Summary
我々は、マウスでの疲労のような挙動を誘発することを目標と周辺照射を使用する方法について説明します。選択された非致死照射線量は、自発的ホイールランニング活動の一週間の削減につながります。
Abstract
がん関連疲労（CRF）は、しばしば放射線療法を含む癌治療を受けている患者に影響を与える悲惨な、高価な状態です。ここでは、マウスでの疲労のような挙動を誘発することを目標と周辺照射を使用する方法について説明します。適切なシールドでは、照射は、骨盤の癌を有する個人が受けた放射線治療をモデル化するための努力で、脳を温存、マウスの下腹部/骨盤領域を対象としています。私たちは、明らかな病的状態を引き起こすことなく、自発的ホイールランニング活動（VWRA）により測定したマウスにおける疲労のような挙動を誘導するのに十分な照射線量を提供します。車輪走行がマウスにおいて正常な、自発的な行動であるため、その使用は、他の行動試験または生物学的な対策にはほとんど交絡効果を持っている必要があります。したがって、車輪走行疲労の挙動および生物学的相関を理解するで実現可能な結果の尺度として使用することができます。 CRFは頻繁に共同で複雑な状態であります罹患率、およびおそらく両方癌およびその種々の処理に関連した原因があります。このホワイトペーパーで説明する方法は、疲労のような末梢性トリガーが、集中駆動型行動の開発と持続性を説明することができる生物学的ネットワークを探索するために、より一般的に、CRFの発展に貢献し、放射線誘発性の変化を調査するために有用です。
Introduction
がん関連疲労（CRF）は、しばしば癌治療1を受けている患者に影響を与える悲惨な、高価な状態です。疲労は、最近の活性に比例も残りによって軽減でもない、それは気分、意欲、関心、および認知2に関連する擾乱の多種多様に関連付けられています。ヘモグロビンレベルおよび種々のホルモン系の機能である場合においても、炎症およびサイトカインのレベルと相関することが多くの場合に示されているがCRFの生物学的な原因は、不明である（参照Saligan ら 3生物学のレビューのためにCRFの研究）。
動物モデルを用いて制御の研究では、この複雑な条件に関連付けられた動作と生物学を理解するために必要です。一方、腫瘍関連4または化学療法に関連した5、6脂肪igueは齧歯類モデルで研究されている、CRFの病因は、治療特異的であってもよいです。放射線療法に関連するCRFを調べるために、我々のグループは最近、照射疲労7のマウスモデルを開発しました。脳または全身照射8,9を含む既存のCRFモデルとは対照的に、このモデルは、中央駆動型の挙動の変化は、疲労のような、末梢標的照射手順によってトリガすることができる方法を探ります。
ここで説明する手順は、照射による下腹部/骨盤領域を標的とするために、鉛の遮蔽を使用して、骨盤のがん患者に投与、放射線療法をモデル化するために設計されています。しかし、鉛遮蔽または実験動物へのその配置を相対的に変更することによって、この手順は、身体の他の部分の照射をモデル化するために適合させることができます。自主ホイールランニング活動（VWRA）は疲労のようなbehavioを測定するために使用されますR;それが自発的かつ正常な動作10だから、それは他の行動と生物学的試験の同時使用を可能にしなければなりません。我々は、末梢照射明白な病的状態7を引き起こすことなく、マウスにおけるVWRAを低減するのに十分であることを見出しました。このモデルを用いた将来の実験は、免疫および他の生物学的シグナル伝達に対する末梢照射だけでなく、CRFに関連した赤字を生み出すことができる中枢神経系の下流の変化の影響を明らかに役立つことがあります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
倫理に関する声明：この研究は、米国立衛生研究所（NIH）動物実験委員会によって承認されました。動物の取り扱いと研究成果の測定に参加するすべての研究者が適切に動物管理使用のNIH事務所と国立心肺血液研究所マウス表現型コアによって訓練されました。本研究で用いたすべての動物実験の側面、住宅、環境条件は実験動物の管理と使用11用のガイドを遵守していました。
1.住宅と実験動物
注：ハウス実験を通して個別に（到着時にはおよそ5週齢）の雄C57BL / 6マウスと食物および水を自由摂取のアクセスを提供します。すべてのケージは、光位相が午後6時午前6時と暗期で始まると12：12時間の明暗サイクルで保持されます。
- マウスを特定し、個々の標準換気に割り当てますDマウスケージ。回復するための識別手続き後24時間を許可します。
注：テール入れ墨が耳タグが走行輪に引っ掛かる可能性を排除するための識別の手段として推奨されています。マウスのケージに書かれた番号と一致する尾の数字で、各マウスの尾の数刺青。 - 1日3分間静かに各マウスを扱う、マウスは、少なくとも3日間以上ケージに順応することを可能にします。
ホイール順化およびベースラインを実行している2
- 個々のVWRAケージ、連続記録のための電子カウンタに接続されたランニングホイールを装備し、それぞれにマウスをご紹介します。
注：すべてのホイールカウンタは、単一のUSBインターフェイスを介してコンピュータに接続する（材料リストを参照してください）。コンピュータソフトウェアは、距離が指定された総duratioの各指定の時間間隔を横切って旅し、平均速度、車輪の回転数を算出し、n個。記録が停止すると、データが自動的にテキストとしてとスプレッドシートの両方として保存されます。 - コンピュータソフトウェアインタフェースを介してVWRAの記録を開始します。少なくとも5日間に1時間と持続時間に間隔を記録する設定します。少なくとも5日間VWRAを記録し続けます。
