Introduction
I polmoni sono in continuo contatto con l'ambiente esterno e sono esposti a entrambe le particelle innocue e microbi con la capacità di causare la malattia. Pertanto, è fondamentale per il sistema immunitario di montare potenti risposte immunitarie contro patogeni, ma è altrettanto importante mantenere la tolleranza agli antigeni inalati che non causano malattie. Per fornire potenti sorveglianza immunitaria, il sistema respiratorio è fiancheggiata da una rete di cellule del sistema immunitario, comprese le cellule dendritiche (DC). DC sono cellule professionali presentanti l'antigene con la capacità unica di attivare le cellule T naive. In polmoni umani, DC residenti incontrano un antigene e poi processo e trasportano ai linfonodi polmonari drenanti per presentazione e l'attivazione delle cellule T 1, 2, 3.
Nel sistema immunitario umano, DC può essere suddiviso in più sottoinsiemi, con distinct ma sovrapposte funzioni: CD1c + e CD141 + DC mieloidi (MDC) e CD123 + cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) 4, 5. Mentre la maggior parte conoscenza dettagliata sulle DC umana deriva da studi di sangue, è ormai evidente che i polmoni umani porto anche rare popolazioni di sottoinsiemi DC con cellule T capacità stimolante 6, 7, 8, 9. Tuttavia, i dati accumulati dimostrano che le cellule immunitarie, tra DC, differiscono nella loro frequenza, fenotipo e funzione a seconda della loro posizione anatomica 10. Pertanto, è importante studiare le cellule immunitarie dal tessuto rilevante per comprendere il loro contributo alla immunità locale e tolleranza. Nel loro insieme, questo sottolinea la necessità di studiare DC polmone residente al momento di affrontare le malattie polmonari, nonostante DC sangue che viene più facilmente disponibili e accessibili nell'uomo.
I primi studi che hanno indagato DC polmonari residente nell'uomo utilizzassero principalmente morfologia e l'espressione dei singoli marcatori, come HLA-DR e CD11c, in sezioni di tessuto usando immunoistochimica 11, 12, 13. Al contrario, studi più recenti hanno di solito fatto affidamento su analisi di citometria di flusso per studiare diversi sottoinsiemi di cellule immunitarie. Tuttavia, poiché è difficile trovare un singolo marker superficie cellulare che identifica univocamente uno specifico sottoinsieme DC, il potenziale limitazione di studi applicando citofluorimetria solo quattro colori è il rischio di inclusione popolazioni cellulari con marcatori fenotipici simili come DC. Ad esempio, CD11c è espresso su tutte DC mieloidi e la stragrande maggioranza dei monociti. D'altra parte, negli studi di applicazione di pannelli più avanzati citometria di flusso, tessuto polmonare non-cancerose da resezioni chirurgiche di pazienti sono stati in genere utilizzatoxref "> 10, 14, 15, 16, anche se non è chiaro se queste popolazioni rare sono veramente rappresentativi delle DC presente in soggetti sani. Nel complesso, gli studi sono limitati in gran parte dovuto al fatto che rimosso chirurgicamente o tutto il tessuto polmonare umano è scarso.
Per superare alcune di queste limitazioni, questo lavoro descrive come eseguire una dettagliata analisi della distribuzione spaziale e l'identificazione fenotipica delle DC in biopsie endobronchiali mucosa ottenuti da volontari sani che si sottopongono a una broncoscopia. Diversi piccoli biopsie possono essere raccolti da ogni individuo e possono essere successivamente integrati per il sezionamento e l'analisi mediante immunoistochimica o enzimaticamente digerito per analisi avanzata citometria a flusso. Usando tessuto polmonare in forma di biopsie endobronchiali ottenuti broncoscopie conferisce il vantaggio di rendere possibile l'esecuzione della study su volontari sani, a differenza chirurgia aperta dei polmoni che, per ovvi motivi, è limitata a pazienti che necessitano di chirurgia toracica. Inoltre, il tessuto che viene campionata durante una broncoscopia da volontari sani è fisiologicamente normale, in contrasto ad una zona non interessata del tessuto polmonare in pazienti con malattia polmonare. D'altra parte, le biopsie sono piccole e il numero di cellule recuperate, anche quando il pool diverse biopsie, limita il tipo di analisi che possono essere eseguite.
