Summary
המודל האוזן של העכבר SKH1-HR HR שיער מאפשר מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital מיקרו מחזורי ואינדוקציה פקיק phototoxic בלי הכנה כירורגית מוקדמת במיטה בחן כלי הדם. לכן, האוזן של העכבר ללא שיער היא מעולה במודל vivo ללמוד את יחסי הגומלין המורכבים במהלך היווצרות פקיק כלי דם, התפתחות פקיק, ו thrombolysis.
Abstract
סיבוכים טרומבוטיים של מחלות כלי דם הם גורם מוביל אחד לתחלואה ולתמותה במדינות מתועשות. בשל יחסי הגומלין המורכבים בין מרכיבי דם הסלולר בלתי תאיים במהלך היווצרות פקיק, מחקרים אמינים של הפיסיולוגיה והפתופיזיולוגיה של פקק יכולים להתבצע רק in vivo. לכן, במאמר זה מציג מודל האוזן בעכברים חסרי שיער ומתמקדת in vivo ניתוח מיקרו מחזורי, היווצרות קריש דם, והאבולוציה פקיק. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital ואת תוך הוורידים (iv) היישום של צבעי ניאון בהתאמה, ניתוח חוזר של מייקרו ב האפרכסת יכול להתבצע בקלות, ללא צורך בהכנה כירורגי. יתר על כן, המודל הזה ניתן להתאים ללימודי in vivo של נושאים שונים, כולל ריפוי פצעים, פגיעה reperfusion, או אנגיוגנזה. לסיכום, האוזן של עכברים חסרי שיער הוא מודל אידיאלי עבור ב vivמחקר o מייקרו מחזור עור בתנאים פיסיולוגיים או pathophysiological ועבור ההערכה של התגובה שלה לטיפולים מערכתיים או אקטואליים שונים.
Introduction
מטרת המאמר הנוכחי היא לתאר את הטכניקה של מיקרוסקופיה intravital להחיל את אפרכסת עכבר ללא שיער עבור תצפית ישירה וניתוח מיקרו מחזורי, היווצרות קריש דם, והאבולוציה פקיק. עם שיעור ההיארעות של 1 ב 1000, פקקת ורידים היא עדיין גורם שכיח לתחלואה. למרות אבחון, אסטרטגיות מניעות, טיפולים פותחו בשנים האחרונות, שליש פקק ורידים מבטאים כמו תסחיף ריאתי 1. פקק עורקים משחק תפקיד קריטי מחלות לב וכלי דם, אשר הם הגורם השכיח ביותר למוות במדינות תעשייתיות. פקקת עורקים מבוסס על קרע של פלאק טרשת עורקים מעורב התקפי לב, אוטם mesenteric, חרון וחמה. כל ניתוח חושף מבני subendothelial לרכיבי דם, משנה את הדינמיקה של זרימת דם, ומשתק את החולה. בניתוח endoprosthetic של הגפיים התחתונות, לא איברransplantation ו פקק דש ניתוח הם גורמים שכיחים של סיבוכים. פקקת כלי הדם בפרט לעיתים קרובות גורם לנזק בלתי הפיך, בשל היעדר סימפטומים קליניים. כמו כן, פקקת כלי הדם ממלא שלטון מכריע בכמה מחלות, כולל ארגמנת תרומבוציטופנית טרומבוטיים, אלח דם, קרישה תוך-כלית מפושטת, תסמונת antiphospholipid, ו-ספיקה ורידית כרונית, בין היתר.
תרופות חדשות אחדות עבור הטיפול והמניעה של פקק פותחו בשנים האחרונות, אבל טסיות תרופות נגד קרישת דם עדיין יש תופעות לוואי, אנטגוניסטים חוסר, וכוללות תופעות משך זמן. ליקויים אלה להוביל לבעיות בטיפול רפואי דחוף. לפיכך, יש צורך במחקר נוסף כדי לחשוף את התהליכים המורכבים המתרחשים במהלך פקק, אשר בקושי ניתן לדמות במבחנה.
עכבר hr SKH1-HR השיער התגלה 1926 בגן חיות בלונדון.בשל פגם גנטי בכרומוזום 14, החיה מאבדת את הפרווה שלה אחרי יום הלידה 10. זה הופך את מיקרוסקופיה היטב vascularized אפרכסת נגישה intravital של כלי. העובי הממוצע של האוזן הוא 300 מיקרומטר. הוא מורכב משתי שכבות של הדרמיס, אשר מופרדים על ידי סחוס. בצד הגב הקמור של הסחוס, 3 חבילות וסקולרית להיכנס התנוך. קשתות וסקולריים Apical ו shunts הבסיס לחיבור שלושת חבילות. Venules יש בקטרים בין 200 מיקרומטר (basal) ו 10 מיקרומטר (פסגה). נימים-מרושתים לסגור המקיפים את השיער הריק זקיקי 2. האנטומיה של העכבר hr SKH1-HR שיער הופכת את אפרכסת מודל עוצמה וחסכוני למחקר פקקת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים vivo ב (7221.3-1-006 / 15) נערכו בהתאם לחקיקה גרמנית על הגנה על בעלי חיים מדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (Institute of Resources בחיות מעבדה, המועצה הלאומית למחקר).
