug mapCounter i HMMcopy at generere en mappability referencefil for genomet. Brug indstillingen "-w 500000" for at angive vinduets størrelse.
      mapCounter -w 500000 mm9.bigwig> mm9_map.wig
    4. Brug readCounter i HMMcopy at generere en vrikke fil for hver BAM-fil.
      readCounter -w 500000 example.filtered.bam> input.wig Ændre stierne til reference- filer i R-scripts (run_hmmcopy.mm9.r eller run_hmmcopy.hg19.r), bruge filer genereret ovenfor i 4.4.1 (f.eks mm9_gc.wig) og 4.4.3 (f.eks mm9_map. paryk) for variablerne gfile og mfile, der henvises til GC procentvise referencefilen og mappability henvisning fil hhv. Kør derefter billede R scriptet "run_hmmcopy.mm9.r" eller "run_hmmcopy.hg19.r".
      R CMD BATCH run_hmmcopy.mm9.r
      eller
      R CMD BATCH run_hmmcopy.hg19.r
    5. For batch forarbejdning af et sæt af BAM-filer, satte BAM filer i en enkelt mappe og køre billede script "HMMpipe.pl" i pakken at kalde segmenter og beregne variabilitet scorer (VS). Følge formatet:
      perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles MM9
  5. Kør DNAcopy til påvisning CNVs 21.
    1. Brug SAMtools udgave 0.1.19 at udtrække entydigt kortlagt læser fra hver BAM fil.
      samtools se -h -F 0x0004 example.filtered.bam | egrep -i "^ @ | XT: A: U" | samtools se -Shu -> example.mapped.bam
    2. Brug MarkDuplicates i Picard-version 1.94 for at markere PCR dubletter i BAM-fil 22.
      java -jar MarkDuplicates.jar INPUT = example.mapped.bam OUTPUT = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = true
    3. Brug coveragebed i bedtools udgave 2.17.0 til tæller kortlagt lyder i hvert af de foruddefinerede dynamiske 500KB konfigurerbare vinduer i den medfølgende BED filen "mm9.500k.dynamic.win.bed" eller "hg19.500k.dynamic.win.bed" 23 .
      coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | sortere -k1,1 -k2,2n> example.nondup.counts
    4. Brug den medfølgende Perl script "normalizeGC.pl" at normalisere de læste tæller baseret på den medfølgende GC-indhold henvisning filen "mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt" eller "hg19.500k.dynamic.win.fa. gc.txt ".
      perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts> example.bam.norm.counts
    5. Brug det billede R scriptet "dnacopy.r" for at ringe segmenterne.
      R CMD BATCH dnacopy.r
  6. Identificer CNVs
    1. Udelukke celler, for hvilke VS beregnet i 4.4.6 overstiger 0,26.
    2. Filter segmenter kaldet af HMMcopy i 4.4.6 til kun at omfatte dem, for hvilke median log 2-forholdet er større end 0,4 (formodet gevinst) eller mindre end -0,35 (formodet tab).
    3. Filter segmenter kaldet af DNAcopy i 4.5.5 til kun at omfatte dem, for hvilke segmentet betyder, er større end 1,32 eller mindre end 0,6.
    4. Overlap segmenterne fra 4.6.2 og 4.6.3, kalder CNVs kun i regioner, hvor både HMMcopy og DNAcopy identificere et formodet gevinst eller formodet tab.

Representative Results

Den samlede aspirator bør ligne den i figur 1A. Nålen skal udformes således, at det er tilstrækkeligt bredt til at rumme en enkelt celle, men ikke så bred, at et stort volumen er udarbejdet med enkelt celle. Udsugning af enkelte celler er lettest, når der er mellem en og fem celler i en 10X felt (figur 1B).

Hvis hele genomamplifikation godkendes, vil prøven blive vist som en udstrygning på en agarosegel (figur 2, bane 1, 2, 4, 5, 6, og 7). En svag eller fraværende smear angiver en mislykket amplifikationsreaktion og prøven bør ikke sekventeret (figur 2, bane 3 og 8).

Efter bibliotek forberedelse, skal fragmentet størrelsesfordelingen af ​​prøverne vurderes ved kapillær elektroforese på en fragment analysator.Succesfuld tilberedte biblioteker vil have en temmelig jævn fordeling af fragmentstørrelser 150-900 bp (figur 3, A, B). Mislykkedes bibliotek præparat vil resultere i en skæv fragment størrelsesfordeling og sådanne biblioteker skal ikke sekventeret (figur 3C).

