Introduction
La creciente importancia de la formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) en el diagnóstico clínico, que está limitado por la sensibilidad inherente de la técnica, ha dado como resultado el rápido crecimiento de la investigación en el desarrollo de nuevos agentes de contraste a base de gadolinio (GBCAs) 1. GBCAs son moléculas que se administran para mejorar la calidad de la imagen, y por lo general tienen la estructura química de un ion trivalente de gadolinio (Gd 3+) coordinado a un ligando polidentado. Esta formación de complejos es de importancia crítica que no quelado Gd 3+ es tóxico; se ha implicado en el desarrollo de fibrosis sistémica nefrogénica en algunos pacientes con enfermedad renal o insuficiencia 2. En consecuencia, la detección del ion libre acuosa es fundamental para garantizar la seguridad de GBCAs. La presencia de no quelado Gd 3+ en soluciones GBCA a menudo es el resultado de una reacción incompleta entre el ligando y el de iones, la disociación del complejo, o displacement por otros cationes metálicos biológicos 3.
Entre las diversas técnicas que actualmente se utilizan para determinar la presencia de Di-s 3+, aquellos que dependen de cromatografía y / o rango más alto espectrometría en términos de versatilidad y aplicabilidad 4. Entre sus puntos fuertes son de alta sensibilidad y precisión, la capacidad de analizar diversas matrices de muestra (incluyendo suero humano 5, la orina y el pelo 6, aguas residuales 7, y formulaciones de agentes de contraste 8), y la cuantificación simultánea de múltiples complejos de Gd + 3 (un listado de los estudios anteriores a 2013 se describe en una revisión exhaustiva por Telgmann et al.) 4. El único inconveniente es que varios de estos métodos requieren instrumentaciones (como la espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente) 4 que algunos laboratorios no pueden tener acceso a. En el contexto de descubrimiento novedoso GBCA en la investigación y los niveles de prueba de concepto, arbasado en el método espectroscópico elatively más conveniente, rápida y rentable (tales como absorción UV-Vis o fluorescencia) puede servir como una alternativa valiosa. Con estas aplicaciones en mente, un sensor basado en aptámero fluorescente para acuosa Gd 3 + 9 fue desarrollado.
El aptámero (Gd-aptámero) es una larga molécula de ADN de una sola hebra 44-base con una secuencia específica de bases que se aisló a través del proceso de evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) 9. Para adaptar el aptámero en un sensor fluorescente, un fluoróforo está unido al terminal 5 'de la hebra, que después se hibridó con una hebra de temple (QS) a través de 13 bases complementarias (Figura 1). El QS está marcado con una molécula extintor oscuro en el extremo 3 '. En ausencia de Gd 3 +, el sensor (Gd-sensor), compuesto por una relación molar 1: 2 de Gd-aptámero y QS, respectivamente, tendrán mínima emisión de fluorescencia debido to transferencia de energía desde el fluoróforo al extintor. La adición de acuoso Gd 3+ desplazará al QS del Gd-aptámero, resultando en un aumento de la emisión de fluorescencia.
La Figura 1. El sensor (Gd-sensor) que consiste en el largo aptámero 44-base (Gd-aptámero) etiquetadas con fluoresceína (un fluoróforo) y el filamento 13-base largo de temple (QS) etiquetadas con DABCYL (un extintor oscuro) . En ausencia de no quelado Gd 3+, la fluorescencia del sensor es mínimo. Con la adición de Gd 3+, el desplazamiento de la QS se produce y se observa un aumento en la emisión de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Hay en la actualidad, un método basado en la espectroscopia de uso general para detectaring 3+ acuosa Di-s. Este ensayo utiliza el anaranjado de xilenol molécula, que se somete a un cambio en la longitud de onda de absorción máxima 433 a 573 nm sobre la quelación con el ion 10. La relación de estos máximos dos absorbancia se puede utilizar para cuantificar la cantidad de no quelado Gd 3+. El sensor de aptámero es una alternativa (también puede ser complementaria) con el ensayo de naranja de xilenol, como los dos métodos tienen diferentes condiciones de reacción (tales como el pH y la composición de las soluciones tampón se utiliza), selectividades de destino, los rangos lineales de cuantificación, y las modalidades de detección 9.