שמירת 1. כללי של בעלי החיים
- בצע את הניסויים עם עכברים SKH1-HR HR זכר בגילאי 4 עד 6 שבועות. משתמשים בבעלי חיים עם משקל בין 20 ו 25 גרם.
- שמור את החיות במתקן הפתוגן נטול בתנאים סטנדרטיים של 24 עד 26 מעלות צלזיוס וכ לח 60% ביחס, עם גישה קבועה כדי כרצונך מים ומזון.
- שמור עד חמש חיות זכר בכלוב אחד. ספקו מצעים וחומר העשרה במהלך הדיור של בעלי חיים ורווחתם.
2. סידור מכוון של בעלי החיים
- לשקול עכבר וטען את התרופה המתאימה (למשל, קנבינואידים, 5 מ 'משקל גוף g / kg (BW)) לתוך מזרק אינסולין. נהל דק תרופת 30 לפני גיוס פקיק.
- על ידי החזקת הצוואר של העכבר בין האגודל לבין האצבע המורה ואת הזנב של העכבר עם האצבע הקטנה, למתוח את החיה ואת להזריק את התרופה intraperitoneally (IP) לתוך ברבע השמאלי התחתון של הבטן. שים את החיה בחזרה לתוך הכלוב עבור 15 דקות.
- הכן הרדמה עם קטמין (90 מ"ג / ק"ג BW) ו xylazine (25 מ"ג / ק"ג BW). 15 דקות לפני אינדוקציה פקיק, להרדים את העכבר. שים את העכבר בכלוב, למשוך את הזנב מעט, ולהזריק את ip הרדמה עם מזרק אינסולין.
- שים את העכבר בחזרה לתוך הכלוב עד תחילת ההרדמה. כדי לאמת הרדמה מספיק, לצבוט את הזנב עם מלקחיים.
- טען 0.05 מ"ל של dextran isothiocyanate שכותרתו והעמסת מופשר (FITC-dextran; 5%, 150 KDA) לתוך מזרק אינסולין. תוך מילוי המזרק, להבטיח כי אין בועות אוויר להישאר, כי intravenousl הקטנה אפילוy (iv) בועות אוויר -administered יכול להיות קטלני עבור החיה.
- מניחים את העכבר הרדים על צלחת חימום בעמדה כלפי מטה. התאם את צלחת חימום עד 37 מעלות צלזיוס.
- שם משחת עיניים על הקרנית של העכבר. לחטא את העור ולהשתמש בכלים סטריליים.
- Stitch שני תפרים של פוליפרופילן 7/0 לתוך קצה הגולגולת ואת הזנב של האוזן הימנית. מניח את התפרים קרובים לקצה וכפי הפרוקסימלי לבסיס ככל האפשר (1B איור).
- העבר את העכבר למצב הגבי. לתקן את כל הרגליים לפלטפורמת acrylglass באמצעות רצועות דבקות. הוק תפר תחת השיניים הקדמיות ולמקם את הראש ב dorsiflexion ידי דבק תפר את acrylglass עם רצועות דבקות.
- Translocate חיה על הפלטפורמה תחת סטראו הפעולה. השתמש גדלת 16X.
3. הכנת וריד הצוואר שמאל הזרקת FITC-dextran
הערה: מיקרופוןroscopy של האוזן הימנית, להכין את וריד הצוואר השמאלי.
- באמצעות אזמל, ליצור חתך 5 מ"מ בעור בצד השמאלי של הצוואר לכיוון סקראל הזנב. לנתח את הרקמה התת עורית עם microforceps ו microscissors. כך או כלי למעבר ולקשור עם התפרים פוליאסטר 8/0 או עם electrocoagulation.
- שחרר את הווריד מן adventitia שלה באמצעות microforceps ו microscissors בלי לגעת הספינה.
- השתמש מזרק אינסולין מוכן להזרקה של צבע פלואורסצנטי. בזהירות לתפוס את הקיר כלי עם microforceps, ללא ניקוב הווריד. לחדור את דופן כלי נפוחה עם המזרק להזריק iv FITC-dextran.
- לעצור את הדימום לאחר משיכת מזרק באמצעות צמר גפן. הימנע דם לצבוע זיהום של האוזן.
4. מיצוב של האוזן הימנית עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital
- מעבירים את החיה על צלחת חימום ל C acrylglassonstruction עם חריץ עבור צלחת חימום מטוס 0.5 סנטימטר גבוה עבור מיצוב לאוזן.
- תקן את פן חיה מטה על צלחת החימום באמצעות רצועות דבקות. מניח את הסחוס החזק קמור יחסית בבסיס האוזן ליד המטוס 0.5 סנטימטר הגבוה עבור האוזן (האיור 1B) כך שחלק הפסגה של האוזן ניתן למקם שטוח על המטוס.
- להוסיף טיפה אחת של-בטמפרטורת החדר 0.9% NaCl למטוס acrylglass כדי למקם את האוזן. מניח את האוזן הימנית, עם התפרים המוסכמים על צד הגחון הקעור שלה פונים כלפי מטה, על הירידה של 0.9% NaCl. באמצעות צמר גפן, לספוג ירידה של NaCl ולתת לכוחות נימי לצרף את המטוס האוזן אל acrylglass.