注：ステップ2.2の終わりに、すべてのマウスは、毎日の車輪走行活動の比較的一定量を達成する必要があります。そうでない場合には、任意の外れ値を識別して排除します。 - VWRAはソフトウェアインタフェースを介して記録を停止し、（車輪を実行せずにケージ）ステップ1.1で説明したそれらの標準ケージにマウスを返します。
- 偽照射対照または照射群のいずれかにマウスをランダム。
3.照射
注：3つの連続した日間、1日に1回、両方のグループにすべてのマウスに対して、次の手順を実行します。毎日同じ順序でマウスを扱います。
- の腹腔内注射することにより、各マウスを麻酔ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）の混合物。
- つま先のピンチで麻酔を確認し、麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に軟膏を使用しています。
- 鉛遮蔽装置に麻酔マウスを転送します。唯一の下腹部/骨盤領域が露出するようにシールドにマウスを配置します。
注：シールドは、それはマウスの小、標的領域への放射線被曝を可能にするの間の狭いオープンスペースで「ボックス」2本のリードで構成されている（ 図1参照）。 - シールド内の位置でマウスの尾の付け根を確保するために医療用テープを使用してください。
注：ステップ3.4はオプションですが、そうすることが、マウスの位置は、次のステップ中に変化しないことを確実にするのに役立つことができます。 - シールド内の動物の位置が維持されることを確認して、照射に遮蔽装置を運びます。
- マウスは照射群である場合、DOSで800センチグレイをお届け約110センチグレイ/分の電子速度。マウスは、偽照射対照群である場合には、等価時間のために非アクティブ照射でマウスを残します。
注：最適な照射装置の設定は、特定のデバイスに依存します。 137セシウム源から送ら110センチグレイ/分の線量率は、ここで使用される照射の中央の線量率です。露光時間は800 cGyで、所望の総用量に達するように調整しました。 - 照射とシールドからマウスを外し、ステップ1.1で説明した元の、標準のケージに戻します。
- それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで継続的にマウスを監視します。
4.放射線誘発疲労測定
- 照射の3日連続の完了後に日に、ステップ2.1で説明した個々のVWRAケージにマウスを転送します。
- ここで録音設定を除いて、ステップ2.2で説明したように録音VWRA、15日以上の期間。 15日の終わりには、手動でソフトウェアインタフェースを介してVWRA記録を停止します。
注：各記録期間からのデータは自動的に記録の期間を通して、すべての動物（列）と、すべての間隔（行）のための回転、距離、速度の測定値をそれぞれ含むスプレッドシートとして保存されます。前照射VWRAのための1つ、および照射後VWRAための1：実験の終了時に、記録ソフトウェアによって生成された2つのスプレッドシートがあります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
マウスの3つのバッチは、上記のプロトコルを介して実行されました。 16偽および照射20（2400 cGyで、3×800センチグレイ/日）マウスの合計がありました。照射の3日連続の後、照射群が有意に偽に比べVWRAの低下を示した（混合反復測定ANOVA：照射処理、F 1,13 = 19.233、p <0.001の主な効果）。効果は最低の平均VWRA距離は放射線（ 図2A）の後、三日目に発生すると、照射（単純主効果はp <ボンフェローニ補正付き0.05）後の最初の7日間、有意でした。日25と26で、何もデータが原因で他の行動試験に収集されませんでした。
図2Bは、照射後に前からVWRAの変化の分布を示しています。試験されたマウスの大部分が疲労のような症状を示したが（縮小In個の車輪走行活性）、ほとんど変化またはVWRA（ 図2B、下のプロット）でさえも増加を示したマウスの少数がありました。この変動に起因して、小さなサンプルサイズを用いた実験は、疲労のような振る舞いをキャプチャしない場合があります。
図1： 鉛遮蔽装置。社内で開発された遮蔽は、2つの同一の箱のように組み立てられています。マウスは、鉛の箱との間の隙間に露出しただけで自分の骨盤領域に配置されています。 （A）そのコンテナ内の遮蔽の写真。リードボックスは、照射のために設計された10.5インチ径のプレキシガラス容器に囲まれる位置にそれらを保持するために、発泡スチロールに囲まれています。 （B）、鉛シールドの概略。鉛遮蔽がリードARの1インチの厚さのブロックで構成されています2つのボックスとしての範囲でした。各ボックスは4個で構成されています×3 "×1" "側片は〜0.5であるが、「トップとボトムピースは4.25"×3 "×1です。組み立てられたとき、各ボックスの外形寸法は4.25 "×3"×3がある」、と1があり、「それらの間のギャップが。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：毎日の自主ホイールランニングの距離。毎日マウスによって実行（A）の平均総距離（N = 16コントロール、20照射）。