Summary
Le modèle de l' oreille de la souris sans poils SKH1-Hr permet la microscopie à fluorescence intravitale de la microcirculation et phototoxique induction de thrombus sans préparation chirurgicale préalable dans le lit microvasculaire examiné. Par conséquent, l'oreille de la souris sans poil est un excellent modèle in vivo pour étudier les interactions complexes pendant la formation de thrombus microvasculaire, l' évolution de thrombus et thrombolyse.
Abstract
complications thrombotiques des maladies vasculaires sont une des principales causes de morbidité et de mortalité dans les pays industrialisés. En raison des interactions complexes entre les composants sanguins cellulaires et non cellulaires pendant la formation de thrombus, des études fiables de la physiologie et physiopathologie de la thrombose ne peut être effectuée in vivo. Par conséquent, cet article présente un modèle de l' oreille chez les souris sans poil et se concentre sur l'analyse in vivo de la microcirculation, la formation de thrombus et de l' évolution de thrombus. En utilisant la microscopie à fluorescence intravitale et l'application par voie intraveineuse (iv) des colorants fluorescents respectifs, une analyse répétitive de la microcirculation dans l'oreillette peut facilement être réalisé sans la nécessité d'une préparation chirurgicale. En outre, ce modèle peut être adapté pour des études in vivo de différentes questions, y compris la cicatrisation des plaies, des lésions de reperfusion, ou angiogenèse. En résumé, l'oreille des souris sans poils est un modèle idéal pour la viv eno Etude de la microcirculation cutanée dans des conditions physiologiques ou physiopathologiques et pour l'évaluation de sa réaction à différents traitements systémiques ou topiques.
Introduction
Le but de l'article est de décrire la technique de microscopie intravitale appliquée à l'auricule de la souris sans poils pour l'observation directe et l'analyse de la microcirculation, la formation de thrombus et de l'évolution de thrombus. Avec un taux d'incidence de 1 sur 1000, la thrombose veineuse est encore une cause fréquente de morbidité. Bien que le diagnostic, les stratégies de prévention et les thérapies ont été développées ces dernières années, un tiers de la thrombose veineuse se manifeste par une embolie pulmonaire 1. La thrombose artérielle joue un rôle essentiel dans les maladies cardio-vasculaires, qui sont la cause la plus fréquente de décès dans les pays industrialisés. thromboses artérielles basée sur la rupture des plaques d'athérosclérose est impliqué dans les crises cardiaques, infarctus mésentérique, et apoplexie. Chaque chirurgie expose les structures sous-endothéliales aux composants sanguins, modifie la dynamique de la circulation sanguine, et immobilise le patient. En chirurgie endoprothétique du membre inférieur, organe transplantation et thrombose chirurgie du lambeau sont des causes fréquentes de complications. thrombose microvasculaire en particulier provoque souvent des dommages irréversibles, en raison de l'absence de symptômes cliniques. De même, la thrombose microvasculaire joue une règle essentielle dans plusieurs maladies, y compris purpura thrombotique thrombocytopénique, la septicémie, la coagulation intravasculaire disséminée, syndrome des antiphospholipides, et l'insuffisance veineuse chronique, entre autres.
Plusieurs nouveaux médicaments pour le traitement et la prévention de la thrombose ont été développées ces dernières années, mais les médicaments antiplaquettaires et les anticoagulants encore avoir des effets secondaires, les antagonistes manquent, et présentent des effets de longue durée. Ces carences entraînent des problèmes dans les soins médicaux d'urgence. Ainsi, il faut plus de recherches pour découvrir les processus complexes qui se produisent pendant la thrombose, qui peut difficilement être simulé in vitro.
La souris sans poils SKH1-Hr a été découvert 1926 dans un zoo à Londres.En raison d'un défaut de gène sur le chromosome 14, l'animal perd sa fourrure après jour post-natal 10. Cela rend le bien vascularisé auricule accessible à la microscopie intravitale des vaisseaux. L'épaisseur moyenne de l'oreille est de 300 um. Il se compose de deux couches de derme, qui sont séparés par du cartilage. Sur la face dorsale convexe du cartilage, 3 faisceaux vasculaires entrent dans le lobe de l'oreille. arcs vasculaires apical et shunts de base relient les trois faisceaux. Les veinules ont des diamètres compris entre 200 pm (de base) et 10 um (apical). Capillaires gros maillés entourent les follicules pileux vide 2. L'anatomie de la souris sans poils SKH1-Hr fait l'auricule un modèle puissant et rentable pour la recherche sur la thrombose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les expériences in vivo (7221.3-1-006 / 15) ont été menées conformément à la législation allemande sur la protection des animaux et le NIH Guide pour les soins et l' utilisation des animaux de laboratoire (Institut des ressources animales de laboratoire, Conseil national de recherches).
1. Tenue générale des animaux
- Effectuez les expériences avec des souris mâles hr SKH1-HR de 4 à 6 semaines. Utiliser des animaux d'un poids compris entre 20 et 25 g.