- קלט את התפרים אל acrylglass כדי לתקן את העמדה של האוזן.
- להוסיף טיפה אחת של NaCl הטמפרטורה 0.9% מקום בצד הגבי הקמור של האוזן. בזהירות לשים coverslip אחד (0.5 ס"מ קוטר) על האוזן מבלי לדחוס כלי הבסיס הזנת האוזן דואר. באמצעות צמר גפן, להסיר NaCl ככל האפשר מתחת coverslip כדי למזער את המרחק בין coverslip וכלי יעד אוזן.
5. מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital ו פקיק אינדוקציה של האוזן הימנית
- התאם את מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital עבור להדמיה FITC-dextran (450 - 490 ננומטר; FT: 510; LP: 520). השתמש מנורת כספית משתנה 100-W כמקור אור. חבר מצלמה CCD ברזולוציה גבוהה, בשחור-לבן כדי צורב DVD.
- מעבירים את החיה על acrylglass המכיל את צלחת חימום עם האוזן נחטף קבוע לדלפק של מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital.
- באמצעות גדלת 20X (20X / צמצם מספרי 0.95) ו 20% עוצמת אור, לחפש כלי ורידים 50 - 60 מיקרומטר בקוטר עם זרימת דם האנטרוגרד של 400 - 600 מיקרומטר / s.
- להוסיף טיפה אחת של מים בטמפרטורת החדר כדי coverslip עבור טבילה במים של 63x magnificatioמטרת n (63X / 0.95 צמצם מספרי). השתמש במזרק עם צינורית בקוטר 1 מ"מ ומניחים את הירידה על המטרה של מיקרוסקופ. להוסיף מספיק מים כדי לפנות coverslip ואת המטרה עם טיפת מים.
- מייד לאחר היישום של טיפת המים, להתחיל להקליט את הכלי עבור 20 s עם 20% עוצמת אור עבור המדידה המחוברת של הזרימה בקוטר ודם.
- התחל אינדוקציה פקיק 5 דקות לאחר הזרקה של-dextran FITC. לשם כך, להעלות את עוצמת האור עד 100%.
- במהלך אינדוקצית פקיק, לסגור את הצמצם של מיקרוסקופ עבור 2 ימים בתוך תקופה של 30-ים כדי לבדוק את זרימת הדם. במקרה של התמדת זרימת דם, לפתוח את הצמצם שוב. במקרה של זרימת דם פסיק, לבחון את הכלי עבור 30 s.
הערה: הכלי מסווג האפיל אם הזרימה עומדת מלכה עבור 30 s או יותר או אם הדם זורם retrogradely. אם זרימת הדם orthograde מתחיל שוב, לגמרי לפתוח את הצמצם ואת Contin UE אינדוקציה פקיק עד חסימת כלי מתרחשת כפי שתואר לעיל. במהלך אינדוקציה פקיק מוקדם, להבטיח כי פעמים כאשר הצמצם היה סגור כדי לבדוק את זרימת הדם הם קצרים ככל האפשר על מנת לשמור כמעט EPI-תאורה רציפה. מאוחר יותר, במהלך צמיחת פקיק, הספינה perfused עם צבע פלואורסצנטי פחות, אז זה יכול להיות שנצפה ברציפות. - בחר לחסום 5 ספינות לכל אוזן. הגבל את הזמן של אינדוקציה פקיק תחת מיקרוסקופ כ 1 שעות לאחר הזרקה של-dextran FITC.
6. פעילויות המשך
- בצע סגירת הפצע של הצוואר באמצעות פוליפרופילן transcutaneous 6/0 תפרים.
- במהלך ההתאוששות מההרדמה, לשים את העכבר בחזרה לתוך הכלוב ולחמם את החיה באמצעות אור אינפרא אדום.
- מעבירים את הנתונים שנרשמו מן מקליט DVD לתוכנה המאפשר מדידה של קוטר כלי ומהירות זרימת הדם.
- בואו החיה להתאושש ולחסל מוזרק כל FITC-dextran עבור 48 h.
- הרץ שוב את השלבים המתוארים לעיל, והפעם הכנת וריד תקין הצוואר ואת האוזן השמאלית.
8. רקמות Asservation
- לאחר מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital של האוזן השמאלית, מדגם 0.5 מ"ל של דם מן מקלעת וריד retrobulbar של העין באמצעות נימי זכוכית. בזהירות לחדור זווית palpebral הפנימית עם תנועות דופקות, עד דם ורידים זורם דרך הנימים. אסוף את החללית בחומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) צינור דם.
- לאחר לקיחת דמים, להקריב את החיה על ידי הזרקת 500 מ"ג / ק"ג BW קטמין לווריד הזנב.
- ספירת תאי הדם באמצעות נתח המטולוגיה עבור הערכה כמותית של לויקוציטים, אריתרוציטים, טרומבוציטים, המוגלובין, המטוקריט ו.
- צנטריפוגה דם EDTA הנותרים 2500 טמפרטורת XG ואת מקום 10 מ 'ב. פיפטה להקפיא את הפלזמה בדם לחקירות נוספות.