Mentre il presente lavoro si concentra sulla DC, i metodi descritti può essere ampliato per includere direttamente altre cellule del sistema immunitario () di interesse che si trovano nel tessuto mucoso polmone umano. Inoltre, i protocolli sono direttamente applicabili ai campioni ottenuti da pazienti affetti da malattie polmonari dove broncoscopia fa parte di stabilire la diagnosi, come la malattia cronica ostruttiva (BPCO), sarcoidosi, o il cancro ai polmoni.
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Protocol
NOTA: Questa ricerca è stato approvato dal Etico Review Board regionale in Umeå, Svezia.
1. broncoscopia per il campionamento endobronchiale biopsie di soggetti umani
- Ottenere il consenso informato da tutti i partecipanti.
- Trattare soggetti con midazolam per via orale (4-8 mg) e glicopirronio per via endovenosa (0,2-04 mg) 30 minuti prima della broncoscopia. Applicare anestesia topica con lidocaina nella laringe e bronchi. Lasciate che il gargarismo soggetto con ~ 3 ml di lidocaina al 4% e si applicano 3 ml alla base della lingua e nella laringe tramite una siringa laringe. Ottimizzare l'anestesia topica con 8-10 dosi di spray lidocaina. Effettuare questa operazione con la seduta soggetto.
- Inserire un video broncoscopio flessibile attraverso la bocca tramite un boccaglio di plastica con il soggetto in posizione supina. Utilizzare uno spray catetere appositamente creati per completare l'anestesia topica della trachea distale e bronchi attraverso il broncoscopio. Qui, usare una dose di circa5-10 ml di lidocaina 2%.
- Prendere 6-9 endobronchiali biopsie della mucosa dalla carena principale e le principali divisioni bronchiali con pinze fenestrate (Figura 1). Dopo la broncoscopia e prima di lasciare l'ospedale, lasciare che il resto soggetto per 2-4 ore e di fornire lui / lei con un pasto leggero.
2. Incorporare biopsie in glicole metacrilato (GMA) Resina
NOTA: Il protocollo immunostaining GMA è stato originariamente sviluppato presso l'Università di Southampton, Istochimica Unità di Ricerca 17.
- Fissazione: Per l'immunoistochimica, rimuovere le biopsie delle pinze e metterli direttamente in fiale di vetro contenenti 3 ml di inibitori di acetone e proteasi disidratati ghiacciate (phenylmethylsulfonyl fluoruro (35 mg / 100 ml di acetone) e iodoacetamide (370 mg / 100 ml di acetone )). Fissare il tessuto durante la notte a -20 ° C (figura 2).
NOTA: Le seguenti operazioni devono essere Perfoconfermate in una cappa aspirante con opportuni guanti di nitrile. Il kit embedding contiene componenti che possono causare reazioni di sensibilizzazione, irritazione, e / o cutanee allergiche. Tutti i rifiuti devono essere smaltiti come rifiuti pericolosi. - Disidratazione: Rimuovere l'acetone con gli inibitori e sostituire con acetone fresco disidratato (senza inibitori) per 15 minuti a temperatura ambiente (RT). Rimuovere l'acetone e sostituirlo con benzoato di metile per 15 min.
- Infiltrazione: Preparare una soluzione di elaborazione di 5% soluzione di metil benzoato di glicole metacrilato monomero; 10 ml è sufficiente per un flaconcino. Usando una pipetta Pasteur plastica, aspirazione Eliminare la soluzione metil benzoato e sostituirlo con 3 ml di soluzione di elaborazione. Incubare le biopsie e soluzione di elaborazione eccesso a 4 ° C per 2 ore; pipette Pasteur possono essere usati per tutte le successive modifiche soluzioni, tra cui incorporamento soluzione.
- Sostituire la soluzione di elaborazione ogni 2 ore (3x 2 incubazione hr), quindi il tempo di infiltrazione totale del biopsies nella soluzione di elaborazione è di almeno 6 ore. Inserire etichette di carta nella parte alta delle capsule embedding per identificare le biopsie.
- Preparare una soluzione incorporamento di perossido di benzoile 75 mg in 10 ml di glicol metacrilato monomero. Aggiungere 0,25 ml di N, N poli -dimethylaniline (ossido di etilene) (acceleratore) alla soluzione embedding per iniziare la reazione di polimerizzazione. Rimuovere la soluzione di elaborazione e mettere una biopsia nella capsula embedding rilevanti con pinze.
- Lentamente riempire la capsula embedding verso l'alto con l'incorporamento soluzione e chiudere il tappo. Evitare di disturbare la biopsia e la creazione di grosse bolle d'aria. Incubare le capsule a 4 ° C fino a quando la resina si è completamente polimerizzato.