- Gardez les animaux dans un établissement exempt d' agents pathogènes et dans des conditions normalisées de 24 à 26 ° C et environ 60% d' humidité relative, avec un accès régulier à l' eau et la nourriture ad libitum.
- Gardez jusqu'à cinq animaux mâles dans une cage. Fournir la literie et du matériel d'enrichissement pendant le logement des animaux pour leur bien-être.
2. Prédisposition des animaux
- Peser une souris et de charger le médicament respectif (par exemple, le cannabinoïde, 5 mg / kg de poids corporel (pc)) dans une seringue à insuline. Administrer le médicament 30 minutes avant l'induction de thrombus.
- En tenant le goulot de la souris entre le pouce et l'index et la queue de la souris avec le petit doigt, étirer l'animal et injecter le médicament par voie intraperitoneale (ip) dans le quadrant inférieur gauche de l'abdomen. Remettre en place l'animal dans la cage pendant 15 min.
- Préparer l'anesthésie à la kétamine (90 mg / kg de poids corporel) et de xylazine (25 mg / kg de poids corporel). 15 min avant l'induction de thrombus, anesthésier la souris. Placez la souris dans la cage, tirer la queue légèrement et injecter l'ip anesthésiques avec une seringue d'insuline.
- Placez la souris de nouveau dans la cage jusqu'à l'apparition de l'anesthésie. Pour vérifier l'anesthésie suffisante, pincer la queue avec des pinces.
- Charge 0,05 ml de dextrane marqué à la fluorescéine isothiocyanate-décongelé (FITC-dextran, 5%, 150 kDa) dans une seringue à insuline. Tout en remplissant la seringue, assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air, parce que même petite intravenously (iv) des bulles d'air peuvent être administrés par létale pour l'animal.
- Placez la souris sur anesthésié une plaque chauffante en position face cachée. Ajuster la plaque chauffante à 37 ° C.
- Mettez la pommade oculaire sur la cornée de la souris. Désinfectez la peau et utiliser des instruments stériles.
- Point deux sutures de polypropylène 7/0 dans le bord crânienne et caudale de l'oreille droite. Placez les points le plus près du bord et que des proximale à la base que possible (figure 1B).
- Déplacer la souris sur la position dorsale. Fixer les jambes à la plate-forme de verre acrylique à l'aide de bandes adhésives. Accrocher un fil de suture dans les dents de devant et de positionner la tête en dorsiflexion en collant le fil de suture au verre acrylique avec des bandes adhésives.
- L'animal sur la translocation de la plate-forme sous la loupe binoculaire de fonctionnement. Utilisez un grossissement 16X.
3. Préparation de la gauche Veine jugulaire et injection de FITC-Dextran
Remarque: Pour microroscopy de l'oreille droite, préparer la veine jugulaire gauche.
- En utilisant un scalpel, créer une incision de 5 mm dans la peau sur le côté gauche du cou dans une direction cranio-caudale. Disséquer le tissu sous-cutané avec microforceps et microciseaux. Soit les navires de passage ligaturer avec des sutures polyester 8/0 ou avec l'électrocoagulation.
- Libérez la veine de son adventice en utilisant microforceps et microciseaux sans toucher le navire.
- Utiliser la seringue d'insuline préparée pour l'injection du colorant fluorescent. saisir délicatement la paroi du vaisseau avec les microforceps, sans perforer la veine. Pénétrer la paroi du vaisseau dilaté avec la seringue et injecter iv FITC-dextran.
- Arrêter le saignement après avoir retiré la seringue à l'aide de cotons-tiges. Évitez le sang et le colorant contamination de l'oreille.
4. Positionnement de l'oreille droite pour Intravitale Microscopie Fluorescence
- Transférer l'animal sur la plaque chauffante à un verre acrylique construction avec une fente pour la plaque chauffante et un plan de 0,5 cm de haut pour le positionnement de l'oreille.
- Fixer le visage animal vers le bas sur la plaque de chauffage à l'aide de bandes adhésives. Placez le cartilage relativement forte et convexe à la base de l'oreille à côté du plan de 0,5 cm de haut pour l'oreille (Figure 1B) de sorte que la partie apicale de l'oreille peut être positionné à plat sur le plan.
- Ajouter une goutte de la température ambiante de 0,9% de NaCl par rapport au plan de verre acrylique afin de positionner l'oreille. Placer l'oreille droite, avec les sutures préétablis sur sa face ventrale concave vers le bas, sur la goutte de NaCl à 0,9%. En utilisant des tampons de coton, d'absorber la baisse de NaCl et de laisser les forces capillaires fixent le plan de l'oreille au verre acrylique.
- Collez les sutures du verre acrylique pour fixer la position de l'oreille.
- Ajouter une goutte de 0,9% de NaCl température ambiante à la face dorsale convexe de l'oreille. Soigneusement mettre une lamelle couvre-objet (0,5 cm de diamètre) sur l'oreille sans comprimer les vaisseaux de base entrant the oreille. En utilisant des cotons-tiges, enlever le plus NaCl possible sous la lamelle afin de minimiser la distance entre la lamelle et les vaisseaux cibles de l'oreille.