- בעזרת מספריים, לחתוך את auricles ולתקן אותם בפורמלין 4% עבור בדיקה היסטולוגית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההשפעות של טיפול הקנבינואידיים Thrombogenesis
לאחר הזרקה של 0.05 מ"ל של FITC-dextran, אינדוקציה פקיק phototoxic מוביל הנגע האנדותל היווצרות תקע טסיות הקודקודית (איורים 2 ו 3). במחקר הנוכחי, אינדוקציה פקיק לאחר הזרקת ip של קנבינואידים (5 מ"ג / ק"ג BW) או הרכב הביא חסימת כלי טרומבוטיים בכל venules (איור 4). אצל בעלי חיים שטופלו הרכב, הפעם כדי היווצרות פקיק היה 430 ים (25 לאחוזון ה: 330 ים; 75 לאחוזון ה: 637 ים). אף קנבידיול (CBD) ולא WIN55,212-2 (WIN) ממשל הראה שפעה רלוונטית על פי חסימת כלי. עם זאת, anandamide קנבינואידים אנדוגניים משמעותי את הזמן הדרוש להיווצרות קריש דם ואת חסימת כלי טרומבוטיים כדי 270 ים (25 לאחוזון ה: 240ים; 75 לאחוזון ה: 360 ים, P <0.05 לעומת הרכב).
כדי לבדוק אם הידרוליזה של אננדמיד ואת המרת cyclooxygenase-תלוי הבאה של המוצר שלה, החומצה הארכידונית, המעורב בהווצרות פקיק ידי אננדמיד, את אינדומטצין מעכב cyclooxygenase הנוקב שולב עם anandamide ב קבוצה נוספת של ניסויים (איור 5). שוב, על הזרקה של 0.1 מ"ל של FITC-dextran, אננדמיד (10 מ"ג / ק"ג BW) מופחת פעמים היווצרות פקיק, לעומת הרכב (P <0.05 לעומת הרכב). בעוד הטיפול אינדומטצין לבד לא הייתה השפעה על פי venular חסימה, עיכוב cyclooxygenase בחיות שטופלו anandamide ממושכת משמעותית היווצרות פקיק כדי 300 ים (25 לאחוזון ה: 240 ים; 75 לאחוזון ה: 420 ים), לעומת החציון של 160 ים (25 לאחוזון ה: 100 ימים; 75 לאחוזון ה: 200 ימים) לאחר anandamide Tre atment בלבד (P <0.05 לעומת אננדמיד). פעמי כלי חסימה לאחר טיפול רכב אינדומטצין / anandamide שיתוף ממשל לא היו שונות משמעותית 2.
איור 1. הכנה של וריד הצוואר (א) והמיקום של האוזן מיקרוסקופית Intravital (B). (א) שימוש המבצע סטראו, וריד הצוואר התקין מכין. התפרים עבור המיקום של האוזן השמאלית הם תפרו לפני הזריקה של-dextran FITC. הפצע מן דיסקציה מראש של וריד הצוואר השמאלי סגור עם תפרי transcutaneous (B). האוזן השמאלית הוא קבוע עם התפרים פוליפרופילן 7/0. Coverslip מושם בזהירות מבלי לדחוס כלי הבסיס של האוזן. צלחת חימום שומרת על טמפרטורת הגוף של החיה במהלך הניסוי כולו.אום / קבצים / ftp_upload / 55,174 / 55174fig1large.jpg" target = '_ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מיקרוסקופי Intravital ו פקיק אינדוקציה. אותו ורדיד מוצג לפני (א) ואחרי (B) אינדוקציה פקיק ב 10X, 20X, והגדלה 63X (משמאל לימין). הפלזמה בדם מוכתמת 0.05 מ"ל של dextran שכותרתו-isothiocyanate והעמסת (FITC-dextran, 5%). פקיק מסומן *. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. Venular פקיק אינדוקציה. אותו ורדיד מוצג before (א), אחרי 100 ימים (B), ואחרי 300 ים (C) של תאורת EPI באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital. מיני חמצן מגיבים נוצרים על ידי EPI-תאורת אור הכחול (450 - 490 ננומטר) של FITC-dextran ולפגוע האנדותל. לפיכך, על טסיות מופעלים לדבוק מבני subendothelial חשופים, וכתוצאה מכך היווצרות פקיק הקודקודית עיקרית (ב '), לאחר מכן, בשנת חסימת כלי טרומבוטיים שלמה (C). דמות זו שונתה מ Grambow 3. פקיק מסומן *. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תרשים איור 4. תזרים מציג את פרוטוקול הניסוי. </ Strong> טיפול הקנבינואידים על ידי הזרקת IP של הקנבינואידים בהתאמה (5/10 מ"ג / ק"ג BW) בוצע 30 דקות לפני IVM הגיוס של היווצרות קריש דם בתוך האוזן הימנית ביום 0. IVM הוגבל 1 h. 47 h מאוחר, ביום 2, באותו פרוטוקול, שהושם על האוזן השמאלית של העכבר לפני דגימה של דם. דמות זו שונתה מ Grambow 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. גיבוש Venular פקיק לאחר טיפול הקנבינואידים יחיד cyclooxygenase בלימה. פעמים ספיגה של venules בעכברים שעברו אינדוקציה פקיק אור / צבע. (א) בעלי חיים טופלו הרכב המכיל DMSO (VEH) או עם anandamide קנבינואידים (AEA), WIN55,212-2 (WIN), או קנבידיול (CBD) (5 מ"ג / ק"ג BW; n = 5). 0.05 מ"ל של 5%-dextran FITC הוזרק IV לפני אינדוקציה פקיק. בהגדרה אחרת, 0.1 מ"ל של 5% FITC-dextran (B) אננדמיד (10 מ"ג / ק"ג BW) שולבה עם אינדומטצין (הודו) (5 מ"ג / ק"ג BW) כדי להעריך את ההשפעה של מוצרים תלויי-cyclooxygenase על היווצרות פקיק ידי אננדמיד (n = 5). Kruskal-Wallis חד סטרי ANOVA על הדרגות בעקבות ניתוח פוסט הוק של דאן (A ו- B). הערכים ניתנים לפי חציון ו IQR (ה 5, 25 th, 75 ה, ו 95 העשירונים ה). * P <0.05 לעומת הרכב, # P <0.05 לעומת אננדמיד, § P <0.05 לעומת אינדומטצין. דמות זו שונתה מ Grambow 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם מספר שלבים קריטיים עבור אינדוקצית פקיק המוצלחת התנוך של עכברי hr SKH1-HR. לפתרון בעיות, את הצעדים המתאימים של הפרוטוקול מסומנים בסוגריים.