Behandling sekventering data gennem den skjulte Markov-modellen (HMMcopy) og cirkulære binære segmentering (DNAcopy) vil analysere genomet af hver celle i segmenter af skønnet kopi nummer. Disse segmenter kan derefter filtreres for at identificere dem med en anslået kopital overensstemmelse med gevinster eller tab i en enkelt celle (tabel 1). Disse filtrerede segmenter fra HMMcopy og DNAcopy bør derefter overlappes for at identificere høj selvtillid CNVs.

figur 1
Figur 1. Enkelt celle isolation. ( A) Et samlet microaspirator. (B) En 10X felt viser dissocierede celler (pile) og microaspirator nål (nederste højre hjørne). Udsugning af enkelte celler er lettest, når der er mellem et og fem celler i en 10X felt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Hele genomamplifikation. Agarosegelelektroforese af 5 pi hele genomet amplifikationsprodukter. Prøver, der med succes forstærker vises som lyse smears fra 100 bp til 1 kb (bane 1, 2, 4, 5, 6 og 7), og kan sekventeres. Prøver, der ikke med held forstærker vil producere svage udstrygninger eller ingen udtværing (bane 3 og 8) og bør ikke sekventeret.large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Bibliotek forberedelse. Repræsentative resultater fra et fragment analysator. Graferne viser fragment størrelse (i bp) på X-aksen og relative fluorescensenheder (RFU) på Y-aksen. Til højre for hver graf er en simuleret gel lane. (A) Resultater for en ideel prøve, med en jævn fordeling mellem 150 og 900 bp og uden skarpe toppe eller fordomme mod den ene side. Denne prøve er acceptabelt for sekventering. (B) Resultater fra en okay prøve, med en størrelsesfordeling skæv mod lavere fragment størrelser. Selvom dette ikke er optimal, kan prøven stadig sekventeres. (C) Resultater fra en mislykket prøve, med overvejende lille fragment størrelser. Dette er sandsynligvis forårsaget af langvarig inkubation under tagmentation trinaf biblioteket præparat. Denne prøve skal ikke sekventeret. Klik her for at se en større version af dette tal.

HMMcopy
Prøve Segment Chr Start Ende Stat median
D15-4998 23 CHR8 144.500.001 146.500.000 6 0.5008794
D15-4998 29 CHR10 67.000.001 134.500.000 6 0.4031945
D15-4998 52 chr19 1 20.000.000 6 0.4616884
D15-4998 57 chrY 1 59.500.000 2 -1,506532
DNAcopy
Prøve Chrom Start bin End bin Start Ende Seg middelværdi Seg with
D15-4998 CHR10 88 197 62.612.945 129.971.511 1,4688 0,157
D15-4998 CHR19 0 31 0 28.416.392 1,4141 0,1674
D15-4998 chrX 77 126 51.659.160 95.343.369 1,3548 0,1874
D15-4998 chrY 0 14 0 23.805.358 -2,7004 0,3591

Tabel 1. Dataanalyse. Filtreret segmenter genereret af HMMcopy og DNAcopy fra en enkelt celle. Overlappende disse to resultater afslører en gevinst på kromosom 10 fra 67 til 130 Mb samt en gevinst på kromosom 19 fra 0 til 20 Mb. Vi har fundet, at gevinster på den proksimale del af kromosom 19 er en artefakt af enkelt celle sekventering 12.

Discussion

Traditionelt, identificere CNVs og aneuploidi på niveau med enkelte celler krævede cytologiske metoder såsom FISH og SKY. Nu har enkelt celle sekventering dukket op som en alternativ metode til sådanne spørgsmål. Enkelt celle sekventering har fordele i forhold til FISH og SKY, da det er både genom-dækkende og høj opløsning. Desuden, når egnede metoder kvalitetskontrol anvendes, kan enkelt celle sekventering give en mere pålidelig vurdering af CNVs og aneuploidi da det ikke er modtagelig for hybridiserings- og spreder artefakter er forbundet med FISH og SKY. Men mange af de seneste anvendelser af enkelt celle sekventering er ikke blevet underbygget af en grundig vurdering af følsomheden og specificiteten af ​​metoder og analyser. Faktisk er nogle af de analytiske teknikker, som andre undersøgelser forbundet med høje frekvenser (> 50%) af falsk positiv CNV opkald 12. Den fremgangsmåde beskriver vi er blevet grundigt testet under anvendelse af celler af knegen CNV byrde for at bestemme sande og falske opdagelse satser og optimere følsomheden og specificiteten af CNV afsløring 12. Brug af kvalitetskontrol og analytiske tilgange, der er beskrevet i denne protokol, ca. 20% af 5 Mb gevinster, 75% af 5 Mb tab, og alle CNVs over 10 Mb kan påvises. Selvom bestemme den falske opdagelse på enkelt celle sekventering er svært, har vi estimeret, at det er mindre end 25%. Denne protokol kan anvendes til celler fra en række forskellige kilder, kan de scripts modificeres for at justere opløsningen af ​​CNV detektion, og protokollen kan tilpasses til at identificere andre typer af genomiske ændringer.