5. Microscopie intravitale fluorescence et thrombus induction de l'oreille droite
- Réglez le microscope à fluorescence intravitale pour la visualisation FITC-dextran (450-490 nm; FT: 510; LP: 520). Utiliser une variable lampe à mercure de 100 W comme source de lumière. Connectez une haute résolution, CCD noir et blanc appareil photo à un graveur de DVD.
- Transfert de l'animal sur le contenant la plaque verre acrylique de chauffage à l'oreille enlevé fixé au bureau du microscope à fluorescence intravitale.
- En utilisant un grossissement de 20X (20X / 0,95 d'ouverture numérique) et 20% de l'intensité lumineuse, la recherche d'un vaisseau veineux 50 - 60 um de diamètre et avec un flux sanguin antérograde de 400-600 um / s.
- Ajouter une goutte d'eau à la température ambiante à l'immersion pour de lamelle couvre eau du 63x magnificatioObjectif n (ouverture numérique 63X / 0,95). Utiliser une seringue avec une canule d'un diamètre de 1 mm et placer la goutte sur l'objectif du microscope. Ajouter de l'eau juste assez pour contacter la lamelle et l'objectif avec la goutte d'eau.
- Immédiatement après l'application de la goutte d'eau, commencer l'enregistrement de la cuve pendant 20 s avec 20% de l'intensité lumineuse pour la mesure hors ligne du diamètre et du débit sanguin.
- Lancer thrombus induction 5 min après l'injection de FITC-dextran. A cet effet, augmenter l'intensité lumineuse à 100%.
- Au cours de l'induction de thrombus, fermer l'ouverture du microscope pendant 2 s dans un délai de 30 s pour vérifier le flux sanguin. En cas de persistance de la circulation sanguine, ouvrir l'ouverture de nouveau. En cas de flux sanguin arrêté, observer le bateau pendant 30 s.
NOTE: Le navire est classé comme occlus si le débit est toujours debout pendant 30 secondes ou plus ou si le sang coule par voie rétrograde. Si le flux sanguin orthograde commence à nouveau, ouvrir complètement l'ouverture et Contin ue l'induction de thrombus jusqu'à ce que l'occlusion du vaisseau se produit comme décrit ci-dessus. Au début de l'induction de thrombus, assurez-vous que le temps où l'ouverture a été fermée pour vérifier le flux sanguin sont aussi courts que possible afin de maintenir à éclairage presque continue. Plus tard, pendant la croissance de thrombus, le navire est perfusé avec moins de colorant fluorescent, de sorte qu'il peut être observé de manière continue. - Sélectionner et 5 occlure navires par oreille. Limiter le temps d'induction de thrombus sous le microscope à environ 1 h après l'injection de FITC-dextran.
6. Activités de suivi
- Effectuer une fermeture de la plaie du cou à l'aide polypropylène 6/0 transcutanée sutures.
- Lors de la récupération de l'anesthésie, mettez la souris de nouveau dans la cage et réchauffer l'animal en utilisant la lumière infrarouge.
- Transférer les données enregistrées à partir de l'enregistreur de DVD au logiciel permettant la mesure du diamètre des vaisseaux et la vitesse du flux sanguin.
- Laissez l'animal récupérer et éliminer toutes les FITC-dextran injecté pendant 48 h.
- Les étapes réexécuter décrites ci-dessus, cette fois la préparation de la veine jugulaire droite et l'oreille gauche.
8. Tissu Asservation
- Après la microscopie à fluorescence intravitale de l'oreille gauche, échantillon de 0,5 ml de sang du plexus veineux rétrobulbaire de l'œil à l'aide d'un capillaire en verre. pénétrer soigneusement l'angle palpébral interne avec des mouvements de vissage, jusqu'à ce que du sang veineux à travers le capillaire. Recueillir la sonde dans un tube de sang acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
- Après le prélèvement de sang, le sacrifice de l'animal par l'injection de 500 mg / kg de poids corporel de kétamine dans la veine de la queue.
- Compter les cellules sanguines en utilisant un analyseur d'hématologie pour une évaluation quantitative des leucocytes, des érythrocytes, des thrombocytes, l'hémoglobine et l'hématocrite.
- Centrifuger le restant de sang EDTA à 2500 xg et à température ambiante pendant 10 mdans. Pipette et congeler le plasma sanguin pour d'autres investigations.
- Avec des ciseaux, coupez les oreillettes et les fixer dans 4% de formaldéhyde pour un examen histologique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effets du traitement cannabinoïdes sur thrombogenèse
Lors de l' injection de 0,05 ml de FITC-dextran, l' induction phototoxique de thrombus conduit à une lésion endothéliale et la formation d'un bouchon de plaquettes pariétal (figures 2 et 3). Dans la présente étude, l' induction d' un thrombus après l'injection ip de cannabinoïdes (5 mg / kg de poids corporel) ou le véhicule a donné lieu à une occlusion thrombotique des vaisseaux dans toutes les veinules (Figure 4). Chez les animaux traités avec le véhicule, le temps de formation du thrombus était de 430 s (25 e centile: 330; s 75 e centile: 637 s). Ni le cannabidiol (CBD), ni WIN55,212-2 (WIN) l'administration a montré une influence significative sur les temps d'occlusion des vaisseaux. Cependant, l'anandamide cannabinoïde endogène a réduit significativement le temps nécessaire à la formation de thrombus et l' occlusion des vaisseaux thrombotique à 270 s (25 e percentile: 240s; 75 e centile: 360 s, P <0,05 par rapport au véhicule).