マウスを日25と26で14日間、15、および16に照射し、データが原因で他の行動試験に収集されませんでした。エラーバーは平均の標準誤差を示します。 * P <0.05。 （B）VWRAの変化のヒストグラム、トンの平均として定義直ちに照射前HREE日（日11から13）マイナス直ちに照射後3日間の平均（日17から19）。正の数はVWRAの減少を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我々は、罹患率または死亡率を混乱することなく、マウスにおけるVWRAの減少を誘導するためにターゲット周辺照射を使用してプロトコルを記載しています。重要なことは、単純な遮蔽装置は、骨盤がん患者によって受信された放射線治療を模倣し、一貫して所望の領域を標的とするために、このプロトコルで照射することができます。脳または全身照射8,9を含む既存のCRFモデルとは対照的に、このモデルは、末梢標的照射手順は、中央に駆動疲労挙動に影響を与えることができる方法を探ります。当社の代表的な結果では、このように配信周辺照射は約1週間後に完全な回復と疲労のような動作を生成するのに十分であることを示しています。
疲労の対策として、VWRAは最小限のトレーニングと実験時間を必要とする、1日24時間、距離と速度のシンプルかつ客観的な評価を可能にします。それはやりますエスは、施設空間の可能制限要因となって、個々のケージの住宅マウスが必要です。個々の住宅は、おそらく不安12または多動13に導く、マウスの挙動に影響を与えることができるが、車輪走行これらの負の効果14を減少させることができるという証拠があります。車輪走行挙動はまた、身体活動15の他の評価よりも少ないイントラマウス可変と高い再現性を有することが示されています。しかし、自発的な活動が動機または厳密に物理的疲労16以外の要因に依存することができるので、物理的疲労をより選択的に、自発的な活動以外の方法で捕捉することができる可能性があります。さらなる実験は、そのような決意をするために必要であろう。
しかし、成功のために重要であるプロトコル内のいくつかのポイントがあります。マウスがリ・に時間が許可されていることが重要です述べたように新しい施設に到着し、その取り扱い時のrは、この期間中に行うこと。これらの手順は、自主的な活動17に影響を与える可能性がストレスや不安を、減らします。照射プロセスの間に完全な麻酔を維持することは、閉空間（リードシールド）内に拘束されているので、動物18のための重要なストレッサーすることができますが、また照射に他の器官/組織の不必要な露出を避けるためだけではなく、また重要です。麻酔薬の投与量は、このプロトコルの照射部分を開始する前に、マウスの年齢および歪みのために適切であることを保証することが重要です。また、5日以上のための車輪を実行するマウスの順化を照射し、分析に適したデータの前に安定した動作を得るために重要です。
珍しいVWRA番号をトラブルシューティングするには、VWRAケージは、定期的に潜在的な問題を監視する必要があります。 exampのためにル、寝具材料はホイールの下に、または直接積み上げ、または実行中の車輪が十分にきれいでない場合、これはホイールスピンに抵抗を追加し、活動レベルの測定を減らすことができなった場合。ほとんどのホイールランニングが暗い時間7時に発生するのでさらに、VWRAは光周期の変動に対して敏感である可能性がある、とケアは定期的かつ途切れない光サイクルを維持するために注意すべきです。
このプロトコルは、照射の異なるレベルの使用を収容することができます。たとえば、私たちは、このプロトコルで800センチグレイで投薬の3日間を説明するが、我々は600 cGyでの投与量7の3日間を使用して、疲労のわずかに低いレベルを見てきました。特定の照射線量の影響は、マウス19のひずみに依存し、照射20の投薬速度、複数の日21以上の分画、および領域のexpの可能性が高いサイズシールドの下osed。千cGyで全身照射の単回投与は死亡率の増加22なしC57 / BL6マウスに使用されてきたが、予防策は、高線量の放射線は、罹患率の兆候を生じないように注意しなければなりません。
放射線量に加えて、いくつかの他のステップは、手で実験に合わせて変更することができます。シールド内の鉛遮蔽または動物の配置を変更することにより、これらの方法は、照射して、他の身体部位を標的とするように適合させることができます。しかし、遮蔽装置への変更は、照射が遮蔽領域に浸透していないことを確実にするために線量測定で検証する必要があります。このプロトコルはまた、自発的ランニング活動をより物理的または精神的に要求されている行動実験を妨げないように、行動測定の多種多様を組み込むように適合させることができます。例えば、CRFは、多くの場合、認知障害3に沿って発生します。未来実験は、放射線療法は、この関連でプレイしてもよい役割を探ることができます。追加の行動試験を行う際にVWRAは、多くの点16で生理機能や行動に影響を与えることができるように車輪走行活性の存在は、考慮に入れなければなりません。
800センチグレイ以下の照射線量では、マウスは麻酔から回復した後、特別なケアを必要はありません。しかし、照射手順と、得られた疲労は、潜在的に、そのような付加的な行動試験または医薬治療のような他の介入と相互作用することができます。変更またはこの説明する手順に追加するたびに、動物は、照射直後の日に綿密に監視する必要があります。 C57BL / 6以外の菌株を使用したときのマウスの異なる系統も、照射19に対して異なる感受性を示すことができるので、注意が保証されています。