Der er en række forskellige midler til at dissociere friske væv i enkelte celler, og mange publikationer beskriver procedurer optimeret til specifikke væv, såsom hud 24 og hjerne 25. Vi foretrækker at isolere enkelte celler ved mikroudsugning da det giver mulighed fo r visuel vurdering af hver celle, der skal sekventeres. Det er imidlertid også muligt at isolere enkelte celler ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) 26 og mikrofluidenheder 27. Hvis enkelt celle isolation og hele genomet forstærkning udføres manuelt, er det rimeligt at isolere og forstærke op til fyrre celler i et enkelt møde. For at opnå en høj kvalitet enkelt celle sekventeringsdata, er det afgørende, at amplifikation af encellede genomer er ensartet og fuldstændig. Vi finder, at kvaliteten af ​​enkeltceller isoleret samt effektiviteten af ​​lysis og amplifikation har en betydelig indvirkning på kvaliteten af ​​sekventeringsdata. Som sådan bør cellerne høstes fra deres native miljø lige før isolering og hele genomet amplifikation bør begynde umiddelbart efter celler isoleres. Endvidere bør lysis og fragmentering trin følges nøjagtigt som beskrevet i trin 2.3-2.6.

"> Algoritmerne kan justeres for at ændre opløsningen af CNV afsløring, med modsatrettede effekter på sensitivitet og specificitet 12. Det er også muligt at justere tærsklerne til at afsløre hele-kromosom aneuploidi i fastsættelsen af tetraploidy 11. Men finder vi, at vores tilgang er begrænset til påvisning CNVs større end 5 Mb, som støj indført under hele genomamplifikation komplicerer påvisning af mindre varianter 12. Fremtidige forbedringer i hele genom forstærkning tilgange bør i sidste ende øge opløsningen af CNV detektion ved hjælp enkelt celle sekventering.