תנאי בחינה הם אידיאליים בחיות צעירות בגיל 4 - 6 שבועות עם cornification הנמוכה של האפידרמיס. אצל בעלי חיים מבוגרים, האיכות להדמיה של הכלי גרועה ופחות דומה בשל המרחק הגבוה בין משטח העור וכלי היעד (שלב 1.1).
כדי למנוע extravasation של FITC-dextran בתחום הבחינה, תפרי התיקון חייבים להיות ממוקמים כפי שולי ככל האפשר. בקרבת התפרים, צבע ניאון יכול extravasate ולהפחית את הניגוד בין שטח extravascular וכלי. extravasation זה של הצבע מתקדם לאט. אם התפרים הם תפרו כאמור 15 דקות לפני הזרקה של FITC-dextran, טובתנאי בחינה של מיקרוסקופיה intravital מובטחים (שלב 2.8).
FITC-dextran מסולק לאט renally. השילוב של צבע ניאון עם dextran מולקולרי גבוה (150 KDA) עיכובים extravasation והפרשה. במחקר הנוכחי, הפעם עבור אינדוקצית מיקרוסקופיה פקיק הוגבל 1 h כדי למנוע את ההשפעה של הפרשה וריכוזי פלזמת צבע פלואורסצנטי נמוכים בזמן היווצרות פקיק.
תוך מילוי המזרקים, אין בועות אוויר צריכות להישאר על הזריקה מפני בועות אוויר קטנות אפילו מנוהל IV בתוך המזרק יכולות להיות קטלניות עבור החיה (שלב 2.5). כאשר משייכים המזרק מתוך וריד הצוואר לאחר הזרקת IV, דימום רגיל מתרחש (שלב 2.6). זיהום של האוזן בחן מכן עם דם או FITC-dextran עושה מיקרוסקופיה intravital משמעותית קשה ואף בלתי אפשרי. לפיכך, הכנת האוזן הנגדית ואת וריד צוואר מומלצת.
את coverslip חייב להיות מיושם בזהירות, בלי שום לחץ נוסף (שלב 4.5). אחרת, את זרימת הדם באוזן כולו מואטת עקב הדחיסה של כלי הבסיס, אשר יכול להפחית את זמני החסימה במהלך אינדוקצית פקיק. המיקום המדויק שלניתן לאמת את coverslip עם סטראו. Venules צריך להיות מלא ללא הרף, במיוחד בקצוות של coverslip. את coverslip חייב לשמש כדי להבטיח את הקשר של טיפת מים במטרה מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital. טבילת האדם נדרש לקבל במהלך אינדוקצית פקיק כולו כדי להבטיח את התאורה-EPI של הספינה עם 100% עוצמת אור. הדרך הטובה ביותר להשיג את המיקום היציב של טיפת המים היא באמצעות coverslip. לשים את הירידה על גלישת לחות שקופה מפלסטיק או ישירות על העור גורם בריחת מי הטבילה הפכפכה.
משמעות ומגבלות של התנוך של hr חסר שיער SKH1-HR מאוס
העכבר ללא שיער SKH1-HR HR מאפשר הדמיה תפקודית ישירה של הכלי ב התנוך באמצעות מיקרוסקופיה intravital 2, 4,
כל המודלים האלטרנטיביים של ויזואליזציה intravital מיקרו מחזורי, כגון הלחי של אוגר 11, בתא skinfold הגבי של העכבר 12, 13, או מתחת לשריר Cremaster של עכברוש 9, 10 דורשים הכנה כירורגי. הכלי של האוזן של העכבר ללא שיער נגיש ללא כל סיכון של ניזק לרקמות ידי ניתוח, כך שאין השפעה על הפרמטרים המדידים ידי דלקת, כיווץ כלי דם, והפעלה של המוסטאסיס ב התנוך של העכבר ללא שיער 14. למרות שאין הכנה כירורגית יש צורך, את רזולוציית התמונה והבהירה דומות לדגמים אחרים (למשל, תא skinfold גב והכנת Cremaster). על מנת להשיג איכות גבוהה הדמיה, הפרוטוקול חייב להיות מלווה באופן יסודי, ועל עכברים צעירים עם פחות cornification של tהוא הדרמיס צריך לשמש.