この技術は、放射線インを表すように設計されているが疲労を生さ、それは複雑なCRFの概念の一成分のみです。 CRFは、おそらく多くの原因があり、がんを持っており、多くの場合、複数の治療を受ける患者に起こる症状です。 CRFの理解は、したがって、腫瘍を有するマウスで、そのような化学療法やホルモン療法など他の治療との実験のセットが必要な場合があります。生物学的および行動テストにこれらの変数を組み込むことは、この複雑な状況への貢献を識別するために研究者を可能にします。ここで説明するマウスモデルは、CRFにおける放射線の特定の役割を理解し、潜在的な治療薬を開発することがあります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
この研究は、学内研究部門、看護研究の国立研究所、国立衛生研究所によってサポートされていました。
Acknowledgments
著者らは、寛大にマウス表現型解析方法で彼女の専門知識を共有するため、彼女の継続的な技術支援のため、ならびにための国立心臓、肺、および国立衛生研究所の血液研究所（NHLBI）（NIH）のミケーレ・アレンに感謝したいと思います私たちは、遮蔽装置を開発助けるためNHLBIのティモシー・ハント。この研究は、NIHの看護研究の国立研究所の学内研究部門によってサポートされており、検証試験の一部は社会財団看護オンコロジーからの助成金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mice | Charles River | Strain code 027 (http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-a-model/c57bl-6n-mouse) | |
| Ketamine HCl | Putney | 100 mg/mL stock solution | |
| Xylazine HCl | Lloyd Laboratories | 100 mg/mL stock solution | |
| Rodent Tattoo System | AIMS | ATS-3 | http://animalid.com/lab-animal-identification-systems/ats-3-general-rodent-tattoo-system |
| Lead Shielding Apparatus | (custom made) | One-inch thick lead shielding arranged as two boxes with a one-inch thick gap between them for targeted irradiation | |
| Plexiglass shielding container | (custom made) | Plexiglass container filled with styrofoam. Styrofoam cutouts hold the lead shielding in place. | |
| GammaCell 40 Exactor | Best Theratronics | http://www.theratronics.ca/product_gamma40.html | |
| RAD Disk Ultra | Best Theratronics | http://www.theratronics.ca/product_rad.html | |
| Mouse Single Activity Wheel Chamber | Lafayette Instrument Company | #80820 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=980 |
| Activity Wheel Counter for Computer Monitoring | Lafayette Instrument Company | #86061 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1052 |
| Modular Cable for Wheel Counters | Lafayette Instrument Company | #86051-7 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1046 |
| USB Computer Interface for Activity Wheel Counters | Lafayette Instrument Company | #86056A | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1047 |
| Activity Wheel Monitor Software | Lafayette Instrument Company | #86065 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1053 |
References
- Minton, O., et al. Cancer-related fatigue and its impact on functioning. Cancer. 119, Suppl 11. 2124-2130 (2013).