Pour tester si l'hydrolyse de l' anandamide et la conversion ultérieure en fonction de la cyclooxygénase de son produit, l' acide arachidonique, est impliqué dans la formation de thrombus par l' anandamide, l'inhibiteur de la cyclooxygénase non spécifique indométhacine a été combiné avec de l' anandamide dans une autre série d'expériences (Figure 5). Encore une fois, lors de l'injection de 0,1 ml de FITC-dextran, l'anandamide (10 mg / kg de poids corporel) réduit le temps de formation de thrombus, par rapport au véhicule (P <0,05 par rapport au véhicule). Bien que le traitement indométacine seul n'a eu aucun effet sur les temps d'occlusion des veinules, l' inhibition de la cyclooxygénase chez les animaux traités anandamide-formation d' un thrombus significativement prolongé à 300 s (25 e percentile: 240 s; 75 e percentile: 420 s), par rapport à la médiane de 160 s (25 e centile: 100; s 75 e centile: 200 s) après anandamide tre atment seulement (P <0,05 par rapport à l'anandamide). Les temps d'occlusion des vaisseaux après traitement du véhicule et co-administration indométacine / anandamide ne diffèrent pas significativement 2.
Figure 1. Préparation de la veine jugulaire (A) et le placement de l'oreille pour microscopie intravitale (B). (A) Utilisation du stéréomicroscope de fonctionnement, la veine jugulaire droite est préparée. Les points de suture pour le placement de l'oreille gauche sont piquées avant l'injection de FITC-dextran. La plaie de la dissection préalable de la veine jugulaire gauche est fermée avec des sutures transcutané (B). L'oreille gauche est fixé avec des sutures en polypropylène 7/0. Une lamelle est soigneusement placé sans comprimer les vaisseaux de base de l'oreille. Une plaque de chauffage maintient la température du corps de l'animal pendant toute l'expérience.om / fichiers / ftp_upload / 55174 / 55174fig1large.jpg » target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Microscopie intravitale et thrombus induction. Le même veinule est montré avant (A) et après (B) induction d' un thrombus à 10X, 20X, 63X et un grossissement ( de gauche à droite). Le plasma sanguin est coloré avec 0,05 ml de fluorescéine dextrane marqué isothiocyanate (FITC-dextran, 5%). Le thrombus est marqué par *. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. veinules thrombus induction. est montré le même veinule before (A), au bout de 100 s (B), et au bout de 300 s (C) d'épi-illumination au moyen de la microscopie à fluorescence intravitale. les espèces réactives de l'oxygène sont générés par épi-illumination de lumière bleue (450-490 nm) de FITC-dextran et nuisent à l'endothélium. Ainsi, les plaquettes sont activées et adhèrent aux structures sous - endothéliales exposées, entraînant la formation de thrombus primaire pariétal (B) et, par la suite, dans l' occlusion des vaisseaux thrombotique complète (C). Ce chiffre a été modifié de Grambow 3. Le thrombus est marqué par *. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. Organigramme Affichage du protocole expérimental. </ Traitement strong> Cannabinoid par injection ip de cannabinoïde respective (10/05 mg / kg de poids corporel) a été effectuée 30 minutes avant IVM et l'induction de la formation de thrombus dans l'oreille droite le jour 0. IVM a été limitée à 1 h. 47 h plus tard, le jour 2, le même protocole a été appliqué à l'oreille gauche de la souris avant de goûter le sang. Ce chiffre a été modifié de Grambow 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5. veinules thrombus Formation après traitement unique cannabinoïdes et Cyclooxygenase inhibition. temps de Occlusion de veinules chez les souris subissant la lumière / colorant induction de thrombus. (A) les animaux ont été traités avec le véhicule contenant le DMSO (VEH) ou avec le cannabinoïdes anandamide (AEA), WIN55,212-2 (WIN) ou le cannabidiol (CBD) (5 mg / kg de poids corporel; n = 5). On a injecté 0,05 ml de 5% de FITC-dextran iv avant l'induction de thrombus. Dans un autre paramètre, 0,1 ml de 5% de FITC-dextran (B) anandamide (10 mg / kg de poids corporel) a été combiné avec l' indométhacine (indo) (5 mg / kg de poids corporel) pour évaluer l'impact des produits dépendant de la cyclooxygénase sur la formation de thrombus par anandamide (n = 5). Kruskal-Wallis ANOVA à sens unique sur les rangs a été suivie par l'analyse post - hoc de Dunn (A et B). Les valeurs sont données à la médiane et IQR (5 e, 25 e, 75 e et 95 e percentiles). * P <0,05 par rapport au véhicule, # P <0,05 par rapport à l'anandamide, § P <0,05 par rapport à l'indométacine. Ce chiffre a été modifié de Grambow 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il y a plusieurs étapes critiques pour l'induction de thrombus réussie dans le lobe de l' oreille de souris SKH1-Hr. Pour le dépannage, les étapes respectives du protocole sont indiqués entre parenthèses.