בשל הלוקליזציה השטחית שלהם, הכלי של האוזן ניתן ללמוד בקלות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital. הם מאפשרים thermoregulation ב החיה דרך הסתגלותם של קוטר כלי. לכן, הן בחדר ואת טמפרטורת הגוף צריך להיות אחיד כדי להשיג תוצאות לשחזור. כל כלי התנוך מייצגים כלי היקפי ברקמת עורי. בהשוואה לכלי מרכזי, כלי הפריפריה מאופיינים מבנים היסטולוגית שונים ביטוי הקולטן. לכן, מודלים אחרים (למשל, הכנת venules mesenteric ו arterioles) עשויות להיות סבירות יותר לבחינת סוגיות ספציפיות הנוגעות לכלי מרכזי.
מגבלה נוספת של המודל שתואר היא ההגבלה הקשורים באמצעות עכברי SKH1-HR HR שיער, אשר אינם נפוצות כמו זני עכבר אחרים. לכן, גידול עכברים חסרי שיער מהונדסים יכול להיות עבודהious ויקר. כימיה והסרת שיער מכאנית יכולות לגרום לדלקת מקומית אינו מסירות את שורשי שיער, עלול לפגום באיכות ויזואליזציה. כמו איכות להדמיה טובה ומרחק נמוך בין משטח כלי היעד הוא קריטי עבור אינדוקצית פקיק אמינה; דגמים אחרים (למשל, תא הגב skinfold) של העכבר עשוי להיות מתאימים יותר עבור מחקרים הדורשים זני עכבר מסוימים עם פרווה. מצד שני, המודל תנוך האוזן מאפשר סימולציה של מצבים פתולוגיים שונים. לדוגמא, בזרימת הדם ברקמת perfused האנושות יכולה להיבחן לאחר ליגטורה של שתיים מהשלוש החבילות העצבות וכלי דם 15. ניתוח מיקרו מחזורי במהלך ריפוי הפצע הוא דוגמה נוספת מתאים לשימוש באוזן של המודל העכבר שיער 16.
במשך כמה שאלות ניסיוניות, חשוב לבחון אותה החיה בנקודות זמן שונות כדי Assess את רצף הזמן של טיפול. במחקר ניסיוני שפורסם לאחרונה, אינדוקציה פקיק באוזן השמאלית לא שונתה על ידי טיפול מוקדם של באוזן ימין 3. לכן, יתרון נוסף של המודל הוא אפשרות האינדוקציה פקיק בכל אוזן של אותו העכבר בשתי נקודות זמן שונות. בדבר הגנה על בעלי חיים, הליך הניסוי הוא פולשנית עבור בעלי החיים, ואת העכברים לא צריך להתאושש מניתוח או לשאת בתא skinfold הגבה בין הניסויים. בכל בעל חיים, לפחות חמישה כולים מתאימים לכל אוזן ניתן האפילו על ידי אינדוקצית פקיק phototoxic, כך ניתן לאסוף נתונים רבים עם מספר קטן של בעלי חיים.
משמעות ומגבלות של מיקרוסקופיה intravital ו אינדוקציה פקיק
מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital מאפשר הדמיה של זרימת בזמן אמת 5. לאחר מתן IV, FITC-dextran מכתימה את בפלסמת הדם. זה מאפשר תצפית של צמיחה פקיק מתחילת הזירוז עד חסימת כלי שלם. תאי דם לבנים ואדומים ניתן לזהות פערי המדיום ניגודיות. עבור חקירות נוספות (למשל, אינטראקציות האנדותל גרנולוציט), תאי דם לבנים ניתן מוכתם rhodamin-6G.
ניתוח הקלטת מחובר הניסוי מאפשר מדידת in vivo של מהירות תא דם אדומה, arteriolar vasomotion, צפיפות נימים, ואת קוטר כלי דם. פרמטרים אלה ממלאים תפקיד משמעותי היווצרות פקיק, זלוף דש, וריפוי הפצע. תצפית על ידי מיקרוסקופ intravital יכולה ישירות ורציף לכמת פרמטרים זלוף דינמיים אלה והשינוי שלהם במהלך הניסוי 5. טכניקות אחרות, כמו כשלון קסנון, רמות החמצן לרקמות, דופלר לייזר, או דיפוזיה צבע, הם גם פולשנית, אך הם מוגבלים על ידי tהוא מדידה עקיפה של זרימת דם. זה עשוי להשפיע על תוקפו של תוצאות הניסוי. לכן, שיטות ישירות עדיפות.
