Summary
يوفر العيش التصوير متحد البؤر علماء الأحياء مع أداة قوية لدراسة التنمية. هنا، نقدم بروتوكول مفصل عن التصوير متحد البؤر المباشر لتطوير الزهور نبات الأرابيدوبسيس.
Abstract
وقد اعتمدت الدراسة نمو النبات والتنمية طويلة على تقنيات تجريبية باستخدام الميتة والأنسجة الثابتة وتفتقر إلى قرار الخلوي السليم. التطورات الحديثة في الفحص المجهري متحد البؤر، جنبا إلى جنب مع تطوير العديد من fluorophores، والتغلب على هذه القضايا وفتح إمكانية لدراسة التعبير عن جينات عدة في وقت واحد، مع قرار الخلوي جيد، في عينات حية. يوفر العيش التصوير متحد البؤر علماء الأحياء النباتية مع أداة قوية لدراسة التنمية، واستخدمت على نطاق واسع لدراسة نمو الجذور وتشكيل أجهزة الجانبية على الجناحين تبادل لاطلاق النار النسيج الإنشائي القمي. ومع ذلك، لم يتم تطبيقها على نطاق واسع لدراسة تطوير زهرة، ويرجع ذلك جزئيا إلى التحديات التي تخص التصوير الزهور، مثل كأسية التي تنمو على النسيج الإنشائي زهرة، وتصفية مضان من الأنسجة الكامنة. هنا، نقدم بروتوكول مفصل لأداء الحي التصوير متحد البؤر على الهواء مباشرة، وتطوير العربيةidopsis براعم الزهور، وذلك باستخدام إما تستقيم أو مجهر مقلوب.
Introduction
معظم جسم النبات يشكل بعد embryonically من مجموعات من الخلايا الجذعية تقع في أو بالقرب من الحافة - أو الخلايا الإنشائية قمية - من يطلق النار والجذور. جميع الهياكل فوق الأرض من النبات الكبار مستمدة من تبادل لاطلاق النار النسيج الإنشائي القمي (SAM)، التي تنتج بشكل مستمر أجهزة الجانبية على جنباته: يغادر خلال المرحلة الخضرية، والخلايا الإنشائية زهرة (وزراء الخارجية) بعد أن التحولات إلى المرحلة الإنجابية. وزراء خارجية بدورها تتطور إلى الزهور. في حين أن نبات الأرابيدوبسيس SAM تنتج أجهزة الجانبية واحد في كل مرة، في، ونمط دوامة متكررة، وزراء خارجية تنتج أربعة أنواع من الأعضاء الزهرية في غضون أربعة جدلات، بطريقة متزامنة جزئيا، مع البرامج التنموية متعددة يتفكك في وقت واحد. تم الشبكات الوراثية الكامنة وراء تحديد هوية الأعضاء الزهرية مختلفة فك شفرتها جزئيا (للاستعراض، انظر المراجع 1 و 2)، ولكن العديد من جوانب الإنمائية لل زهرةالإقليم الشمالي، مثل تحديد المواقع الجهاز الأزهار وتعريف الحدود بين جدلات، لا تزال غير مفهومة.
الدراسات الجينية الجزيئية الأولى من تطوير محطة تعتمد في الغالب على تقنيات مثل التهجين في الموقع وصحفيين المكتب المركزي للاحصاءات لتحليل التعبير الجيني. في حين أن هذه الطرق قد وفرت ثروة من المعلومات وساهمت في فهمنا لنمو النبات والتنمية زهرة إلى حد كبير، وهناك قيود هامة: أنها تفتقر إلى قرار الخلوي جيد، لا تسمح لمراقبة سهلة من نمط التعبير عن جينات متعددة في نفس العينات، والأهم من ذلك، يمكن أن ينطبق إلا على الميت الأنسجة الثابتة. والتغلب على التطورات الحديثة في الفحص المجهري متحد البؤر هذه القيود، وتوفير علماء البيولوجيا التطورية مع أداة قوية للتحقيق في العمليات الأساسية التشكل النبات. على وجه الخصوص، متحد البؤر المجهري يسمح لمراقبة الأنسجة والأعضاء الحية في جميع أنحاء تشكيلها، وهو جritical إلى فهم كامل عملية ديناميكية جوهري مثل التنمية.
وقد استخدم التصوير متحد البؤر الحية على نطاق واسع لتحليل نمو الجوي من النباتات وإنتاج أجهزة الجانبية من قبل SAM (على سبيل المثال يحيل الى 3، 4، 5، 6)، ولكن باستثناء عدد قليل من التقارير (مثل الإشارات 7، 8، 9، 10)، لم يتم تطبيقها على نطاق واسع لدراسة تطوير زهرة. هي بروتوكولات التصوير متحد البؤر المباشر لSAM المتاحة (مثل يحيل الى 11، 12)، وتوفر قاعدة جيدة لكيفية صورة براعم الزهور النامية التي تحيط SAM. ومع ذلك، براعم الزهور التصوير تقدم تحديات محددة: على سبيل المثال،براعم الزهور تصبح بسرعة أكبر من SAM، وفي المرحلة 4، كأسية تبدأ تغطي FM (مراحل كما هو موضح في اشارة 13)، ويعتم مضان من وراء الأنسجة (الشكل 2A). هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة تشرح كيفية تنفيذ الحية التصوير متحد البؤر على تطوير نبات الأرابيدوبسيس براعم الزهور باستخدام إما تستقيم أو مجهر مقلوب وعدسة المياه غمس. نشرنا سابقا هذا البروتوكول في اشارة 14.