conditions d'examen sont idéales chez les jeunes animaux à l'âge de 4 - 6 semaines et avec une faible kératinisation de l'épiderme. Chez les animaux plus âgés, la qualité de la visualisation des vaisseaux est pire et moins comparables en raison de la distance entre la surface supérieure de la peau et les vaisseaux cibles (étape 1.1).
Pour éviter l'extravasation de FITC-dextran dans le domaine de l'examen, les sutures de fixation doivent être placés aussi légèrement que possible. À proximité des points de suture, un colorant fluorescent peut extravaser et réduire le contraste entre l'espace extra-vasculaire et les vaisseaux. Cette extravasation du colorant progresse lentement. Si les sutures sont piquées comme mentionné ci-dessus 15 minutes avant l'injection de FITC-dextran, bonconditions d'examen de la microscopie intravitale sont assurées (étape 2.8).
FITC-dextran est lentement éliminé par voie rénale. La combinaison du colorant fluorescent avec une grande dextran moléculaire (150 kDa) retarde extravasation et l'excrétion. Dans la présente étude, le temps pour la microscopie et l'induction thrombus a été limitée à 1 h pour éviter l'influence de l'excrétion et de faibles concentrations plasmatiques de colorant fluorescent sur le temps de formation de thrombus.
Bien que le remplissage des seringues, sans bulles d'air doivent rester à l'injection, car même de petites bulles d'air administré par voie intraveineuse, dans la seringue peut être mortelle pour l'animal (étape 2.5). Lors du retrait de la seringue hors de la veine jugulaire après l'injection intraveineuse, le saignement régulier se produit (étape 2.6). La contamination de l'oreille a ensuite examiné avec le sang ou FITC-dextran rend la microscopie intravitale pratiquement difficile, voire impossible. Ainsi, la préparation de l'oreille controlatérale et la veine jugulaire est recommandée.
La lamelle doit être soigneusement appliquée, sans aucune pression supplémentaire (étape 4.5). Dans le cas contraire, le flux sanguin dans l'ensemble de l'oreille est ralenti en raison de la compression des vaisseaux de base, ce qui pourrait diminuer les temps d'occlusion pendant l'induction de thrombus. Le placement précis desla lamelle peut être vérifiée avec le stéréomicroscope. Les veinules doivent être remplis sans cesse, en particulier sur les bords de la lamelle. La lamelle doit être utilisé pour garantir le contact de la goutte d'eau avec l'objectif du microscope à fluorescence intravitale. L'immersion doit être obtenue au cours de l'ensemble de l'induction d'un thrombus dans le but d'assurer l'épi-illumination de la cuve avec 100% d'intensité lumineuse. La meilleure façon d'obtenir le placement stable de la goutte d'eau est à l'aide la lamelle. Mettre la goutte sur une pellicule de plastique translucide ou hydratée directement sur la peau provoque une évacuation de l'eau et de l'immersion inconstant.
Signification et limites de la Lobe du Hairless SKH1-Hr Souris
La souris sans poils SKH1-RH RH permet l' imagerie fonctionnelle directe des vaisseaux dans le lobe de l' oreille à l' aide de la microscopie intravitale 2, 4, 2. L'ensemble du réseau microvasculaire, composé de veinules, artérioles et des capillaires jusqu'à 100 um de diamètre, peut être visualisée et examiné en temps réel. Cela rend l'oreille de souris sans poils , un modèle approprié pour l'étude de la cicatrisation des plaies 6, 7, des volets-motif axial 2, 5, les fuites macromoléculaire 5, et la formation de thrombus microvasculaires 8, 9, 10. La disponibilité des navires jusqu'à 100 pm de diamètre a une limite au modèle. Contrainte de cisaillement, la circulation sanguine, et l'architecture des vaisseaux diffèrent dans les petits et les gros vaisseaux. Par conséquent, des modèles comme l'artère carotide ou les vaisseaux fémoraux peuvent être plus appropriés pour des études portant sur la formation de thrombus macrovasculaires.
Tous les autres modèles de visualisation intravitale de la microcirculation, tels que la joue de hamster 11, la chambre de pli cutané dorsal de la souris 12, 13, ou le muscle crémaster du rat 9, 10 nécessitent une préparation chirurgicale. Les vaisseaux de l'oreille de la souris sans poils sont accessibles sans aucun risque d'endommagement des tissus par la chirurgie, donc il n'y a pas d' influence sur les paramètres de mesure par l' inflammation, la vasoconstriction et l' activation de l' hémostase dans le lobe de l' oreille de la souris sans poils 14. Même si aucune préparation chirurgicale est nécessaire, la résolution de l' image et la clarté sont comparables à d' autres modèles (par exemple, la chambre du pli cutané dorsal et préparation crémaster). Afin d'obtenir une haute qualité d'image, le protocole doit être suivi à fond, et les jeunes souris avec moins de kératinisation til derme doivent être utilisés.