התגובה של צבע פלואורסצנטי והאור של תוצאות גל מסוימות שחרורו של מיני חמצן תגובתי, אשר מקומית לפגוע האנדותל 17. שעת האקספוזיציה של חלקיקי דם הרהוטים היא 1,000x פחות בהשוואת האנדותל. לכן, השפעת thrombogenic היא ראשונית עקב נגע אנדותל phototoxic ולא בשל הפעלת טסיות phototoxic ישירה 18. טסיות מופעלים באמצעות מגע למטריצת subendothelial החשוף ויוצרים פקק טסיות 19 (איור 3). מנגנון זה של thrombogenesis ממלא תפקיד מצטיין במצבים רבים, כגון תעוקת לב בלתי יציבה השקת כלי דם.
אינדוקצית אור / צבע פקיק היא פחות פולשנית מאשר altשיטות ernative של יצירת נגעים האנדותל באמצעות בלון קטטר 20, זרם חשמלי 21, לייזר 22, או דלקת 19. אינדוקציה פקיק עם / צבע האור גם פועל אך ורק מקומית אלומת האור של אובייקטיביות. לכן, כלי שכנות אינם מושפעים ישירות והוא יכול לשמש לזירוז פקיק הבא. אינדוקציה אור / צבע פקיק יכול להתבצע בשתי venules ו arterioles. במחקר הנוכחי, venules טופלו באופן בלעדי כי EPI-הארה של arterioles יכול לגרום vasospasm, אשר עלול להשפיע על חסימת פעמים 19.
ההרדמה בוצעה באמצעות השילוב של xylazine ו קטמין, אשר הוקם בשנת רפואת וטרינרית ניסיוני. התרופות הוזרקו IP. עם המינון הנ"ל, הרדמה מספיק עם סובלנות ניתוח למשך 30 דקות ולישון 1.5 - 2 h הושגה.
האוזן של עכבר SKH1-HR HR שיער מעוגנת היטב ריפוי פצע מחקר דש. מספר מחקרים השתמשו במודל בהצלחה לזירוז פקיק ו thrombolysis 3, 23, 24, 25, 26. אם הפרוטוקול מבוצע כראוי, מיקרוסקופיה intravital ב התנוך של עכבר hr SKH1-HR השיער היא כלי אמין, קל, ויעיל עבור חקר ההיווצרות בזרימת דם פקיק. זה פשוט כדי לדמות מצבים פתולוגיים שונים, ואילו המודל מציע אוירה ניסיוני מצוין להעריך פרמטרים מכריעים מיקרו מחזורי in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Acknowledgments
יש המחברים שום תודות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SKH-1/hr mice | Charles River | 477 | can be purchased from other vendors |
| standard laboratory food | ssniff Spezialdiaeten | V1594-0 | can be purchased from other vendors |
| operation stereomicroscope | Leica | M651/M655 | can be purchased from other vendors |
| intravital microscope | Zeiss | Axiotech Vario 100 | can be purchased from other vendors |
| objective (20X/0.95) | Zeiss | 20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR | can be purchased from other vendors |
| objective (63X/0.95) | Zeiss | 63x/0,95 W; ACHROPLAN | can be purchased from other vendors |
| black and white CCD-camera | Pieper | FK 6990 IQ-S | can be purchased from other vendors |
| DVD-recorder | Panasonic | DMR-EX99V | can be purchased from other vendors |
| sodium chloride | Braun | 5/12612055/1011 | can be purchased from other vendors |
| Ketamine 10% | Bela pharm | F3901-6 | can be purchased from other vendors |
| Xylazine 2% | Bayer | 6293841.00.00 | can be purchased from other vendors |
| FITC-dextran 5% | Sigma | 46945-100MG-F | can be purchased from other vendors |
| dexapanthenol 5% eye ointment | Bayer | 6029009.00.00 | can be purchased from other vendors |
| formaldehyde 4% | Sigma | HT501128-4L | can be purchased from other vendors |
| DMSO | Sigma | 472301 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 5 x 5 x 1 mm | Menzel | L4339 | can be purchased from other vendors |
| Adhesive strips | Leukosilk | 4683400 | can be purchased from other vendors |
| centrifuge | Beckman Coulter | CLGS 15 | can be purchased from other vendors |
| hematology analyzer | Sysmex | KX-21 A6980 | can be purchased from other vendors |
| EDTA-blood tube | Sarstedt | 201,341 | can be purchased from other vendors |
| cotton swabs | Sanyo | 604-A-1 | can be purchased from other vendors |
| infrared light | Beurer | 5/13855 | can be purchased from other vendors |
| single use synringe | Braun | 2020-08 | can be purchased from other vendors |
| insulin syringe | Braun | 9161502 | can be purchased from other vendors |
| disposable hypodermic needles | Braun | 465 7640 | can be purchased from other vendors |
| end-to-end capillary | Sarstedt | 19,447 | can be purchased from other vendors |
| heating plate | Klaus Effenberg | OP-T 185/03 | can be purchased from other vendors |
| scissors 14.5 cm | Aesculap | BC259R | can be purchased from other vendors |
| needle Holder | Aesculap | BM081R | can be purchased from other vendors |
| microforceps | Aesculap | BD331R | can be purchased from other vendors |
| microscissors | Aesculap | OC496R | can be purchased from other vendors |
| scalpel 21 | Dahlhausen | 11.000.00.511 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 7-0 | Ethicon | XNEH7470 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 6-0 | Ethicon | XN8706.P33 | can be purchased from other vendors |
| electrocautery | Servoprax | H40140 | can be purchased from other vendors |
| acrylglass pad | integrated heating, 0.5 cm high plane |
References
- White, R. H. The epidemiology of venous thromboembolism. Circulation. 107 (23), I4-I18 (2003).