Protocol
1. وسائل الإعلام وأطباق إعداد
- إعداد تشريح الأطباق عن طريق ملء صناديق بلاستيكية مستديرة (حوالي 6 سم، 2 سم العميق) إلى 0.5 سم مع 2٪ الاغاروز.
- إعداد التصوير الأطباق.
- لمجهر متحد البؤر تستقيم، وملء البلاستيك مستطيلة يتوقف صناديق (حوالي 7 سم، 4.5 سم، 3 سم العميق) إلى 0.5 سم مع متوسط التصوير (انظر القسم 1.3، "المتوسطة التصوير"، الشكل 1F).
- لمجهر متحد البؤر مقلوب: ملء طبق بيتري صغيرة (حوالي 3.5 سم، 1 سم العميق) بالضبط حتى أسنانها مع متوسط التصوير (انظر القسم 1.3، "المتوسطة التصوير"، الشكل 1G).
- إعداد المتوسطة التصوير.
- للتصوير نقطة واحدة، واستخدام 1٪ الاغاروز.
- للتجارب مرور الزمن، واستخدام متوسط النمو قمة (0.5X Murashige وسكوغ القاعدية ملح خليط من دون فيتامين، 1٪ سكروز، 0.8٪ الاغاروز، ودرجة الحموضة 5.8 مع هيدروكسيد البوتاسيومحل ه، على أن تستكمل مع فيتامين [0.01٪ ميو-اينوزيتول، حمض النيكوتينيك 0.0001٪، 0.0001٪ البيريدوكسين هيدروكلوريد، 0.001٪ هيدروكلوريد الثيامين، 0.0002٪ الجلايسين] وسيتوكينين [500 نانومتر N6-البنزل ادنين]) 15.
2. نمو النبات
- زرع بذور معقمة على لوحات MS (0.5 أو 1X Murashige وسكوغ القاعدية مزيج من الملح وبدون فيتامين، 0.8٪ أجار، ودرجة الحموضة 5.8 مع محلول هيدروكسيد البوتاسيوم) مع الاختيار المناسب. لوحات مكان في يوم طويل (16 ساعة ضوء) أو يوم المستمر، 16-22 ° C الظروف لمدة أسبوعين.
- شتلات زرع على التربة مع تباعد كافية للسماح للتنمية قوية. النباتات مكان في يوم وقصيرة، 16-22 ° C الظروف لمدة ثلاثة أسابيع.
ملاحظة: زراعة النباتات في يوم طويل أو ظروف اليوم مستمرة مباشرة بعد زرع النتائج في الإزهار المبكر والنورات التي هي أقل نشاطا، وأصعب من ذلك بكثير لتشريح. وبالمثل، وترك النباتات تحت كونديت يوم قصيرةأيونات لأكثر من ثلاثة أسابيع النتائج في يوم مستقل طول المزهرة والنورات التي هي أقل نشاطا. - محطات نقل إلى يوم طويل (16 ساعة ضوء) أو يوم المستمر، 16-22 ° C الظروف حتى الزهور. قمم تبادل لاطلاق النار هي أسهل لتشريح عند الإزهار هو 2-10 سم طويلة.
3. تشريح تبادل لاطلاق النار أبيكس
- اختياري: استخدام حجر شحذ بخير وقطرة من النفط الخفيف، وشحذ ملقط تحت مجهر تشريحي لجعلها مثل شفرة، لا تشير مثل.
- إزالة siliques، أقدم براعم الزهور والنورات الثانوية من الإزهار الأساسي عن طريق دفع قاعدة السويقتين مع ملقط حتى كسر. إزالة العديد من الزهور ممكن من دون التكبير (الشكل 1، مقارنة ألف وباء).
- باستخدام ملقط، بيرس ثقب العمودي في الاغاروز طبق تشريح، وقطع 0.5 سم الأخيرة من الإزهار والتمسك بها عموديا في الاغاروز. المتبقييجب أن تكون براعم الزهور فوق سطح الاغاروز.
- ملء الطبق التصوير مع والمياه دي المتأينة العقيمة بحيث يتم مغمورة قمة تبادل لاطلاق النار بشكل كامل. وضع طبق تشريح تحت مجهر تشريحي، وإزالة الهواء المحبوس حول قمة تبادل لاطلاق النار خلال إنشاء النوافير المائية مع ماصة 1000 ميكرولتر (الشكل 1، مقارنة C و D).