En raison de leur localisation superficielle, les vaisseaux de l'oreille peuvent facilement être étudiés par microscopie à fluorescence intravitale. Ils permettent la thermorégulation chez l'animal grâce à leur adaptation du diamètre du vaisseau. Par conséquent, la chambre et la température du corps doivent être standardisés pour obtenir des résultats reproductibles. Tous les navires de lobe de l'oreille représentent les vaisseaux périphériques dans le tissu cutané. Par rapport aux vaisseaux centraux, les vaisseaux périphériques sont caractérisés par différentes structures histologiques et l'expression du récepteur. Par conséquent, d' autres modèles (par exemple, la préparation des veinules mésentériques et artérioles) peuvent être plus raisonnable pour l'examen des questions spécifiques concernant les navires centraux.
Une autre limitation du modèle décrit est la restriction associée à l' aide de souris sans poils SKH1-hr hr, qui ne sont pas aussi courante que d' autres souches de souris. Par conséquent, la reproduction des souris sans poils transgéniques peut être le travailIOU et coûteux. Chimique et l'épilation mécanique peuvent provoquer une inflammation locale et ne supprime pas les racines des cheveux, ce qui peut nuire à la qualité de visualisation. Comme une bonne qualité de visualisation et une faible distance entre la surface et le vaisseau cible est crucial pour l'induction de thrombus fiable; d' autres modèles (par exemple, la chambre du pli cutané dorsal) de la souris peuvent être plus appropriés pour les études qui nécessitent certaines souches de souris à fourrure. D'autre part, le modèle permet la simulation earlobe de divers états pathologiques. Par exemple, la microcirculation dans le tissu critique perfusé peut être examinée après la ligature de deux des trois faisceaux neurovasculaires 15. L' analyse de la microcirculation lors de la cicatrisation des plaies est un autre exemple approprié pour l'utilisation de l'oreille du modèle de souris sans poils 16.
Pour certaines questions expérimentales, il est important d'examiner le même animal à différents points de temps à Asséss la séquence temporelle d'un traitement. Dans l'étude expérimentale publiée récemment, l' induction de thrombus dans l'oreille gauche n'a pas été modifiée par un traitement préalable de l'oreille droite 3. Par conséquent, un autre avantage du modèle est la possibilité d'induction de thrombus dans chaque oreille de la même souris à deux moments différents. En ce qui concerne la protection des animaux, la procédure expérimentale est peu invasive pour les animaux, et les souris n'ont pas à se remettre de la chirurgie ou transporter une chambre de pli cutané dorsal entre les expériences. Dans tous les animaux, au moins cinq navires appropriés par l'oreille peuvent être obstrués par induction phototoxique de thrombus, tant les données peuvent être recueillies à l'aide d'un petit nombre d'animaux.
Signification et limites de Microscopie intravitale et thrombus induction
La microscopie à fluorescence intravitale permet la visualisation de la microcirculation en temps réel 5. Après administration intraveineuse, FITC-dextran colore le plasma sanguin. Elle permet l'observation de la croissance de thrombus depuis le début de l'induction jusqu'à ce que l'occlusion du vaisseau complet. globules blancs et rouges peuvent être identifiés comme des lacunes dans le milieu de contraste. Pour de plus amples investigations (par exemple, les interactions granulocytes) endothélium, globules blancs peuvent être colorés avec de la rhodamine-6G.
L'analyse de l' enregistrement et hors de l'expérience permet la mesure in vivo de la vitesse de globules rouges, la vasomotricité artériolaire, la densité capillaire et le diamètre microvasculaire. Ces paramètres jouent un rôle important dans la formation de thrombus, la perfusion des volets, et la cicatrisation des plaies. Observation par microscopie intravitale peut quantifier directement et de façon continue ces paramètres de perfusion dynamique et leur altération au cours de l'expérience 5. D'autres techniques, comme délavage au xénon, les niveaux d'oxygène des tissus, laser Doppler, ou la diffusion de colorant, sont aussi peu invasive, mais ils sont limités par til mesure indirecte du flux sanguin. Cela peut affecter la validité des résultats expérimentaux. Par conséquent, les méthodes directes sont préférés.
La réaction du colorant fluorescent et la lumière d'une certaine longueur d' onde dans les résultats de la libération d'espèces réactives de l' oxygène, qui endommagent localement l'endothélium 17. Le temps d'exposition des particules de sang fluides est moins 1000 X par rapport à l'endothélium. Par conséquent, l'effet thrombogène est primaire due à une lésion endothéliale phototoxique et non due à l' activation des plaquettes phototoxique directe 18. Les plaquettes sont activées par contact de la matrice sous - endothéliale exposée et forment un bouchon de plaquettes 19 (Figure 3). Ce mécanisme de thrombogenèse joue un rôle de premier plan dans de nombreuses situations, telles que l'angine de poitrine instable et anastomose vasculaire.