- Bower, J. E. Cancer-related fatigue--mechanisms, risk factors, and treatments. Nat Rev Clin Oncol. 11 (10), 597-609 (2014).
- Saligan, L. N., et al. The biology of cancer-related fatigue: a review of the literature. Support Care Cancer. 23 (8), 2461-2478 (2015).
- Norden, D. M., et al. Tumor growth increases neuroinflammation, fatigue and depressive-like behavior prior to alterations in muscle function. Brain Behav Immun. 43, 76-85 (2015).
- Ray, M. A., Trammell, R. A., Verhulst, S., Ran, S., Toth, L. A. Development of a mouse model for assessing fatigue during chemotherapy. Comp Med. 61 (2), 119-130 (2011).
- Zombeck, J. A., Fey, E. G., Lyng, G. D., Sonis, S. T. A clinically translatable mouse model for chemotherapy-related fatigue. Comp Med. 63 (6), 491-497 (2013).
- Renner, M., et al. A murine model of peripheral irradiation-induced fatigue. Behav Brain Res. 307, 218-226 (2016).
- Van der Meeren, A., Lebaron-Jacobs, L. Behavioural consequences of an 8 Gy total body irradiation in mice: Regulation by interleukin-4. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 79 (2), 140-143 (2001).
- York, J. M., et al. The biobehavioral and neuroimmune impact of low-dose ionizing radiation. Brain Behav Immun. 26 (2), 218-227 (2012).
- Meijer, J. H., Robbers, Y.
- The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th Edition, National Research Council of the National Academies. (2011).
- Heredia, L., Torrente, M., Domingo, J. L., Colomina, M. T. Individual housing and handling procedures modify anxiety levels of Tg2576 mice assessed in the zero maze test. Physiol Behav. 107 (2), 187-191 (2012).
- Varty, G. B., Paulus, M. P., Braff, D. L., Geyer, M. A. Environmental enrichment and isolation rearing in the rat: effects on locomotor behavior and startle response plasticity. Biol Psychiatry. 47 (10), 864-873 (2000).
- Pham, T. M., Brene, S., Baumans, V. Behavioral assessment of intermittent wheel running and individual housing in mice in the laboratory. J Appl Anim Welf Sci. 8 (3), 157-173 (2005).
- Knab, A. M., et al.
- Novak, C. M., Burghardt, P. R., Levine, J. A. The use of a running wheel to measure activity in rodents: relationship to energy balance, general activity, and reward. Neurosci Biobehav Rev. 36 (3), 1001-1014 (2012).
- Mineur, Y. S., Belzung, C., Crusio, W. E. Effects of unpredictable chronic mild stress on anxiety and depression-like behavior in mice. Behav Brain Res. 175 (1), 43-50 (2006).
- Perhach, J. L. Jr, Barry, H. 3rd Stress responses of rats to acute body or neck restraint. Physiol Behav. 5 (4), 443-448 (1970).
- Iwakawa, M., et al. Different radiation susceptibility among five strains of mice detected by a skin reaction. J Radiat Res. 44 (1), 7-13 (2003).
- Travis, E. L., Peters, L. J., McNeill, J., Thames, H. D. Jr, Karolis, C. Effect of dose-rate on total body irradiation: lethality and pathologic findings. Radiother Oncol. 4 (4), 341-351 (1985).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
- Duran-Struuck, R., et al. Differential susceptibility of C57BL/6NCr and B6.Cg-Ptprca mice to commensal bacteria after whole body irradiation in translational bone marrow transplant studies. J Transl Med. 6, 10 (2008).