- تحت مجهر تشريحي، استخدام الملقط لإزالة براعم الزهور التي لا يمكن تصوير بالضغط على قاعدة السويقة أو الجزء العلوي من المهد حتى فواصل السويقة (الشكل 1E). ومن المهم أن السويقتين كسر نظيفة في تقاطع مع الجذعية، كما السويقتين بقايا تعيق إزالة براعم الزهور الصغيرة.
- إذا التصوير فقط براعم الزهور المرحلة 5 والأصغر (الشكل 2A)، وإزالة الماء قبل تشريح مرحلة 6-8 براعم الزهور. إذا براعم الزهور التصوير مرحلة 5 و كبار السن، انتقل إلى الاجتثاث SEPAL (انظر القسم 5.1). خلاف ذلك، والمؤيدCEED إلى الخطوة 3.7.
- باستخدام ملقط، اختراق حفرة الرأسي في المتوسط من طبق التصوير، وعصا تشريح قمة تستقيم على المدى المتوسط، بحيث لا تبادل لاطلاق النار النسيج الإنشائي القمي والمحيطة براعم الزهور هي فوق سطح المتوسط. اعتمادا على برعم زهرة (ق) هي التي يتم تصويرها، قد يكون من الضروري لإمالة قليلا العينة، وبراعم الزهور ليست بالضرورة موجهة تماما مثل الجذعية (الشكل 2A).
- انتقل إلى تلطيخ العينة إذا لزم الأمر. إن لم يكن تلطيخ و / أو تصوير عينة على الفور، إضافة الماء وإغلاق طبق التصوير لمنع الجفاف. إذا باستخدام مجهر مقلوب، ضع صحن التصوير في علبة بلاستيكية شفافة وإغلاقه.
الشكل 1: إعداد قمم تبادل لاطلاق النار للتصوير مبائر حية. (A - E) تشريح لتبادل لاطلاق النار قمة للتصوير. الإزهار قبل (A) وبعد (B) إزالة siliques والزهور القديمة. (C - D) تبادل لاطلاق النار قمة مغمورة في الماء في طبق تشريح، مع فقاعة الهواء المحبوس في الطرف (C) وبعد إزالة فقاعة الهواء (D). (E) تبادل لاطلاق النار قمة في طبق تشريح، بعد تشريح براعم الزهور أقدم من مرحلة 5. (F - G) عرض من قمم تبادل لاطلاق النار في صحن التصوير، وعلى مرحلة مجهر متحد البؤر تستقيم (F) ومقلوب (G) . في (F)، يتم وضع عدسة المياه غمس 40X فوق واحدة من قمم، مع غيض من عدسة مغمورة في الماء. في (G)، يتم وضع رأس تبادل لاطلاق النار رأسا على عقب فوق عدسة المياه غمس 40X، مع عمود الماء الذي يربط بين المتوسطة التصوير لغيض من العدسة. تظهر لوحة صغيرة في (F) على المهزومةلها رأي التكبير من المنطقة في المستطيل الأحمر، مع قمة تبادل لاطلاق النار إدراجها في المتوسط التصوير. خطوط حمراء وزرقاء تدل على سطح المتوسط والمياه، على التوالي. (H - I) أمثلة من الأجهزة حسب الطلب التي تتيح إضافة المزيد من الماء على طرف عدسة المياه غمس: كم المطاط والسيليكون مصنوعة من التمهيد شرارة قابس (H)، وكم مؤقت مصنوع من إصبع ل القفازات المطاطية powderless (G). الحانات النطاق = 0.5 سم في (A) و (B)، 0.1 سم في (C) و (D)، و 100 ميكرومتر في (E). وكان هذا الرقم نشرت في البداية في اشارة 14. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4. تلطيخ
ملاحظة: جدران الخلية أو أغشية البلازما يمكن ملطخة يوديد propidium أو FM4-64، على التوالي، لتحقيق قرار الخلويأثناء التصوير. بدلا من ذلك، خطوط مراسل مع البروتينات الفلورية ذات الكلمات الدلالية لغشاء البلازما يمكن استخدام 6، 16.
- إزالة المياه من الطبق التصوير، وضمان سطح المتوسط الجاف لتجنب تمييع الصبغة.
- تحت مجهر تشريحي، وتطبيق 20-30 ميكرولتر من إما 1 ملغ / مل من محلول يوديد propidium، أو 80 ميكروغرام / مل FM4-64 حل للقمة تشريح مع ماصة 10 ميكرولتر. تأكد من تغطية العينة كلها في صبغ لضمان تلطيخ متجانس.
- وصمة عار لمدة 2 دقيقة في حالة استخدام يوديد propidium، أو 20 دقيقة في حالة استخدام FM4-64.
- شطف مرتين مع العقيمة الماء منزوع الأيونات.