Lumière / colorant l'induction de thrombus est moins invasive que l'alternative méthodes de créer des lésions endotheliales à travers le cathéter à ballonnet 20, le courant électrique 21, le laser 22, ou une inflammation 19. induction de thrombus avec la lumière / colorant agit également strictement localement dans le faisceau lumineux de l'objectif. Par conséquent, les vaisseaux voisins ne sont pas affectés directement et peuvent être utilisés pour l'induction subséquente de thrombus. Lumière / colorant induction de thrombus peut être réalisée dans les deux veinules et artérioles. Dans la présente étude, veinules ont été traités exclusivement parce que epi-éclairage des artérioles peut causer vasospasme, ce qui pourrait affecter l'occlusion fois 19.
L'anesthésie a été effectuée en utilisant la combinaison de xylazine et de kétamine, qui est établie en médecine vétérinaire et expérimentale. Les médicaments ont été injectés ip. Avec la posologie indiquée ci-dessus, l'anesthésie suffisante avec la tolérance de la chirurgie pendant 30 min et de sommeil pendant 1,5 à 2 h ont été atteints.
L'oreille de la souris sans poils SKH1-Hr est bien établie dans la guérison et la recherche du volet de la plaie. Plusieurs études ont utilisé le modèle avec succès pour l' induction de thrombus et thrombolyse 3, 23, 24, 25, 26. Si le protocole est effectué correctement, la microscopie intravitale dans le lobe de l' oreille de la souris sans poils SKH1-Hr est un outil fiable, facile et efficace pour l'étude de la formation de thrombus et microcirculation. Il est simple de simuler différentes conditions pathologiques, tandis que le modèle offre un excellent cadre expérimental pour évaluer les paramètres cruciaux de la microcirculation in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les auteurs ont pas accusés de réception.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SKH-1/hr mice | Charles River | 477 | can be purchased from other vendors |
| standard laboratory food | ssniff Spezialdiaeten | V1594-0 | can be purchased from other vendors |
| operation stereomicroscope | Leica | M651/M655 | can be purchased from other vendors |
| intravital microscope | Zeiss | Axiotech Vario 100 | can be purchased from other vendors |
| objective (20X/0.95) | Zeiss | 20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR | can be purchased from other vendors |
| objective (63X/0.95) | Zeiss | 63x/0,95 W; ACHROPLAN | can be purchased from other vendors |
| black and white CCD-camera | Pieper | FK 6990 IQ-S | can be purchased from other vendors |
| DVD-recorder | Panasonic | DMR-EX99V | can be purchased from other vendors |
| sodium chloride | Braun | 5/12612055/1011 | can be purchased from other vendors |
| Ketamine 10% | Bela pharm | F3901-6 | can be purchased from other vendors |
| Xylazine 2% | Bayer | 6293841.00.00 | can be purchased from other vendors |
| FITC-dextran 5% | Sigma | 46945-100MG-F | can be purchased from other vendors |
| dexapanthenol 5% eye ointment | Bayer | 6029009.00.00 | can be purchased from other vendors |
| formaldehyde 4% | Sigma | HT501128-4L | can be purchased from other vendors |
| DMSO | Sigma | 472301 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 5 x 5 x 1 mm | Menzel | L4339 | can be purchased from other vendors |
| Adhesive strips | Leukosilk | 4683400 | can be purchased from other vendors |
| centrifuge | Beckman Coulter | CLGS 15 | can be purchased from other vendors |
| hematology analyzer | Sysmex | KX-21 A6980 | can be purchased from other vendors |
| EDTA-blood tube | Sarstedt | 201,341 | can be purchased from other vendors |
| cotton swabs | Sanyo | 604-A-1 | can be purchased from other vendors |
| infrared light | Beurer | 5/13855 | can be purchased from other vendors |
| single use synringe | Braun | 2020-08 | can be purchased from other vendors |
| insulin syringe | Braun | 9161502 | can be purchased from other vendors |
| disposable hypodermic needles | Braun | 465 7640 | can be purchased from other vendors |
| end-to-end capillary | Sarstedt | 19,447 | can be purchased from other vendors |
| heating plate | Klaus Effenberg | OP-T 185/03 | can be purchased from other vendors |
| scissors 14.5 cm | Aesculap | BC259R | can be purchased from other vendors |
| needle Holder | Aesculap | BM081R | can be purchased from other vendors |
| microforceps | Aesculap | BD331R | can be purchased from other vendors |
| microscissors | Aesculap | OC496R | can be purchased from other vendors |
| scalpel 21 | Dahlhausen | 11.000.00.511 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 7-0 | Ethicon | XNEH7470 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 6-0 | Ethicon | XN8706.P33 | can be purchased from other vendors |
| electrocautery | Servoprax | H40140 | can be purchased from other vendors |
| acrylglass pad | integrated heating, 0.5 cm high plane |
References
- White, R. H. The epidemiology of venous thromboembolism. Circulation. 107 (23), I4-I18 (2003).