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Protocol
NOTA: agua de calidad de biología molecular se utiliza en todas las preparaciones de tampón y de solución. Todos los tubos de microcentrífuga desechables (y PCR) y puntas de pipeta son DNasa y RNasa libre. Por favor consulte la hoja de datos de seguridad del material (MSDS) para todos los productos químicos antes de su uso. Se recomienda el uso de equipo de protección personal (EPP) apropiado.
1. Preparación de los aptámeros de archivo Soluciones
- Compra 2 hebras de polidesoxinucleótido comercialmente. Ordenar ambas cadenas con la purificación mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
MODALIDAD 1 (Gd-aptámero):
5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
Capítulo 2 (QS):
5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 ' - Disolver cada hebra en agua para hacer 100 mM de soluciones madre individuales del Gd-aptámero y el QS.
- Almacenar estas soluciones a -20 ° C. Las soluciones son estables hasta la fecha, durante 3 años.
- Para minimizar Freezciclos de e-descongelación, almacenar las soluciones madre en 10 alícuotas.
2. Preparación de la 2x Gd-sensor Solution
- Preparar el tampón de ensayo (HEPES 20 mM, 2 mM MgCl2, NaCl 150 mM, KCl 5 mM). Ajustar el pH a ~ 7,4 con NaOH y HCl, y filtrar a través de filtros estériles desechables botella superiores a los 0,2 micras membrana de PES. Almacenar en frascos estériles. Si se filtra y se almacena adecuadamente (a temperatura ambiente), el tampón es estable hasta el momento, por 2 años.
- Diluir 1 l de la solución de Gd-aptámero de la (del paso 1.2) y 2 l de la solución madre de QS (de la etapa 1.2) en 497 l de tampón de ensayo. Mezclar bien usando un vórtice. Sus concentraciones en la solución de Gd-sensor 2x son 200 nM y 400 nM, respectivamente.
Nota: El volumen de la solución de Gd-sensor 2x preparado en este paso es de 500 l, que es suficiente para poner a prueba 6 - 7 concentraciones variables de Gd 3+ para la curva de calibración y las soluciones de agentes de contraste(paso 3). Cada muestra dará a pocillos duplicados de una placa de 384 pocillos.- Ajustar el volumen de la solución de Gd-sensor 2x de acuerdo con el número de soluciones de Gd 3+ que tiene que ser probado.
- Transferir la solución de Gd-sensor de 2x en 9 tubos de PCR, con 50 l en cada tubo. Colocar los tubos en un termociclador.
- Ajuste el programa en el ciclador térmico para calentar la solución en los tubos a 95 ° C, mantener durante 5 min, y luego enfriar lentamente las soluciones a 25 ° C durante ~ 15 min (a razón de ~ 0,05-0,1 ° C / s). El ciclo de calentamiento y enfriamiento es asegurar la hibridación óptima entre el Di-s-aptámero y el QS. resultados de la hibridación parciales en temple incompleta y un fondo más alta de fluorescencia del sensor. Si un termociclador no está disponible, llevar a cabo este procedimiento utilizando un baño de agua caliente en su lugar.
- Una vez enfriado a 25 ° C, utilizar inmediatamente la solución, o mantener en el termociclador (hasta alrededor de 2 h) hasta que esté listo para serusado. Cuando se utiliza un baño de agua para el calentamiento, dejar los tubos en el baño como el agua se enfría lentamente a temperatura ambiente.
3. La construcción de la curva de calibración de fluorescencia y detectar la presencia de no quelado Gd 3+ en una solución de agente de contraste Gd
- Disolver GdCl 3 sólido en el tampón de ensayo (el mismo tampón que en el paso 2.1).
- A través de dilución en serie, preparar 100 l cada uno de 6 diferentes soluciones Gd 3+ en tubos de microcentrífuga a doble de las concentraciones finales deseadas para la curva de calibración (2x soluciones).
- Por ejemplo, para construir una calibración para 0 (sólo tampón sin GdCl 3), 50, 100, 200, 400, y 800 nM de Gd 3+, preparar soluciones que contienen 0, 100, 200, 400, 800, y 1600 nM del ión. Asegúrese de que siempre incluyen el "blanco" con 0 nM Gd 3 + como control negativo.