5. سيبال تذرية
ملاحظة: في المرحلة 4، براعم SEPAL تبدأ تغطي FM. عندما يكبرون، وتصفية مضان من الأنسجة الكامنة، وتعيق عملية التصوير. إما أن كأسية إزالتها يدويا باستخدام mounte مسمار معدنيد على دبوس ملزمة، أو منعه في النمو باستخدام الليزر التذرية على براعم SEPAL الناشئة. بدلا من ذلك، فمن الممكن في بعض الحالات إلى استخدام المسوخ مثل apetala1-1، التي كأسية مفقودة أو الاستعاضة عن أجهزة تشبه ورقة التي لا تغطي FM في حين أن الجزء المركزي من زهرة يتطور عادة (الشكل 2F) 17.
- الاجتثاث SEPAL على براعم الزهور المرحلة 5 وكبار السن باستخدام دبوس ملزمة عقد إبرة معدنية على التوالي (الشكل 2، E1-E2)
- وضع طبق تشريح مع قمة تشريح تحت مجهر تشريحي، وتعيين التكبير إلى الحد الأقصى. تزج قمة تبادل لاطلاق النار في العقيمة الماء منزوع الأيونات، أو بدلا من ذلك، استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لتطبيق الماء إلى قمة تبادل لاطلاق النار بانتظام أثناء تشريح كأسية.
- مع دبوس بالعكس، وضع على رأس دبوس من سيبال مجافي المحور، هامشية بالنسبة إلى قمة تبادل لاطلاق النار. دفع برفق سيبال بعيدا عن قمة تبادل لاطلاق النار حتى يكسر بعيدامن برعم زهرة.
- المضي قدما نحو مماثل مع سيبال متجه نحو المحور، ولكن دفع سيبال نحو قمة تبادل لاطلاق النار.
- المضي قدما نحو مماثل مع كأسية الجانبية، ولكن وضع دبوس شعاعيا النسبي لقمة تبادل لاطلاق النار، ودفع كأسية إلى جنب، بعيدا عن برعم زهرة.
- تزج قمة تبادل لاطلاق النار في العقيمة، منزوع الأيونات الماء لبضع دقائق لمنع الجفاف.
- ليزر الاجتثاث من براعم SEPAL في مرحلة 3-4 (الشكل 2، C5-D5)
- وضع طبق التصوير مع الملون، قمة تشريح على المسرح المجهر مبائر. تحديد والتركيز على قمة كما لو كان يستعد لصورة منه (انظر القسم 6، "الإعداد والتصوير").
- باستخدام الليزر برنامج نظام الاجتثاث، وتحديد منطقة الاجتثاث، والتي تتطابق مع قمة وغيض من براعم SEPAL الناشئة قبل أن تبدأ تغطي النسيج الإنشائي زهرة (عادة في مرحلة 3 لكأسية مجافي المحور ومتجه نحو المحور، وفي مرحلة متأخرة 3 / مبكرة المرحلة 4 لالوحشي حد ذاتهاالزملاء).
- تعيين قوة الليزر ومسكن الوقت لالمعلمات المناسبة لاجتثاث ما يكفي من الخلايا دون إلحاق الكثير من الضرر لأنسجة الكامنة. عادة، اعتمادا على نظام الاجتثاث الليزر المستخدمة، المعلمات المناسبة تحتاج في البداية إلى أن تحدد من خلال عملية التجربة والخطأ لضمان ما يكفي من الخلايا يتم إزالتها لمنع كأسية أن تنمو في وقت لاحق خلال FM، دون التأثير على بقية زهرة برعم. استخدام الكثير من قوة الليزر ومسكن نتائج الوقت في الأضرار التي لحقت مركز الزهرة، مما يؤثر على نموه و / أو البقاء على قيد الحياة. مرة واحدة وقد تم تحديد معايير مناسبة، ويمكن إعادة استخدامها لتجارب لاحقة.
ملاحظة: إذا كان الاجتثاث الأولي يثبت عدم كفاية، فمن الممكن المضي قدما إلى الاجتثاث الثاني في الأيام التالية (الشكل 2، C4 و D2).
6. إعداد التصوير
- استخدام المجهر تستقيم.
ملاحظة: عند التصوير مع المجهر تستقيم، عدة قمم يمكن وضعها في طبق نفس التصوير. ومع ذلك، إذا عملية التصوير تستغرق أكثر من ساعة، يوديد propidium يميل إلى أن يكون الواحد، وبعض العينات قد تحتاج إعادة تلطيخ قبل التصوير. - ضع صحن التصوير على المسرح المجهر (الشكل 1F). خفض عدسة المياه غمس ورفع مرحلة بحيث ينخفض غيض من عدسة في الماء. المضي قدما بحذر حتى لا سحق قمم تشريح أو تراجع عدسة في المتوسط التصوير.
- إذا تم المحاصرين فقاعة الهواء في غيض من عدسة، وجعل الماء المتدفق مع ماصة 1000 ميكرولتر لحذفها.
- تحت إضاءة epifluorescence، وظيفة واحدة من قمم تشريح في مجال العدسة باستخدام يخدع XYترولر. ننظر من خلال العدسات والتركيز على العينة باستخدام وحدة تحكم Z. المضي قدما بحذر حتى لا سحق العينة.