- Benavides, F., Oberyszyn, T. M., VanBuskirk, A. M., Reeve, V. E., Kusewitt, D. F. The hairless mouse in skin research. J Dermatol Sci. 53 (1), 10-18 (2009).
- Grambow, E., Strüder, D., Klar, E., Hinz, B., Vollmar, B. Differential effects of endogenous, phyto and synthetic cannabinoids on thrombogenesis and platelet activity. Biofactors. , (2016).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvasc Res. 19 (3), 374-379 (1980).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plast Reconstr Surg. 83 (6), 948-959 (1989).
- Goertz, O., et al. Evaluation of a novel polihexanide-preserved wound covering gel on dermal wound healing. Eur Surg Res. 44 (1), 23-29 (2010).
- Goertz, O., et al. Determination of microcirculatory changes and angiogenesis in a model of frostbite injury in vivo. J Surg Res. 168 (1), 155-161 (2011).
- Roesken, F., et al. A new model for quantitative in vivo microscopic analysis of thrombus formation and vascular recanalisation: the ear of the hairless (hr/hr) mouse. Thromb Haemost. 78 (5), 1408-1414 (1997).
- Sorg, H., et al. Antithrombin is as effective as heparin and hirudin to prevent formation of microvascular thrombosis in a murine model. Thromb Haemos. 96 (3), 371-377 (2006).
- Sorg, H., et al. Efficacy of antithrombin in the prevention of microvascular thrombosis during endotoxemia: an intravital microscopic study. Thromb Res. 121 (2), 241-248 (2007).
- Kovács, I. B., Sebes, A., Trombitás, K., Csalay, L., Görög, P. Proceedings: Improved technique to produce endothelial injury by laser beam without direct damage of blood cells. Thromb Diath Haemorrh. 34 (1), 331 (1975).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. Eur Cell Mat. 20 (22), 147-167 (2011).
- Grambow, E., et al. Effect of the hydrogen sulfide donor GYY4137 on platelet activation and microvascular thrombus formation in mice. Platelets. 25 (3), 166-174 (2014).
- Fiebig, E., Ley, K., Arfors, K. E. Rapid leukocyte accumulation by spontaneous rolling and adhesion in the exteriorized rabbit mesentery. Int J Microcirc Clin Exp. 10 (2), 127-144 (1991).
- Harder, Y., et al. Gender-specific ischemic tissue tolerance in critically perfused skin. Langenbecks. Arch Surg. 395 (1), 33-40 (2010).
- Langer, S., et al. Effect of polyvinylpyrrolidone-iodine liposomal hydrogel on wound microcirculation in SKH1-hr hairless mice. Eur Surg Res. 38 (1), 27-34 (2006).
- Saniabadi, A. R., Umemura, K., Matsumoto, N., Sakuma, S., Nakashima, M. Vessel wall injury and arterial thrombosis induced by a photochemical reaction. Thromb Haemost. 73 (5), 868-872 (1995).
- Herrmann, K. S., et al. Platelet aggregation induced in the hamster cheek pouch by a photochemical process with excited fluorescein isothiocyanate-dextran. Microvasc Res. 26 (2), 238-249 (1983).
- Rumbaut, R. E., Slaff, D. W., Burns, A. R. Microvascular thrombosis models in venules and arterioles in vivo. Microcirculation. 12 (3), 259-274 (2005).
- Lee, W. M., Lee, K. T. Advanced coronary atherosclerosis in swine produced by combination of balloon-catheter injury and cholesterol feeding. Exp Mol Pathol. 23 (3), 491-499 (1975).
- Callahan, A. B., Lutz, B. R., Fulton, G. P., Degelman, J. Smooth muscle and thrombus thresholds to unipolar stimulation of small blood vessels. Angiology. 11, 35-39 (1960).
- Rosen, E. D., et al. Laser-induced noninvasive vascular injury models in mice generate platelet- and coagulation-dependent thrombi. Am J Pathol. 158 (5), 1613-1622 (2001).
- Agero, U., et al. Effect of mutalysin II on vascular recanalization after thrombosis induction in the ear of the hairless mice model. Toxicon. 50 (5), 698-706 (2007).
- Menger, M. D., Rösken, M., Rücker, M., Seiffge, D., Vollmar, B. Antithrombotic and thrombolytic effectiveness of rhirudin in microvessels. Langenbecks Arch Chir. 115 (1), 19-20 (1998).
- Bilheiro, R. P., et al. The thrombolytic action of a proteolytic fraction (P1G10) from Carica candamarcensis. Thromb Res. 131 (4), 175-182 (2013).
- Kram, L., Grambow, E., Mueller-Graf, F., Sorg, H., Vollmar, B. The anti-thrombotic effect of hydrogen sulfide is partly mediated by an upregulation of nitric oxide synthases. Thromb Res. 132 (2), 112-117 (2013).