- Se disuelve el agente de contraste para ser pruebaed en el tampón de ensayo. Preparar 2 o 3 concentraciones diferentes de las soluciones de agentes de contraste a través de dilución en serie.
NOTA: Prueba de 3 concentraciones diferentes de la solución de agente de contraste se recomienda. Esto es para asegurar que estas concentraciones están dentro del rango lineal. Si las muestras analizadas no muestran una relación lineal, reducen las concentraciones del agente de contraste utilizado. - Tomar los tubos de PCR que contienen la solución 2x Di-s-sensor desde el paso 2.5 del termociclador.
- Añadir 50 l de cada solución de Gd 3+ desde el paso 3.2 en 6 de los 9 tubos de PCR que contienen la solución 2x Di-s-sensor. Mezclar pipeteando arriba y abajo. Cada tubo de PCR contiene ahora la concentración deseada de Gd 3+ a ensayar, 100 nM Gd-aptámero, y 200 QS nm.
- Para los tubos de PCR restantes que contienen la solución de Gd-sensor de 2x, se añaden 50 l de las soluciones de agentes de contraste desde el paso 3.3. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo varias veces.
- Se incuban las soluciones en los tubos de PCR para alrededor de 5 min a temperatura ambiente. Pueden dejarse reposar durante hasta 30 minutos.
- Transferir 45 l de cada tubo en una placa de 384 pocillos. Cada tubo de PCR dará pocillos duplicados.
- Registrar la fluorescencia de cada pocillo en un lector de placas. El fluoróforo (FAM) utilizado en el diseño de Gd-sensor tiene máximos de excitación y emisión de 495 y 520 nm, respectivamente, como se indica en el sitio web del proveedor. Elija longitudes de onda de excitación y emisión apropiados o filtros en función de si el lector de placas es monochromator- o basado en filtro.
- Trazar la gráfica de la fluorescencia en unidades arbitrarias de fluorescencia (AFU) frente a la concentración de Gd 3+.
- Hacer el gráfico como factor de cambio de fluorescencia frente a la concentración de Gd 3+. Calcular el factor de cambio de fluorescencia dividiendo el AFU de cada concentración por el AFU de la solución "en blanco" (con 0 nM de Gd 3+). El pliegue del cambio de fluorescencia permitirá la normalization de los resultados, en caso de que la pantalla AFU algunos periódica (diferentes días, etc.) variaciones.
- Comparación de la emisión de fluorescencia de la solución que contiene el agente de contraste y el "en blanco", que es la solución que contiene 0 nM GdCl 3 (sólo tampón).
NOTA: una mayor fluorescencia de la solución GBCA implica la presencia de no quelado Gd 3+, que pueden requerir una purificación adicional del agente de contraste. La cantidad de presente no quelado Gd 3+ se puede estimar utilizando la curva de calibración construida en el paso 3.10 o 3.11.
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Representative Results
Un cambio de fluorescencia típico de la solución de Gd-sensor en presencia de no quelado Gd 3+ se muestra en la Figura 2. La emisión puede ser trazado como el pliegue del cambio de fluorescencia (Figura 2A) o de la lectura de fluorescencia en bruto (Figura 2B) en unidades arbitrarias (AFU). Ambas parcelas producen curvas de calibración muy similares con un rango lineal para las concentraciones de Gd 3+ por debajo de 1 M y la saturación de la señal en> 3 M. El límite de detección es de ~ 100 nM con una relación señal a ruido de 3.
En soluciones que contienen el GBCA de interés, la presencia de Di-s no quelado 3+ se traducirá en un aumento de la fluorescencia del sensor cuando se compara con la solución "en blanco". Los cambios de fluorescencia en soluciones de 2 lotes diferentes de complejo de Gd-DOTA, uno de pureza mayor que el otro, son espectáculon como ejemplos de resultados representativos (Figura 3). Gd-DOTA (ácido gadotérico) es un complejo de gadolinio de Gd 3+ rodeado por un DOTA ligando orgánico que se encuentra en un agente de contraste comercial. El lote de mayor pureza no muestra un aumento significativo en la emisión de hasta 20 mM de Gd-DOTA. Cuando no quelado Gd 3 + está presente, se observa un cambio que se nota incluso en concentraciones Gd-DOTA debajo de 5 mM. En este ejemplo en el que los puntos de datos se representan como veces el cambio de fluorescencia del sensor, la cuantificación de la cantidad de no quelado Gd 3+ se puede estimar utilizando la curva de calibración en la Figura 2A.