- باستخدام برنامج المجهر متحد البؤر، والتكبير على برعم زهرة للتصوير، والشروع في تصوير عينتك.
- باستخدام ماصة ميكرولتر 1000، وضعت قطرة من عقيم، منزوع الأيونات الماء على طرف العدسة.
- عقد الطبق التصوير رأسا على عقب، ومع ماصة 1000 ميكرولتر، إضافة قطرة من عقيم، منزوع الأيونات الماء إلى قمة تشريح.
- وضع طبق التصوير رأسا على عقب على المسرح المجهر (الشكل 1G). المضي قدما بحذر حتى لا سحق العينة.
- تحت إضاءة epifluorescence، ضع قمة تشريح أكثر من غيض من العدسة باستخدام وحدة تحكم XY. مع وحدة تحكم Z، وانخفاض بعناية المرحلة حتى تصل عينة قطرة من الماء على طرف العدسة. عمود الماء ينبغي أن تشكل betwالتابعين غيض من العدسة والمتوسطة.
- إذا لا يشكل عمود الماء، إضافة بعناية قطرة ماء إلى العينة مع ماصة 1000 ميكرولتر. إضافة الأكمام مؤقتة للعدسة من أجل إضافة المزيد من الماء عند طرفها، مما يسهل إنشاء وصيانة عمود الماء (الشكل 1H و1I).
- تحت إضاءة epifluorescence، ننظر من خلال العدسات والتركيز على العينة باستخدام وحدة تحكم Z. المضي قدما بحذر حتى لا سحق العينة.
- باستخدام برنامج المجهر متحد البؤر، والتكبير على برعم زهرة للتصوير، والشروع في التصوير العينة.
ملاحظة: في حين أن الخلايا في develoيمكن بينغ الأعضاء الزهرية تقسيم أسرع، والخلايا في الانقسام النسيج الإنشائي الأزهار مرة واحدة أو مرتين كل يوم الثاني على التوالي، والأنساب خلية من السهل تتبع مع نقاط الوقت كل 24 ساعة. ومع ذلك، إذا لزم الأمر، فمن الممكن لصورة عينات كل ست ساعات.
7. اعتبارات على معلمات التصوير
ملاحظة: كيفية إعداد المعلمات التصوير تعتمد كثيرا على نظام متحد البؤر المستخدمة. وفيما يلي اقتراحات لبعض من هذه المعلمات التي يمكن استخدامها مع أي المجهر متحد البؤر. لمزيد من الاعتبارات على المعلمات التصوير، راجع قسم مناقشة ومرجع 14.
- من أجل حل XY: استخدام 1024 س 1024 لاستصدار قرار الخلوي جيد. بدلا من ذلك، استخدم 512 × 512 إلى تقليل وقت التصوير، وعلى حساب من هذا القرار.
- من أجل حل Z: تعيين حجم الخطوة إلى 0.5-1.5 ميكرون. خفض حجم الخطوة يزيد من قرار Z ولكن أيضا وقت التصوير.
8. تصور البيانات متحد البؤر
- تحويل الصور الثابتة من نقطة زمنية التنمية زهرة إلى فيلم.
- فتح الصور الثابتة (في الحياة السياسية في فرنسا أو صيغة TIF) في برنامج (على سبيل المثال، فيجي).
- إذهب إلى صورة> الأكوام> الصور إلى كومة. سيتم تجميع الصور المفتوحة في مكدس.
- إذا كان النظام من الصور في كومة لا تتوافق مع الترتيب الزمني، استخدام البرنامج المساعد المكدس فارز (الإضافات> الأكوام> المكدس فارز) لإعادة ترتيبها.
- لتحويل مكدس في الفيلم، وانتقل إلى ملف> حفظ باسم> AVI.
Representative Results
ويبين الشكل 2 وجهات نظر مختلفة من مبائر Z-أكوام من العيش براعم زهرة نبات الأرابيدوبسيس التعبير عن مختلف الجينات مراسل الفلورسنت، وملطخة إما يوديد propidium (الشكل 2، A-C5 وG) أو FM4-64 (الشكل 2، E1-F) ل تقديم مشروع قرار الخلوية واضح. معظم أنظمة مبائر تسمح للتصوير اثنين fluorophores مع عدم تداخل الأطياف الانبعاثات مثل GFP أو YFP مع أي من يوديد propidium أو FM4-64 (الشكل 2A - 2F). نظم أفضل متحد البؤر هي أيضا قادرة على فصل fluorophores متعددة مع أطياف الانبعاث متداخلة جزئيا في نفس العينات، مثل GFP وYFP، وعن dsRed ويوديد propidium (الشكل 2G).