- Benavides, F., Oberyszyn, T. M., VanBuskirk, A. M., Reeve, V. E., Kusewitt, D. F. The hairless mouse in skin research. J Dermatol Sci. 53 (1), 10-18 (2009).
- Grambow, E., Strüder, D., Klar, E., Hinz, B., Vollmar, B. Differential effects of endogenous, phyto and synthetic cannabinoids on thrombogenesis and platelet activity. Biofactors. , (2016).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvasc Res. 19 (3), 374-379 (1980).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plast Reconstr Surg. 83 (6), 948-959 (1989).
- Goertz, O., et al. Evaluation of a novel polihexanide-preserved wound covering gel on dermal wound healing. Eur Surg Res. 44 (1), 23-29 (2010).
- Goertz, O., et al. Determination of microcirculatory changes and angiogenesis in a model of frostbite injury in vivo. J Surg Res. 168 (1), 155-161 (2011).
- Roesken, F., et al. A new model for quantitative in vivo microscopic analysis of thrombus formation and vascular recanalisation: the ear of the hairless (hr/hr) mouse. Thromb Haemost. 78 (5), 1408-1414 (1997).
- Sorg, H., et al. Antithrombin is as effective as heparin and hirudin to prevent formation of microvascular thrombosis in a murine model. Thromb Haemos. 96 (3), 371-377 (2006).
- Sorg, H., et al. Efficacy of antithrombin in the prevention of microvascular thrombosis during endotoxemia: an intravital microscopic study. Thromb Res. 121 (2), 241-248 (2007).
- Kovács, I. B., Sebes, A., Trombitás, K., Csalay, L., Görög, P. Proceedings: Improved technique to produce endothelial injury by laser beam without direct damage of blood cells. Thromb Diath Haemorrh. 34 (1), 331 (1975).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. Eur Cell Mat. 20 (22), 147-167 (2011).
- Grambow, E., et al. Effect of the hydrogen sulfide donor GYY4137 on platelet activation and microvascular thrombus formation in mice. Platelets. 25 (3), 166-174 (2014).
- Fiebig, E., Ley, K., Arfors, K. E. Rapid leukocyte accumulation by spontaneous rolling and adhesion in the exteriorized rabbit mesentery. Int J Microcirc Clin Exp. 10 (2), 127-144 (1991).
- Harder, Y., et al. Gender-specific ischemic tissue tolerance in critically perfused skin. Langenbecks. Arch Surg. 395 (1), 33-40 (2010).
- Langer, S., et al. Effect of polyvinylpyrrolidone-iodine liposomal hydrogel on wound microcirculation in SKH1-hr hairless mice. Eur Surg Res. 38 (1), 27-34 (2006).
- Saniabadi, A. R., Umemura, K., Matsumoto, N., Sakuma, S., Nakashima, M. Vessel wall injury and arterial thrombosis induced by a photochemical reaction. Thromb Haemost. 73 (5), 868-872 (1995).
- Herrmann, K. S., et al. Platelet aggregation induced in the hamster cheek pouch by a photochemical process with excited fluorescein isothiocyanate-dextran. Microvasc Res. 26 (2), 238-249 (1983).
- Rumbaut, R. E., Slaff, D. W., Burns, A. R. Microvascular thrombosis models in venules and arterioles in vivo. Microcirculation. 12 (3), 259-274 (2005).
- Lee, W. M., Lee, K. T. Advanced coronary atherosclerosis in swine produced by combination of balloon-catheter injury and cholesterol feeding. Exp Mol Pathol. 23 (3), 491-499 (1975).
- Callahan, A. B., Lutz, B. R., Fulton, G. P., Degelman, J. Smooth muscle and thrombus thresholds to unipolar stimulation of small blood vessels. Angiology. 11, 35-39 (1960).
- Rosen, E. D., et al. Laser-induced noninvasive vascular injury models in mice generate platelet- and coagulation-dependent thrombi. Am J Pathol. 158 (5), 1613-1622 (2001).
- Agero, U., et al. Effect of mutalysin II on vascular recanalization after thrombosis induction in the ear of the hairless mice model. Toxicon. 50 (5), 698-706 (2007).
- Menger, M. D., Rösken, M., Rücker, M., Seiffge, D., Vollmar, B. Antithrombotic and thrombolytic effectiveness of rhirudin in microvessels. Langenbecks Arch Chir. 115 (1), 19-20 (1998).
- Bilheiro, R. P., et al. The thrombolytic action of a proteolytic fraction (P1G10) from Carica candamarcensis. Thromb Res. 131 (4), 175-182 (2013).
- Kram, L., Grambow, E., Mueller-Graf, F., Sorg, H., Vollmar, B. The anti-thrombotic effect of hydrogen sulfide is partly mediated by an upregulation of nitric oxide synthases. Thromb Res. 132 (2), 112-117 (2013).