Figura 2. El representante de fluorescencia Di-s-sensor de parcelas curva de calibración. Todos los puntos de datos se realizaron al menos por duplicado y el promedio de los valores de parcelaTed con la desviación estándar como las barras de error. (A) una curva de calibración obtenida usando 100 nM Gd-aptámero y 200 QS nm. En el gráfico se representa con el pliegue del cambio de fluorescencia como el eje y. (B) La misma curva de calibración como en (A) con la fluorescencia sin procesar en unidades arbitrarias (AFU) como el eje y. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Representante cambio de fluorescencia Di-s-sensor cuando se prueba la presencia de Di-s no quelado 3+ en muestras de molécula de Gd-DOTA. Dos lotes diferentes de soluciones de complejo de Gd-DOTA se muestran en este diagrama, una de mayor pureza (círculo marcador) y el otro que contiene Gd no quelado 3+ (triangl azule marcador). Cada punto de datos es un promedio de dos lecturas con desviación estándar como las barras de error. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Usando el Gd-sensor basado en aptámero, un aumento en la emisión de fluorescencia que es proporcional a la concentración de Gd no quelado 3+ se observa. Para minimizar la cantidad de muestra utilizada, el ensayo se puede ejecutar en una microplaca de 384 pocillos con un volumen total de la muestra de 45 l por pocillo. En este diseño, la elección de fluoresceína (FAM) y DABCYL (Dab) se basa principalmente en el coste de los reactivos; para modificar la longitud de onda de emisión, una pareja diferente de fluoróforo y el extintor se pueden utilizar 11.
Es importante señalar que para obtener el mejor resultado con el sensor, uno de los pasos críticos es el calentamiento a 95 ° C y enfriamiento lento (etapa 2.4) en el tampón de ensayo para conseguir la hibridación óptima entre el Gd-aptámero y la QS hebras. Como se ha mencionado previamente en el protocolo, si un ciclador térmico no está disponible, la incubación a 95 ° C se puede llevar a cabo en un baño de agua. Otro parámetro clave para controlar es tque las composiciones de las soluciones tampón; Se recomienda el uso del tampón de ensayo que aparece en el paso 2.1 para disolver el agente de contraste, o agua desionizada también puede ser utilizado. Sin embargo, las soluciones que contienen interferentes potenciales deben ser evitados. Un ejemplo de un tampón tal es uno que contiene aniones fosfato, que se pueden coordinar a no quelado Gd 3+ para formar fosfato de gadolinio insoluble 12. El precipitado no reaccionará con el sensor, lo que resulta en un resultado falso negativo.
A pocos pasos de los experimentos pueden ser modificados sin afectar el resultado. En primer lugar, para simplificar el ensayo y el cálculo, preparar tanto la solución de Gd-sensor y el GdCl acuosa 3 para la curva de calibración a concentraciones 2x. Si se desea, otros factores de dilución se pueden utilizar (por ejemplo, soluciones 10x), siempre que las concentraciones de ensayo finales del Di-s-aptámero y el QS se mantienen a 100 nm y 200 nm, respectivamente. En segundo lugar, el ensayo de tampón Does no tiene que ser exactamente pH 7,4. Cualquier valor entre 7-7,4 producirá el aumento de fluorescencia deseada, siempre y cuando el mismo tampón se utiliza durante todo el experimento. En tercer lugar, una vez que se obtiene la lectura de emisión de fluorescencia, los puntos de datos pueden ser representados ya sea como fluorescencia prima en unidad arbitraria (AFU) o como factor de cambio de fluorescencia. Para calcular el factor de cambio de la fluorescencia, la lectura de fluorescencia en bruto de cada concentración se normalizó a (dividido por) la lectura del control negativo (0 nM Gd 3+). Como se muestra en las Figuras 2A y B, las tendencias de las emisiones de fluorescencia en ambas parcelas son casi idénticos. El factor de cambio puede ser una manera más conveniente para analizar los datos si el lector de placas de muestra algunas variaciones en las lecturas primas registradas en diferentes momentos. Finalmente, si el laboratorio está equipado con un fluorómetro, pero no un lector de placas, cada punto de datos se puede medir usando una cubeta, en lugar de una microplaca. Dependiendo del tamaño of las cubetas disponibles, los volúmenes de las soluciones preparadas en el ensayo pueden necesitar ser ajustado.