وتعرض ثلاثة أمثلة من تجارب الوقت الفاصل في الشكل2 وتظهر براعم الزهور النامية عادة بعد إجراء الاستئصال SEPAL إما مع نظام الاستئصال بالليزر (الشكل 2، C1-C5 وD1-D5) أو يدويا مع دبوس ملزمة ومسمار معدني (الشكل 2، E1-E2). لاحظ أن برعم زهرة هو مبين في الشكل 2، E1-E2 هو من نبات متحولة سوبرمان-1، وهذا هو السبب لم يتم الالتزام براعم خباء في وسط برعم في مرحلة 7. ليزر الاجتثاث من براعم SEPAL الناشئة في برعم زهرة هو مبين في الشكل 2، C1-C5 يمنعهم من تغطية FM، التي لا يزال من الممكن تصويرها في المرحلة 5 (الشكل 2، C5). على العكس من ذلك، في حالة برعم زهرة هو مبين في الشكل 2، D1-D5، الاستئصال بالليزر تأخر النمو فقط سيبال، ولكن كأسية نما في نهاية المطاف لتغطية معظم FM من المرحلة 5 (الشكل 2، D5
الشكل 2: تصور مبائر Z-أكوام من براعم الزهور الحية. A و B2 وجهات نظر الشفافية؛ B1 و B4-G هي أقصى التوقعات كثافة. B3 هو وجهة نظر شريحة متعامد. (A - E2) الزهور تعبر عن مراسل فينوس لجين APETALA3 (الأخضر)؛ كانت ملطخة جدران الخلايا مع يوديد propidium (أحمر، باستثناء B4 والأخضر). (A) الإزهار. الأرقام تشير إلى مراحل الأزهار. كأسية في المرحلة 4 و 5 الزهور تصفية مضان لمراسل الزهرة، التي عادة FOالتربيعي حلقة. لاحظ أن بعض براعم الزهور تبدو مائلة مقارنة الإزهار. (B1 - B4) أربعة وجهات نظر مختلفة من نفس متحد البؤر Z-كومة من برعم مرحلة 5 زهرة: أقصى التوقعات كثافة (B1 و B4) مع فينوس كثافة إشارة مشفرة مع كثافة بكسل في اللون الأخضر (B1) أو مع رمز اللون النار (B4، يظهر رمز اللون في الجزء السفلي من لوحة)؛ عرض الشفافية (B2) وعرض شريحة متعامد (B3، يشار إلى التوجه XY، XZ وYZ من شرائح في لوحة). (C1 - C5) 4 أيام الوقت الفاصل بين برعم زهرة فردية من المرحلة 3 إلى المرحلة 5؛ أداء تذرية ليزرية (وضعت الصفات البيضاء) في يوم 1 و 3 أيام كانت كافية لمنع كأسية من تغطية وسط برعم زهرة في مرحلة 5. (D1 - D5) 4 أيام الوقت الفاصل بين برعم زهرة فردية من المسرح3 مرحلة 5؛ كانت تذرية ليزرية أجريت يوم 1 و 2 و 3 كافية لمنع كأسية من تغطية وسط برعم زهرة. (E1 - E2) الفردية برعم زهرة بعد الإزالة اليدوية للمجافي المحور وكأسية متجه نحو المحور (E1)، وجميع كأسية (E2)؛ وتشير السهام البيضاء كأسية المتبقية. وتشير العلامات النجمية البيضاء الندوب الناتجة عن إزالة كأسية. (F) المرحلة 7 زهرة apetala1-1 تعبر عن مراسل DR5-3xVenusN7 18 (الأخضر)؛ كانت ملطخة أغشية البلازما مع FM4-64 (الأحمر)؛ وتشير السهام الزرقاء هياكل تشبه أوراق التي تحل محل كأسية ولا تغطي برعم زهرة. (G) المرحلة 4 برعم زهرة تعبر عن مراسل GFP الفلورسنت لDORNROSCHEN مثل 7 (الأخضر)، وهو مراسل فينوس لسوبرمان (الحمراء)، ومراسل لعن dsRed CLAVATA3 19 (السماوي). خلاياكانت ملطخة الجدران مع يوديد propidium (الرمادي). د: اليوم؛ أولا: المرحلة. الحانات النطاق = 25 ميكرون. المقياس هو متطابقة في B1، B2 وB4، في C1-C5 وفي D1-D5. تم تعديل هذا الرقم من إشارة 14. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
هنا، ونحن نقدم بروتوكول لتصوير الحية، وتطوير براعم زهرة نبات الأرابيدوبسيس مع المجهر متحد البؤر وعدسة المياه غمس. في حين أن هذا يمكن أن يتم إما تستقيم أو مجهر مقلوب، هو أسهل وأسرع لاستخدام السابق. ومن الجدير بالذكر أيضا أن أنظمة متحد البؤر مختلفة تتفاوت تفاوتا كبيرا من حيث السرعة، والحساسية، والقدرة على فصل موجات. أفضل المجاهر متحد البؤر تسمح الآن إلى صورة عدة قنوات مختلفة (على سبيل المثال GFP، YFP، عن dsRed ويوديد propidium، الشكل 2G) في نفس العينات. وقد تم تجهيز بعض مجهر بؤري مع كشف الطيفي، والتي يمكن جمع مضان من عدة fluorophores في وقت واحد وفصلها بعد ذلك. عند استخدام جهاز كشف منتظم، إلا أن مجموعة من أجهزة الليزر والمرشحات يجب أن تستخدم لإثارة وفصل مضان من fluorophores مختلفة. بعض fluorophores لها أطياف الانبعاث واضح تماما (على سبيل المثال لCFPد YFP)، ويمكن تصوير في وقت واحد. fluorophores الأخرى لديها أطياف الانبعاث متداخلة جزئيا (على سبيل المثال GFP وYFP)، وعادة ما تحتاج للتصوير على حدة، مما يزيد من وقت التصوير. تصوير fluorophores وثيقة أيضا غالبا ما يتطلب تقييد كم من الطيف التي يتم جمعها لكل قناة لمنع مضان من fluorophore واحد من التسرب إلى قناة أخرى. هذا يؤدي إلى فقدان كثافة الإشارة التي تم جمعها، والتي يمكن أن تعوض زيادة في قوة الليزر واكتساب. ومع ذلك، لفترة طويلة وقت التصوير وزيادة قوة الليزر قد التبييض و / أو تلف العينة. زيادة قوة الليزر و / أو مكاسب قد يزيد أيضا من الضوضاء في الخلفية. يتم تعظيم الاستفادة من كثافة إشارة، قرار ووقت التصوير لكل عينة من خلال عملية التجربة والخطأ، وينطوي على المقايضات دائمة.