Enkelt celle sekventering muliggør undersøgelse af ikke blot kopi nummer ændringer, men også enkelte nucleotidvariationer 28, 29 og strukturel variation 30. Vores protokol til enkelt celle isolation kan anvendes til at besvare disse andre questions. Men valget af hele genomet amplifikationsmetode afhænger af den specifikke anvendelse,. Fremgangsmåden beskrevet i denne protokol, som er baseret på polymerasekædereaktion metode, er bedst egnet til påvisning kopital ændringer fordi det er forbundet med lavere niveauer af forstærkning skævhed 32. For at undersøge andre typer af genomiske ændringer, såsom enkeltnukleotid-polymorfismer, er andre metoder til hel genomamplifikation menes at være mere egnet 31, 32.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Stuart Levine for kommentarer til dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grant GM056800 og Kathy og Curt Marble Cancer Research Fund til Angelika Amon og delvis af Koch Institute Support Grant P30-CA14051. Angelika Amon er også en efterforsker af Howard Hughes Medical Institute og Glenn Foundation for Biomedical Research. KAK er støttet af NIGMS Training Grant T32GM007753.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177
PVC tubing (ID 3/16", OD 5/16", ~1 foot) VWR 89068-500
PVC tubing (ID 5/16", OD 7/16", ~6 inches) VWR 89068-508
Acrodisc Syringe Filter with HT Tuffryn Membrane (diameter 25 mm, pore size 0.2 µm) VWR 28144-040
Serological pipette (5 mL) BioExpress P-2837-5 Any plastic 5 mL pipette should suffice
In-Line Water Trap for Oxygen Use Amazon.com 700220210813
Capillary Melting Point Tubes (ID 0.8-1.1 mm, 100 mm length) VWR 34502-99
Modeling clay VWR 470156-850
Petri dish (150 mm diameter) VWR 25384-326 Surface should be non-adherent to facilitate aspiration of single cells
Hard-Shell Full-Height 96-Well Semi-Skirted PCR Plates Bio-Rad HSS9601 Any 96-well PCR plate should suffice
96-well tissue culture plate VWR 62406-081 Any 96-well tissue culture plate should suffice
GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit Sigma WGA4
Microseal 'A' Film Bio-Rad MSA5001
Mini plate spinner Thomas Scientific 1225Z37
Thermal cycler Bio-Rad 1861096  Any thermal cycler should suffice so long as it can accommodate a 96-well PCR plate
Agencourt Ampure Beads Beckman Coulter A63880
Dynamag-2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Any similar magnetic tube strip should suffice
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1096
Nextera XT Index Kit Illumina FC-121-1012
Complete kit (optimized for Roche LightCycler 480) Kapa Biosystems KK4845  This kit is optimized for the Roche LightCycler 480 real-time PCR machine. If using a different machine, substitute a kit optimized for your machine.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kahlem, P. Transcript Level Alterations Reflect Gene Dosage Effects Across Multiple Tissues in a Mouse Model of Down Syndrome. Genome Res. 14 (7), 1258-1267 (2004).
  2. Torres, E. M. Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast. Science. 317 (5840), 916-924 (2007).
  3. Itsara, A. Population Analysis of Large Copy Number Variants and Hotspots of Human Genetic Disease. Am. J. Human Gen. 84 (2), 148-161 (2009).
  4. Sudmant, P. H. Global diversity, population stratification, and selection of human copy-number variation. Science. 349 (6253), aab3761 (2015).
  5. Navin, N. Inferring tumor progression from genomic heterogeneity. Genome Res. 20 (1), 68-80 (2010).
  6. Torres, L., Ribeiro, F. R., Pandis, N., Andersen, J. A., Heim, S., Teixeira, M. R. Intratumor genomic heterogeneity in breast cancer with clonal divergence between primary carcinomas and lymph node metastases. Breast cancer res and treat. 102 (2), 143-155 (2007).
  7. Yates, L. R. Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing. Nat. Med. 21 (7), 751-759 (2015).
  8. Forsberg, L. A. Age-related somatic structural changes in the nuclear genome of human blood cells. Am. J. Human Gen. 90 (2), 217-228 (2012).
  9. Laurie, C. C. Detectable clonal mosaicism from birth to old age and its relationship to cancer. Nat. Gen. 44 (6), 642-650 (2012).
  10. Jacobs, K. B. Detectable clonal mosaicism and its relationship to aging and cancer. Nat. Gen. 44 (6), 651-658 (2012).
  11. Knouse, K. A., Wu, J., Whittaker, C. A., Amon, A. Single cell sequencing reveals low levels of aneuploidy across mammalian tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (37), 13409-13414 (2014).
  12. Knouse, K. A., Wu, J., Amon, A. Assessment of megabase-scale somatic copy number variation using single-cell sequencing. Genome Res. 26 (3), 376-384 (2016).
  13. Nextera XT DNA Library Preparation Kit. at. , at: http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html (2016).
  14. Advanced Analytical Fragment Analyzer. , at: http://aati-us.com/product/fragment-analyzer (2016).
  15. KAPA Library Quantification Kit. , at: https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/ (2016).
  16. Illumina HiSeq 2000. , at: http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_instruments/hiseq_2000.html (2016).
  17. FASTX-Toolkit. , at: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2016).
  18. Burrows-Wheeler Aligner. , at: http://bio-bwa.sourceforge.net/ (2016).
  19. SAMTools. , at: http://samtools.sourceforge.net/ (2016).
  20. HMMcopy. , at: http://compbio.bccrc.ca/software/hmmcopy/ (2016).
  21. DNAcopy. , at: https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html (2016).
  22. Picard. , at: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2016).
  23. bedtools. , at: http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ (2016).
  24. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat. Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
  25. Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat. Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
  26. Navin, N. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).
  27. Szulwach, K. E., Chen, P. Single-Cell Genetic Analysis Using Automated Microfluidics to Resolve Somatic Mosaicism. PLoS ONE. 10 (8), e0135007 (2015).
  28. Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
  29. Wang, Y. Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing. Nature. 512 (7513), 155-160 (2014).
  30. Zhang, C. Z. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
  31. Macaulay, I. C., Voet, T. Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives. PLoS Genetics. 10 (1), e1004126 (2014).
  32. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nat. Rev. Gen. , 1-14 (2016).

Tags

Genetik kopiere nummer ombygning aneuploidi genomisk heterogenitet enkelt celle hele genomet forstærkning hele genomet sekventering
Påvisning af Copy Number Ændringer Brug Single Cell Sequencing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Knouse, K. A., Wu, J., Hendricks, A. … More

Knouse, K. A., Wu, J., Hendricks, A. Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing. J. Vis. Exp. (120), e55143, doi:10.3791/55143 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter