Introduction
肺は、外部環境と連続的に接触している、高度に疾患を引き起こす能力を有する無害な粒子および微生物の両方にさらされています。したがって、侵入する病原体に対する強力な免疫応答をマウントする免疫システムにとって重要であるが、病気を引き起こさない吸入抗原に対する寛容を維持することも同様に重要です。強力な免疫監視機構を提供するために、呼吸器系は、樹状細胞（DC）を含む免疫細胞のネットワークが並んでいます。 DCは、ナイーブT細胞を活性化する固有の能力を有するプロフェッショナル抗原提示細胞です。ヒトの肺において、常駐DCを抗原と、処理が発生し、T細胞を1、2、3に提示および活性化のために肺流入領域リンパ節に輸送します。
ヒト免疫系では、DCはdistinで、複数のサブセットに分割することができCTが、重複する機能：CD1c +およびCD141 +骨髄性樹状細胞（MDCの）とCD123 +形質樹状細胞（PDCに）4、5。ヒトDC上で最も詳細な知識は、血液中の研究に由来するが、人間の肺はまた、T細胞刺激能6、7、8、9でDCサブセットの希少集団を保有することは現在明らかです。しかし、蓄積したデータは、DCなどの免疫細胞は、その解剖学的位置10に応じてその頻度、表現型、および機能が異なることを示しています。したがって、局所免疫と寛容への貢献を理解するために、関連する組織から免疫細胞を研究することが重要です。まとめると、これは、血液DCは、より容易に入手可能であり、アクセス可能であるにもかかわらず、肺疾患に対処するとき、肺常駐DCを検討する必要性を強調します人間インチ
ヒトにおける肺常駐DCを調べた最初の研究は、主に免疫組織化学11、12、13を用いて組織切片において、形態や、HLA-DRおよびCD11cのような単一のマーカーの発現に依存していました。対照的に、典型的には、フローサイトメトリーに依存していたより最近の研究は、異なる免疫細胞サブセットを研究するために分析します。それは一意に特定のDCサブセットを識別する単一細胞表面マーカーを見出すことは困難であるので、わずか4色フローサイトメトリーを適用した研究の潜在的な制限は、DCと同様の表現型マーカーを有する細胞集団を含む、危険です。例えば、CD11cのすべての骨髄性DCおよび単球の大半で発現されます。一方、より高度なフローサイトメトリーパネルを適用する研究において、患者の外科的切除からの非癌性肺組織は、典型的に使用されました外部参照"> 10、14、15、16、これらの稀な集団が真に健康な被験者でのDCの存在の代表的なものであるかどうかは不明ですが。全体的には、研究は主として外科的に除去または全ヒト肺組織が不足しているという事実に制限されています。
これらの制限のいくつかを克服するために、この作品は空間分布と気管支鏡検査を受ける健康なボランティアから得た粘膜気管支生検におけるDCの表現型の識別の詳細な分析を実行する方法について説明します。いくつかの小さな生検を、各個体から採取することができ、その後、免疫組織化学を使用して切片化し、分析のために埋め込まれた、または酵素的に高度なフローサイトメトリー分析のために消化することができます。 bronchoscopiesから得られた気管支生検の形で肺組織を使用して、STを実行することを可能にするという利点を与えますUDYは、健康なボランティアに、肺の開放手術とは異なり、明らかな理由のために、胸部外科手術を必要とする患者に限定されている、ということ。さらに、健康なボランティアの気管支鏡検査の間にサンプリングされた組織は、肺疾患を有する患者における肺組織の非患部とは対照的に、生理的に正常です。一方、生検が小さく、いくつかの生検をプールさえ取得細胞の数は、実行することができる分析のタイプを制限します。
本研究は、樹状細胞に焦点を当てているが、記載された方法は、直接人間の粘膜肺組織に存在する関心のある他の（免疫）細胞を含むように拡張することができます。さらに、プロトコルはまた、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、サルコイドーシス、または肺癌のような気管支鏡検査は、診断を確立するための部分である肺疾患、に罹患した患者から得られた試料に直接適用可能です。
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Protocol
注：この研究は、ウメオ、スウェーデンの地方倫理委員会によって承認されました。
ヒト対象から採取気管支生検1.気管支鏡検査
- すべての参加者からインフォームドコンセントを取得します。
- 気管支鏡検査の前に経口ミダゾラム（4-8 mg）を静脈内グリコピロニウム（0.2から04 mg）を30分で対象を治療。喉頭および気管支におけるリドカインで局所麻酔を適用します。リドカインの〜3ミリリットル4パーセントで、被写体のうがいをしましょうと舌ベースにし、喉頭の注射器を経由して喉頭に3ミリリットルを適用します。リドカインスプレーの8-10用量で局所麻酔を最適化します。件名座ってこの手順を実行します。
- 仰臥位の対象とプラスチック製のマウスピースを介して口から柔軟なビデオ気管支鏡を挿入します。気管支鏡を介した遠位気管や気管支の局所麻酔を完了するために、目的製スプレーカテーテルを使用してください。ここで、約の用量を使用しますリドカイン5〜10mlの2％。
- 有窓鉗子（ 図1）を使用して6-9メイン竜骨から気管支粘膜生検および主気管支部門を取ります。気管支鏡検査の後、病院を出る前に、2〜4時間、対象の残りの部分を聞かせ軽い食事で彼/彼女を提供しています。
2.グリコールメチルアクリレート（GMA）樹脂で生検を埋め込みます
注：GMA免疫染色プロトコルは、もともとサウサンプトン大学、組織化学研究ユニット17で開発されました。
- 固定：免疫組織化学のために、鉗子から生検を除去し、氷冷脱水アセトンおよびプロテアーゼ阻害剤の3ミリリットル（フッ化フェニルメチルスルホニル（35ミリグラム/ 100ミリリットルのアセトン）を含有するガラスバイアルに直接それらを配置し、ヨードアセトアミド（370ミリグラム/ 100ミリリットルのアセトン））。 -20°C（ 図2）で一晩組織を修正しました。
注：次の手順はperfoする必要があります適切なニトリル手袋付きドラフト内rmed。埋め込みキットは増感、刺激、および/またはアレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性がありますコンポーネントが含まれています。すべての廃棄物は危険廃棄物として廃棄されなければなりません。 - 脱水：阻害剤を用いてアセトンを除去し、室温（RT）で15分間（阻害剤なし）新鮮な脱水アセトンと交換します。アセトンを除去し、15分間安息香酸メチルと交換してください。
- 浸潤：グリコールメタクリレートモノマー中の5％のメチル安息香酸溶液の処理液を準備します。 10mlの1つのバイアルに十分です。安息香酸メチル溶液をオフにプラスチック製のパスツールピペット、吸引を使用して処理溶液3mlと交換してください。生検および2時間4℃で過剰の処理液をインキュベートし;パスツールピペットで溶液を埋め込むなど、後続のすべての解の変化、のために使用することができます。
- 処理液ごとに2時間（3×2時間のインキュベーション）を交換するので、バイオの総浸潤時間処理溶液中のpsiesは、少なくとも6時間です。生検を識別するために埋め込むカプセルの上端部に紙のラベルを挿入します。
- グリコールメタクリレートモノマーの10ミリリットル中に75mgの過酸化ベンゾイルの埋め込み溶液を調製します。重合反応を開始するために、埋め込み溶液にN、N-ジメチルアニリン、ポリ（エチレンオキシド）、0.25mlの（アクセル）を加えます。処理溶液を除去し、鉗子を使用して、関連する埋め込みカプセルに1生検を置きます。
- ゆっくりとソリューションを埋め込んでトップに埋め込むカプセルに充填し、キャップを閉じます。生検を妨害し、大きな気泡を作成しないでください。樹脂が完全に重合するまで4℃でカプセルをインキュベートします。
- シリカゲルの約5グラムを含む50 mlチューブに-20℃で埋め込まれた生検を保管してください。
GMA-埋め込み気管支生検の3セクショニング
- 顕微鏡スライドコーティング：で顕微鏡スライドを洗います通常のサイクルで食器洗い機。スライドを覆い、空気乾燥させます。
- 蒸留水中の10％ポリ-L-リジン（PLL）溶液の塗布液を調製します。 5分間塗布液中でスライドを水没してから、それらを空気乾燥してみましょう。元の箱で乾燥PLL被覆スライドを保管してください。
- 蒸留水に0.1％Tween 20でシートガラス片を洗ってください。ペーパータオルで70％エタノールとドライでガラスを洗浄します。ナイフメーカーを使用して、ガラスストリップからガラスブレードをカットします。切れ刃が破損またはニックを入れれないことを確実にするために移動を防止容器にブレードを格納します。
- 生検トリミング：カプセルスプリッタで生検カプセルを配置し、炭素鋼、シングルエッジブレードを使用して各辺を削減。 GMA-埋め込まれた生検を削除し、バイスでしっかりとそれを置きます。鋼の刃を使用して、生検周りから過剰なGMAトリム。
- GMAの切片。
- 蒸留水で0.05％アンモニア溶液を準備します。目にガラスナイフや生検を配置電子ミクロトーム。慎重にブレードがブロックの表面に対して平らに載るように、ナイフホルダーと生検ブロックの角度を調整することにより、ブレードで生検ブロックを揃えます。
- 遅い切削速度にミクロトームを用いて2μmの厚さの切片をカットし、転送し、アンモニア水にセクションをfloatに鉗子を使用しています。穏やかな抗原検索を可能にし、セクションの展開、45から90秒間のセクションが浮かんでいます。
- 顕微鏡スライドを持つセクションをピックアップ。すぐにトルイジンブルーで染色することによって、生検組織像を確認してください。
- 50℃にホットプレートセットにスライドを乾燥させ、プラスチック製パスツールピペットを使用してセクションにフィルタトルイジンブルー染色の500μLを適用します。緑色のリングは汚れの端に出現し始めるまで、ホットプレート上でセクションを温め、その後、水で洗い流してください。
- 光学顕微鏡を使用して、生検組織像を確認します。免疫組織化学のために使用されるセクションでは、損傷を受けていないラミナの良い領域を含むべきですなど、いくつかの腺とできるだけ平滑筋と固有とは上皮、。
- セクション3.4.2のように、良好な組織像を持つセクションを切断し、免疫組織化学染色のためのPLLでコーティングされた顕微鏡スライドでそれらを拾います。分析のために、各生検からの少なくとも二つの部分をカット。少なくとも1時間のためのドライスライド。乾燥後、切片をスズ箔でラップすることができ、最大2週間-20℃で保存し、またはそれらは、すぐに免疫染色することができます。
GMA-埋め込み気管支生検の4免疫組織化学染色
注：アジ化ナトリウムは有毒です。ヒュームフード内で0.1％アジ化ナトリウム溶液を準備し、離れて酸から。酸と接触して有毒ガスを発生します。
- ダイヤモンドひっくり返されたペンを使用してセクションの周りに描き、染色ラックにスライドを配置します。
- ペルオキシダーゼブロックを実行します。 0.1％アジ化ナトリウム溶液中に0.3％過酸化水素をペルオキシダーゼブロック溶液を調製します。 APPLY 1セクションにペルオキシダーゼブロックmlの30分間インキュベートします。
- 0.05 Mトリス緩衝食塩水（TBS）、pHが7.6の洗浄液を準備します。 TBS、3×5分でスライドを洗浄します。
- DMEM中の1％BSAブロック溶液を調製します。事前にかつ大量、一定分量でこれを行うと、必要になるまでそれを凍結します。スライドを排出し、非特異的結合抗体をブロックするために30分間ブロック溶液中のセクションをインキュベートします。非特異的結合は、依然として発生する場合は、二次抗体と同じ種から5％血清ブロックで30分間のインキュベーション工程が含まれます。
- 所望の濃度にTBSで一次抗体（CD45またはのCD1a）を希釈（1に希釈したCD45：1,000;のCD1aは1に希釈：1,00）とスライドに適用します。セクションをカバースリップし、室温で一晩インキュベートします。
- TBSで3回スライドを洗浄します。 （TBS中の所望の濃度に（2）この場合、ウサギ抗マウスF（ab 'に一次抗体宿主種に対して指向）1:30ビオチン化二次抗体を希釈0希釈）、それがスライドに適用されます。 RTで2時間インキュベートします。
- 使用前に、ストレプトアビジンビオチン - ペルオキシダーゼ複合体に少なくとも30分を準備します。すべてのスライドをカバーするのに十分であることを確認してください。 TBSで3回スライドを洗浄します。スライドに溶液を塗布し、室温で2時間インキュベートします。
- TBSで3回スライドを洗浄します。 3-アミノ-9-エチルカルバゾール（製造者の指示に従って作られた）（AEC）ペルオキシダーゼ基質溶液を調製します。スライドにそれを適用し、20〜30分間、または所望の染色強度が発現するまでインキュベートします。
- 5分間水道水でスライドを洗浄します。 2分間のフィルタリングマイヤーのヘマトキシリン溶液でセクションを対比染色。 5分間水道水でスライドを洗浄します。
- スライドを排出し、永久水性マウント媒体とのセクションをカバーしています。乾燥オーブン中で80℃でスライドを乾燥させます。スライドを冷却し、その後、DPXでそれらをマウントし、カバースリップを配置することができます。
5.セントaining分析
- コンピュータに接続された車載カメラの光顕微鏡を用いて40X倍率でのセクションを分析します。
注：細胞解析のために、平滑筋、腺、大血管、およびミスマッチまたは損傷した組織の領域を除く、気管支粘膜固有層および無傷の上皮内の陽性染色、有核細胞をカウントします。 - 細胞数を平均化し、粘膜固有層および上皮の長さの領域の平均細胞数を修正します。固有層および上皮の長さの領域を画像解析プログラムを用いて計算することができます。
気管支生検の6酵素消化
- 洗浄生検：ハンクス緩衝塩類溶液（HBSS）（ 図3）10 mlを含む15 mlのコニカルチューブに滅菌ピンセット、場所無傷の生検を使用。 30rpmでロッキングプラットフォーム上で室温で5分間インキュベートします。無菌Dに生検を転送HBSSで15ミリリットルチューブの内容をデカントすることによりっぽいです。
- DTTで粘液を乱す：5 mMの1,4-ジチオスレイトール（DTT）を含むHBSSの10mlでチューブ内でHBSSを交換してください。滅菌ピンセットを用いて、15ミリリットルチューブに戻って生検を転送します。 30rpmでロッキングプラットフォーム上で室温で15分間インキュベートします。
- 15秒間穏やかにチューブをボルテックス。 HBSSおよびDTTで15ミリリットルチューブの内容をデカントすることにより、無菌皿に生検を転送します。
- 培養培地に生検を転送する：RPMI 1640培地10mlでチューブ内でHBSSおよびDTTを交換してください。滅菌ピンセットを用いて、15ミリリットルチューブに戻って生検を転送します。 30rpmでロッキングプラットフォーム上で室温で10分間インキュベートします。
- コラゲナーゼおよびDNアーゼで生検を消化。
- 1 M HEPES溶液を含む予め温めたRPMI中のコラゲナーゼII（0.25 mg / mlで）およびDNアーゼ（0.2 mg / mlで）の消化溶液を準備します。 48ウェル組織カルトにウェル当たり消化溶液の500μLを追加UREプレート。
- 消化溶液中でウェルあたり1生検を置きます。 220rpmで37℃で60分間振とうプラットフォーム上でプレートをインキュベートします。ピペットで上下30分後に再分散生検に、そして60分後、組織を完全に脱凝集するの。
- 単一細胞懸濁液を準備します。
- 40μmのセルストレーナーを通過させることにより、50ミリリットルチューブに一緒にプールウェルから消化生検を。 （2％ウシ胎児血清を含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS））の氷冷FACS緩衝液でウェルを洗浄することによって残りの細胞を収集します。
- シリンジのプランジャーの背面を使用して、セルストレーナーに残りの組織を絞ります。 4℃で5分間、400×gで消化された細胞を遠心します。上清を慎重に除去し、氷冷FACS緩衝液5mlにペレットを再懸濁。手動での細胞の生存率を評価するために、血球計数器およびトリパンブルー染色を用いて細胞数を計測します。
- FACS緩衝液200μl中に約1×10 6個の細胞に細胞ペレットを再懸濁します。
- 製造業者のプロトコルに従って死細胞を除外するための細胞生存色素を加えます。
- FcRブロッキング試薬の5μlを添加して、4℃で5分間インキュベートします。
- 、CD16（0.5μl）を、HLA-DR（3μL）、のCD11c（5μl）を、CD123、CD45（2μl）を、系統（2μlの各CD3、CD20、CD56、CD66abce、およびCD14）に対する細胞表面抗体を追加（5μl）を、CD1c（3μL）、およびCD103（2μl）を、4℃で15分間インキュベートします。抗体の詳細については、方法の項に見つけましたが、使用中の正確なフローサイトメーターに対する抗体を滴定し、最適化することができます。 400×gで5分間、PBSで過剰な抗体を洗い流してください。フローサイトメーター上で新鮮なサンプルを取得以降acquisit前に、1％パラホルムアルデヒドで細胞を固定イオン。
- フローサイトメトリーアッセイ18（ 図4）を使用して、肺生検におけるヒトDCを識別します。
注：フローサイトメトリー分析ソフトウェアを用いて、免疫細胞がCD45にゲーティングすることによって、他の肺細胞から区別されます。死細胞は、LIVE / DEAD染料について陽性である細胞として除外することができます。すべての生CD45 +細胞系統細胞（B細胞、T細胞、NK細胞、好中球、および単球）の1チャネルでCD20、CD3、CD56、CD66abce、CD14、およびCD16に対する抗体のカクテルを使用して排除することができます。 HLA-DR +細胞は、すべてのヒトDCの同定を可能にする、ことを示します。 MDCが、それぞれのCD11cの発現またはCD11cの欠如に基づいて、PDCを区別することができます。 MDCがさらにCD1c +のMDCまたはCD141 +に分割することができます。
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Representative Results
DCを含むヒト呼吸組織常駐免疫細胞を特徴づける研究は、主として外科的に除去または全ヒト肺組織が不足しているという事実のために、限られています。ここでは、フローサイトメトリー、免疫組織化学を使用して組織内の免疫細胞を研究するか、流れるように健康なボランティアと開発されたプロトコルの気管支生検（EBB）から肺組織を得るためのより侵襲性の低い方法が概説されています。
以前に19、20に記載されているように 、健康なボランティアは、気管支鏡検査を施行しました。シックス1-2 9 mmの3気管支粘膜生検を有窓鉗子（ 図1A）を使用して、主気管分岐し、各被験者の主気管支部門から採取しました。二つの生検をGMAに埋め込まれ、その後、空間情報を提供するために、免疫組織化学のために使用しました。残りbiopsi希少細胞サブセット（ 図1B）の注意深い特徴付けを可能にする、マルチカラーフローサイトメトリーを使用してESを酵素的に消化し、そして単一細胞懸濁液を分析しました。
小さな組織片からできるだけ多くの空間情報を取得するために、生検が超薄μmの切片（ 図2A-B）を可能にするGMAに包埋しました。予想されるように、CD45を発現する免疫細胞は、比較的稀で平均た免疫組織化学（ 図2C）により評価されるように、1mm 2あたり125 CD45 +細胞は、定常状態の間、粘膜、肺組織に存在しました。 IgG1アイソタイプ対照は、一次抗体の高い特異性を示す、無陽性染色が得られました。肺上皮および基礎となる固有層の両方における陽性細胞の数を定量化し、CD45 +免疫細胞がラにおいてより豊富であることを示したし、上皮（ 図2D）に比べミナ固有。また、あるCD1a発現細胞が同定され、列挙、彼らは可能性が最も高いのDC（ 図2E）を表しました。平均して、1mm 2当たり未満1のCD1a +細胞は、定常状態での肺粘膜固有層（ 図2F）で同定されました。
免疫組織化学は、無傷の組織内の細胞の解剖学的分布に関する情報を提供するが、それは、典型的には、複数の細胞表面マーカーを用いて細胞を定義する能力が制限されます。マルチカラー機器に応じて、フローサイトメトリー、細胞当たりより多くの情報を提供するという利点を有し、それは、少量のサンプルで使用することができます。最大9粘膜、肺生検をプールし、洗浄し、粘液を破壊するためにインキュベートしました。各生検は、次いで単一細胞懸濁液（F、その結果、48ウェルプレートの個々のウェルに、コラゲナーゼおよびDNアーゼで消化しました。igures 3A - 3B）。平均して、被験体ごとに1.5×10 6気管支細胞を得て、細胞収率および生存率の間に正の相関が（ 図3C）が観察されました。低い細胞数で観察された減少した細胞生存率は、潜在的に細胞のための最適以下であった細胞あたりより高い酵素濃度によって説明することができます。これは、いくつかの生検が他よりも表面的な粘膜の多くをサンプリングして、サイズおよび細胞密度の両方で、様々な生検でのチャレンジです。予想されるように、定常状態条件下で肺の粘膜組織中の細胞の大部分は、免疫細胞はなかったが、単一細胞懸濁液のフローサイトメトリー分析は、平均して、細胞の12％は、CD45 +白血球た、ことを明らかにした（ 図3D ）。並行して両方の技術を採用した強さを強調して相関フローサイトメトリーおよびIHCデータ。
図4A）について陰性であったライブCD45 +白血球の上にゲートを用いて同定しました。細胞のこの小さな集団において、形質のDC（PDCには）CD11cの発現とCD123およびHLA-DR（ティール）の彼らの高発現の欠如に基づいて同定しました。 CD11c + HLA-DR +系統陰性細胞の中では、CD1c +（珊瑚）とCD141 +（マルーン）の両方骨髄DCは（ 図4A）を同定しました。さらに、インテグリンCD10の発現をこれらの細胞サブセットを特徴づけるために、 E-カドヘリンに結合する3は、組織固着に重要な、評価しました。すべてのDCサブセット、ならびに末梢血中を循環するT細胞は、CD103のために低いか、または陰性であったが、同じ個体の肺に見られるDCとT細胞の別個の割合は、CD103を発現しました。これは、気管支肺胞洗浄ならびに肺組織（ 図4B）の両方で見られる細胞の本当でした。
図1：ヒト肺粘膜組織のサンプリング。 （A）Bronchoscopiesは鉗子を使用して1つの肺の主気管支の部門からの気管支生検を得るために被験体で実施しました。 （B）生検は、いずれの切片、組織および酵素免疫組織化学（青図）またはフローサイトメトリー（ピンク図）のための単一細胞懸濁液を得るために、消化のためにGMAに包埋しました。メートル/ファイル/ ftp_upload / 55222 / 55222fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：GMA樹脂で生検を埋め込みます。 （A） bronchoscopiesから採取した生検を直ちに氷冷脱水アセトン（左パネル）を含むガラスバイアルに移しました。一晩固定後、生検を安息香酸メチルの溶液を浸透させました。生検材料は、重合（中央のパネル）を開始するために溶液を埋め込んで充填されたカプセルを埋め込むに入れました。埋め込まれた生検を-20℃で保存することができ、または免疫組織化学染色（右パネル）のために区分することができます。 （B）GMAを使用して生検を埋め込む処理の模式的ハイライト重要なステップ。 CD45 +の存在を示す区分生検の代表的な画像（C）またはのCD1a +細胞（E）は 、それぞれのアイソタイプ対照（右パネル）と比較して示されています。具体的な染色は赤色で表示し、ヘマトキシリンで対比染色した細胞核は青であるされています。 =50μmのスケールバー。棒グラフは、CD45 +（D）またはのCD1a +（F）上皮または固有層（N = 20）で1mm 2あたりの細胞の四分位範囲±中央値を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：フローサイトメトリーのための生検の酵素消化。 （A）ペトリ皿に気管支鏡から採取気管支生検。生検は、粘液を除去するために、DTTで処理された、HBSSで洗浄し、dが前のフローサイトメトリー分析のために、単一の細胞の集まりをコラゲナーゼおよびDNアーゼで消化しました。 （B）は概略は、フローサイトメトリーのための生検を消化するための主な手順をまとめたもの。手動計数およびトリパンブルー排除（N = 20）で評価した（C）のグラフは、細胞収率および生存率の相関を示しています。 （D）消化生検からの単一細胞懸濁液を、フローサイトメトリーによって分析し、生存率およびCD45の発現（白血球共通抗原）について評価しました。プロットフローサイトメトリーは、20健常者のうち、代表的な一のドナーを示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：消化Bにおける肺の樹状細胞サブセットの同定iopsies。 （A）肺粘膜組織におけるCD1c +およびCD141 +骨髄性樹状細胞（MDCの）および形質のDC（のPDC）の同定のためのゲーティング戦略。代表的な一被験者からのプロットをフローサイトメトリーを示します。 （B）ドットプロットは、肺生検（左パネル）、気管支肺胞洗浄（中央のパネル）、および末梢血（右パネル）におけるDCの集団に対するインテグリンCD103の発現を示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、免疫組織化学を使用して、健康なヒトにおける肺組織常駐DCの詳細な空間と表現型の特徴付けを生成し、気管支鏡検査中に収集された気管支粘膜生検でフローサイトメトリーする方法について説明します。以下の段落では、プロトコルにおける重要なステップは、詳細に説明します。
議定書の重要なステップ
セクショニングおよび免疫組織化学：彼らに（ステップ2.5）を使用していないときに、-20℃で生検のブロックを維持することが重要です。暖かいブロックが時々柔らかくなることができ、セクションは同様にしません。さらに、-20℃でブロックを維持すること抗原部位を維持し、免疫組織化学を使用して、より良い染色になります。
セクショニングおよび免疫組織化学：GMA-埋め込まれた生検を区画する場合は、上のセクションをフロートするために利用可能なアンモニア水の3-4の容器を持っていると便利です。セクションがピックアップされ、ミリアンペア新鮮なセクション（ステップ3.4）に置き換えてくださいKE。これは、そのセクションが再び処理される時点で、それは抗原提示とその後の免疫組織化学に役立つ時間の約正しい長さ（45-90秒）、のためのアンモニア水に浮かぶされているであろう、ということを保証します。このように2μmのセクションをカットすると、同じ細胞が潜在的に異なる細胞表面または細胞内マーカーで染色することができることを意味し、連続した切片を可能にします。また、セクショニング時には容易に破損しているように、ガラス刃の刃先に触れないことが重要です。除去する必要のあるブレードのごみが存在する場合、常に刃先から離れるブラシ。
酵素消化およびフローサイトメトリー：免疫細胞が稀である組織サンプルでは、最初に、さらに識別DCまたは関心のある他の免疫細胞の前に（少数派）白血球を識別するために、フロー染色パネルでCD45を含めることが重要です。また、「Fluorescenceマイナス1」またはアイソタイプコントロールは、まれなイベントがノイズを超える真の信号であることを保証するために使用される抗体のパネルを検証中に含めることが重要です。
修正およびトラブルシューティング
切片および免疫組織化学：免疫細胞により発現されるほとんどの細胞マーカーについて、扁桃組織が良い陽性対照として使用することができ、限られた気管支生検材料（工程4）の浪費を避けるために、免疫組織化学のための抗体を滴定します。 DCの樹状突起を視覚化するために、組織はなく垂直に粘膜21を介してよりも、上皮に平行に区分することができます。ユーザが別の基板の色を必要とする場合、他のペルオキシダーゼの基質は、例えばDABとして、AECに加えて使用することができます。アビジン/ビオチン、酵素複合体はまた、アルカリホスファターゼ、例えば、置換されていてもよいです。
酵素消化およびフローサイトメトリー：エンドがobronchial生検が小さい、組織常駐細胞はフローサイトメトリー分析のために単一細胞懸濁液（ 図3）に酵素消化処理を生き残ります。しかし、抗体パネル、フローサイトメトリーで使用される汚れに酵素の潜在的な影響を評価することが重要です。酵素消化プロトコルを切断する切断、改変、または抗体の染色を妨害するかどうかを試験するために、末梢血単核細胞と同様のマーカーを発現して、より容易にアクセス可能な細胞は、消化酵素（ステップ6）、またはしないで処理することができ、それらその後によって蛍光標識抗体で染色し、フローサイトメトリー（ステップ7）により分析することができます。コラゲナーゼおよびDNアーゼは、抗原の可用性を妨害しない場合は、とのまたは酵素で細胞を処理せずに汚れが類似しているはずです。さらに、これはフローサイトメトリー、ならびに無傷の組織切片および免疫組織化学（Fiの両方使用して確認することができgures 2から3）19。
テクニックの制限事項
気管支鏡検査：ほとんどの健康な個体はよく気管支鏡検査を容認し、それが日常的に、ここで説明したように、（ステップ1）を気管支内粘膜生検を収集することを含む、肺を調べ、サンプリングするために使用する方法です。しかしながら、気管支鏡検査は、それがしばしば不快と認識されているので、縦サンプリングのために行うために、典型的には適切な方法ではなく、それはまた、時間と資源要求手順です。したがって、気管支内生検は、任意の時点で粘膜肺組織内に存在する免疫細胞のスナップショットではなく、動態または動態の変化の長期的な研究を提供しています。
既存の/代替方法に関して技術の意義
セクショニングおよび免疫組織化学：GMAに埋め込むことの利点はなく、パラフィンまたは凍結保存によって、17を得ることができる薄切片による形態と抗原、および小さな生検から切片のより多くの優れた保存です。
酵素消化およびフローサイトメトリー。小さな生検からの単一細胞を得ることによって、より多くの情報は、マルチカラーフローサイトメトリーによって達成することができます。
このテクニックをマスターした後、将来のアプリケーションや行き方
このプロトコルは、免疫組織化学を組み合わせてフローサイトメトリーによって小気管支生検から得られる情報を最大化するための2つの平行な方法を説明しました。同様なマーカーを有する他の免疫細胞からDCを区別するために、生検の酵素消化は、マルチカラーフローサイトメトリーを可能にする一方、DCのような稀な免疫細胞の空間分布を特徴付けるために、生検を、免疫組織化学のための薄い切片を得るためにGMAに埋め込むことができますPEことにしますrformed。炎症または疾患の間にDCの新規な特徴の公平な同定を可能にするために、フローサイトメトリーデータの自動分析は、特徴抽出アルゴリズム22を適用することによって行うことができます。将来のアプリケーションは、RNA配列またはトランスクリプトームプロファイリングのために使用され得る特定の細胞集団を収集するために細胞選別のために、これらの単セルを使用することを含みます。肺に存在する樹状細胞の同定は、健康と病気の間の免疫風景の変化を理解するために重要であり得ます。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
著者らは、この研究に臨床材料を貢献したボランティアに感謝したいと思います。我々はまた、すべての臨床材料の収集のための公衆衛生・臨床医学/呼吸器内科の部門、大学病院、ウメオ（Norrlandsのuniversitetssjukhus）の部門のスタッフに感謝しています。
この作品は、スウェーデンの研究評議会、スウェーデン心肺財団、戦略研究のためのスウェーデンの財団、カロリンスカ研究所からAS-Sへの助成金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20 mm x 27 mm |
| Glucose 25% | 500 ml intravenous | ||
| Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
| Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o | Can be used for extra relaxation | ||
| Lidocaine, 40 mg/ml | Mouth and throat administration / Gargled | ||
| Lidocaine 100 mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
| Lidocaine 20 mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
| GMA processing and embedding | |||
| Glass vials | 5 ml | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Molecular sieves, 4 Å | Alfa Aesar | 88120 | 3-4 mm diameter pellets |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035 g/100 ml acetone |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37 g/100 ml acetone |
| Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | 500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
| Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8 mm capsules |
| JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
| Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6 mm |
| GMA sectioning | |||
| Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
| Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
| Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
| Vice | |||
| Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%) |
| Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
| Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
| GMA Immunohistochemistry | |||
| Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
| Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
| Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
| Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
| Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
| Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Drying oven | |||
| DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
| Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
| Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Enzymatic digestion | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Flow cytometry | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
| FlowJo | FlowJo | Software for analysis | |
References
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
- Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
- Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
- Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
- Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
- Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
- Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
- Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
- van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
- Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
- Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
- Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
- Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
- Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
- Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
- Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).