يشرح هذا البروتوكول كيفية إجراء التصوير متحد البؤر حية من براعم الزهور تطوير على الجناحين لقمة تبادل لاطلاق النار تشريح. هذاويمكن القول أن كون قمة تبادل لاطلاق النار غير متصل بقية النبات وينمو في المتوسط تحتوي على سيتوكينين قد تؤثر SAM والتنمية زهرة. ومع ذلك، تم تصميم هذه الوسيلة تجريبيا من خلال عملية التجربة والخطأ لضمان تبادل لاطلاق النار تشريح الخلايا الإنشائية قمية تنتج براعم الزهور الجديدة في فترة تتابع النمو الطبيعي، وأن هذه براعم الزهور تتطور عادة 15. وبالمثل، لا يظهر تشريح SEPAL أن تؤثر على أنماط التعبير الجيني أو تطوير ما تبقى من الزهور. البروتوكولات الأخرى بالتفصيل كيفية تنفيذ التصوير متحد البؤر المباشر لSAM لا تزال تعلق على بقية النباتات (مثل مرجع 11). ويمكن تكييف هذه البروتوكولات ل، وتقدم بديلا مفيدا للتصوير تطوير الزهور، وخاصة عند دراسة العمليات المتعلقة سيتوكينين. وهي تطرح عدة عيوب ولكن: ويستطيل الجذع والتقلبات، وتغيير اتجاه براعم الزهور. االثانية حين التصوير لقمة تبادل لاطلاق النار تعلق على بقية مصنع يعمل بشكل جيد مع المجهر تستقيم، هو أكثر تعقيدا بكثير للقيام بذلك مع مجهر مقلوب.
العدسات الغمر لها الفتحة العددية أفضل (NA) من العدسات "الجافة" (أي العدسات التي يتم فصلها من العينة عن طريق الجو)، وبالتالي توفر قرار أدق من العينة، وهو أمر حاسم عند استخدام المجهر متحد البؤر. باستخدام عدسة المياه غمس مما يوفر NA أفضل بكثير من عدسة الجافة، في حين منع قمة تبادل لاطلاق النار من التجفيف أثناء عملية التصوير. في حين الجليسرين والعدسات النفط لها NA حتى أعلى من العدسات الماء، وأنها تتطلب استخدام ساترة، وهو غير عملي جدا مع عينة حجم قمة تبادل لاطلاق النار، والتي تحافظ أيضا نموا خلال التجارب مرور الزمن. نظرا لحجم العينات (اعتمادا على مراحل الأزهار، ويمكن أن يكون أكوام أكثر من 150 ميكرون سميكة)، فمن المهم أيضا أن استخدام العدسات مع مسافة العمل الطويلة. ونحن عادة استخدام عدسة 20 أو 40X مع NA من 1 ومسافة العمل من 1،7-2،5 مم.
برنامج المجهر متحد البؤر يوفر عدة طرق لتصور البيانات متحد البؤر، بما في ذلك إعادة بناء ثلاثية الأبعاد (الشكل 2، B1، B2 و B4) والآراء شريحة (الشكل 2، B3). في حين أن وجهات النظر الأكثر شيوعا ثلاثية الأبعاد هي أقصى التوقعات كثافة مبائر Z-مداخن (الشكل 2، B1 و B4)، بعض البرامج (مثل ZEN وImaris) تقديم وجهات النظر الشفافية التي بتصفية إشارة من أعمق أجزاء من العينة (الشكل 2، B2)، والتي يمكن أن تكون مفيدة عند النظر في العمليات التي تجري، أو الجينات التي أعرب عنها في وطبقة البشرة. كثافة إشارة إما أن تكون مشفرة مع لون واحد (الشكل 2، B1)، وذلك باستخدام بكسل الأسواق العالمية ضغطهاnsity، أو باستخدام رمز اللون (الشكل 2، B4).