El método descrito en este documento ofrece una alternativa a chromatographic- y / o técnicas basadas en la espectrometría para la detección acuosa Gd 3+. En comparación con este último, el ensayo de Gd-sensor es más limitado en términos de sensibilidad, la precisión, y la capacidad para la detección simultánea de múltiples especies. Por otro lado, el sensor basado en espectroscópico requiere una instrumentación que puede posiblemente ser más fácilmente disponible, se puede realizar dentro de un período de tiempo más corto, y la preparación de la muestra es mínima. El agente de contraste puede ser simplemente disuelto en la solución tampón, se mezcla con la solución de Gd-sensor, y la emisión de fluorescencia medido directamente. Además, el sensor es capaz de detectar una concentración mucho más baja de no quelado Gd 3+ que el indicador naranja de xilenol (alrededor de 2 órdenes de magnitud de diferencia entre los dos métodos) y tiene unamayor selectividad para Gd 3+ largo de varios otros iones metálicos biológicamente importantes y de transición 9.
Hay dos desventajas de este ensayo que pueden restringir su uso en algunas condiciones experimentales. Una limitación es que el sensor no es específico para Gd 3+; que muestra una respuesta a otros iones lantánidos (tales como Eu 3+ y Tb 3+) 9. Sin embargo, estos no son los iones que se encuentran comúnmente en agentes de contraste o los sistemas biológicos y, por tanto, su interferencia son mínimos. El segundo punto a destacar es que se observa a concentraciones más altas (por encima de ~ 10 M) de Gd 3+, una disminución gradual de la emisión de fluorescencia Di-s-sensor. El efecto de enfriamiento por los iones de lantánido es un fenómeno bien documentado 13 que también se ha utilizado como una técnica para la detección y cuantificación de ellos 14. Mientras que esto limita la utilidad del sensor para la medición de altas concentraciones de Gd 3+
En este trabajo, se ha descrito el uso de una técnica basada en la fluorescencia para la detección conveniente tóxico no quelado Gd 3+ en solución acuosa. Este ensayo es para la evaluación en fase inicial de agente de contraste a base de gadolinio pureza, específicamente durante la síntesis y formulación para experimentos in vitro. Con el crecimiento actual de la resonancia magnética en el diagnóstico, un número creciente de nuevos agentes de contraste continuamente se están diseñado y probado. El Gd-sensor basado en aptámero facilitará este desarrollo, proporcionando un medio para detectar rápidamente la presencia de concentraciones sub-micromolar de que no ha reaccionado o disociado Gd 3+ en solución acuosa a pH ambiente. Además, como el sensor muestra reactividad cruzada con otros iones lantánidos trivalentes, su aplicación puede serextendido a estas áreas de investigación.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gd-aptamer | IDTDNA | Input sequence and fluorophore modification in the order form | A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
| Quenching strand | IDTDNA | Input sequence and quencher modification in the order form | A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
| Molecular biology grade water | No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well | ||
| Gadolinium(III) chloride anhydrous | Strem | 936416 | Toxic |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Magnesium chloride anhydrous | MP Biomedicals | 0520984480 - 100 g | |
| Sodium Chloride | Acros Organics | 327300025 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P333-500 | |
| Sodium hydroxide, pellets | Fisher Scientific | BP359 | Corrosive |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Toxic and corrosive |
| 384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates | Corning | 3575 | Plates which are suitable for fluorescence reading are required. |
| Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter | Thermo Scientific | 5680020 | The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane |
| Disposable sterile bottles 250 mL | Corning | 430281 | A larger or smaller bottle may be used |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| 0.2 mL PCR tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| Micropipets | No specific manufacturer | ||
| Pipet tips (non filter) of appropriate sizes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| Equipment | |||
| Plate reader | Biotek Synergy H1 | Plate readers from other manufacturers would work equally well |
References
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