يعيش التصوير متحد البؤر يوفر ليس فقط الأفكار النوعية قيمة في التنمية زهرة، كما أنه يحتمل أن يوفر علماء البيولوجيا التطورية مع ثروة من البيانات الكمية. برامج مختلفة (على سبيل المثال Imaris، فيجي، MARS-ALT، MorphographX 15، 20، 21) يسمح لتقدير عدد أو حجم الخلايا معربا عن واحد أو عدة صحفيين، أو على مستوى التعبير مراسل في خلايا مختلفة. ويمكن أيضا أن مثل هذه البرامج يمكن استخدامها لتنفيذ تجزئة الخلية التلقائي، وتتبع الأنساب الخلايا وقياس النمو. هذا البرنامج يقدم أدوات مختلفة مماثلة، ولكنه يختلف أيضا في نواح كثيرة. تم تصميم MARS-ALT وMorphoGraphX خصيصا للمحطات 15، 20، 21، على عكس Imaris لالثانية فيجي. MorphoGraphX يسمح فقط للتجزئة وتحليل طبقة البشرة، في حين Imaris وMARS-ALT تسمح للتجزئة وتحليل العينة كلها. ومع ذلك، MARS-ALT يتطلب التصوير مسبق من نفس العينة من ثلاث زوايا مختلفة 15، وImaris يتطلب سوى كومة واحدة. الوصول إلى المعلومات الكمية أمر بالغ الأهمية لزيادة فهمنا للتنمية زهرة.
Disclosures
المؤلف ليس لديه ما يكشف.
Acknowledgments
يرغب المؤلف أن أشكر البروفيسور إليوت M مييرويتز لدعمه، والتعليقات على المخطوطة، وكذلك آن لافانواي في كلية دارتموث والدكتور أندريس كولازو في مرفق البيولوجية التصوير في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا للمساعدة في حل المسائل التقنية مع التصوير متحد البؤر الحية. ويدعم عمل ناثانيال برونيت من قبل المعاهد الوطنية الأميركية للصحة من خلال منح R01 GM104244 إلى إليوت M مييرويتز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
| Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
| Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
| Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
| Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
| Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
| P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
| Stereomicroscope | with an 80-90X maximum magnification | ||
| Laser ablation system | for sepal ablation | ||
| Laser scanning confocal microscope system | |||
| 20 or 40X water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
| Agarose | |||
| Sucrose | |||
| Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
| Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
| N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |
References
- Prunet, N., Jack, T. P. Flower Development in Arabidopsis: There Is More to It Than Learning Your ABCs. Methods Mol. Biol. 1110, 3-33 (2014).
- Stewart, D., Graciet, E., Wellmer, F. Molecular and regulatory mechanisms controlling floral organ development. FEBS J. , (2016).
- Heisler, M. G., et al. Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Curr. Biol. 15 (21), 1899-1911 (2005).
- Reddy, G. V., Meyerowitz, E. M. Stem-cell homeostasis and growth dynamics can be uncoupled in the Arabidopsis shoot apex. Science. 310 (5748), 663-667 (2005).
- Yadav, R. K., et al. WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex. Genes & Dev. 25 (19), 2025-2030 (2011).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131 (17), 4225-4237 (2004).
- Chandler, J. W., Jacobs, B., Cole, M., Comelli, P., Werr, W. DORNROSCHEN-LIKE expression marks Arabidopsis floral organ founder cells and precedes auxin response maxima. Plant Mol. Biol. 76 (1-2), 171-185 (2011).
- Urbanus, S. L., et al. In planta localisation patterns of MADS domain proteins during floral development in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 9, (2009).
- Hong, L., et al. Variable Cell Growth Yields Reproducible OrganDevelopment through Spatiotemporal Averaging. Dev. Cell. 38 (1), 15-32 (2016).
- Roeder, A. H., et al. Variability in the control of cell division underlies sepal epidermal patterning in Arabidopsis thaliana. PLoS Biol. 8 (5), e1000367 (2010).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods Mol. Biol. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-Time Lineage Analysis to Study Cell Division Orientation in the Arabidopsis Shoot Meristem. Methods Mol. Biol. 1370, 147-167 (2016).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Dev. Biol. , (2016).
- Fernandez, R., et al. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. , (2010).
- Cutler, S. R., Ehrhardt, D. W., Griffitts, J. S., Somerville, C. R. Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97 (7), 3718-3723 (2000).
- Irish, V. F., Sussex, I. M. Function of the apetala-1 gene during Arabidopsis floral development. Plant Cell. 2 (8), 741-753 (1990).
- Vernoux, T., et al. The auxin signalling network translates dynamic input into robust patterning at the shoot apex. Mol. Systems Biol. 7, 508 (2011).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Barbier de Reuille, P. B., Robinson, S., Smith, R. S. Quantifying cell shape and gene expression in the shoot apical meristem using MorphoGraphX. Methods Mol. Biol. 1080, 121-134 (2014).