- Conservare le biopsie incorporati a -20 ° C in una provetta da 50 ml contenente circa 5 g di gel di silice.
3. Sezione del GMA-embedded endobronchiali biopsie
- Rivestimento vetrino da microscopio: Lavare i vetrini da microscopio in unlavastoviglie su un ciclo normale. Coprire le diapositive e lasciare asciugare all'aria.
- Preparare una soluzione di rivestimento di 10% di poli-L-lisina soluzione (PLL) in acqua distillata. Immergere i vetrini in soluzione di rivestimento per 5 minuti, e poi lasciarli asciugare all'aria. Conservare diapositive PLL rivestite secco nelle loro scatole originali.
- Lavare le strisce lastra di vetro con il 0,1% di Tween 20 in acqua distillata. Sciacquare il bicchiere con il 70% di etanolo e asciugare con carta assorbente. Tagliare lame di vetro dalla striscia di vetro con un produttore di coltello. Conservare le lame in un contenitore che impedisce il movimento di assicurare che il bordo di taglio non venga danneggiato o scheggiato.
- Biopsia taglio: Posizionare la capsula biopsia in uno splitter capsule e ridurre ogni lato con una lama singola-edge in acciaio al carbonio. Rimuovere la biopsia GMA-embedded e fissarlo saldamente in una morsa. Trim eccesso GMA da tutto il biopsia utilizzando la lama in acciaio.
- GMA sezionamento.
- Preparare la soluzione di ammoniaca 0,05% con acqua distillata. Posizionare il coltello vetro e la biopsia in the microtomo. Allineare con cura il blocco biopsia con la lama regolando il portalama e l'angolo del blocco biopsia modo che la lama si appoggia piatta contro la superficie del blocco.
- Tagliare 2 micron sezioni spesse utilizzando il microtomo su una velocità di taglio lento e utilizzare pinze per trasferire e galleggiare le sezioni in acqua ammoniaca. Float sezioni per 45-90 secondi, permettendo delicato recupero antigene e dispiegarsi della sezione.
- Pick up sezioni con vetrino da microscopio. Controllare l'istologia biopsia mediante colorazione rapidamente con blu di toluidina.
- Essiccare i vetrini su un insieme piastra calda a 50 ° C e applicare 500 ml di toluidina filtrato blu macchia da una sezione con una pipetta di plastica Pasteur. Scaldare la sezione sulla piastra calda fino a quando un anello verde comincia ad emergere ai margini della macchia, e poi lavare con acqua.
- Utilizzando un microscopio ottico, controllare l'istologia biopsia. Sezioni utilizzati per immunoistochimica dovrebbero contenere buone zone della lamina integrepropria e dell'epitelio, con il minor numero di ghiandole e il meno della muscolatura liscia possibile.
- Come nella sezione 3.4.2, tagliare sezioni che hanno un buon istologia e prenderli con vetrini da microscopio PLL-rivestite per la colorazione immunoistochimica. Tagliare almeno due sezioni da ciascuna biopsia per l'analisi. diapositive asciugare per almeno 1 ora. Dopo l'essiccazione, le sezioni possono essere avvolti in carta stagnola e conservati a -20 ° C per 2 settimane, oppure possono essere immediatamente immunoistochimica.
4. la colorazione immunoistochimica di GMA-embedded endobronchiali biopsie
NOTA: sodio azide è tossica. Preparare la soluzione di sodio azide 0,1% all'interno di una cappa aspirante e lontano da acidi. A contatto con acidi libera gas tossico.
- Tracciare intorno sezioni utilizzando una penna a punta di diamante e organizzare le diapositive su una griglia colorazione.
- Eseguire un blocco perossidasi. Preparare una soluzione blocco perossidasi di perossido di idrogeno 0,3% in soluzione di sodio azide 0,1%. Apply 1 ml del blocco perossidasi di sezioni e incubare per 30 min.
- Preparare una soluzione di lavaggio di 0,05 M salina Tris tamponata (TBS), pH 7,6. Lavare i vetrini in TBS, 3x 5 min.
- Preparare una soluzione blocco BSA 1% in DMEM. Fate questo in anticipo e in grandi volumi, aliquotare e congelare fino al momento. Scolate le diapositive e incubare sezioni in soluzione di blocco per 30 minuti per bloccare legame degli anticorpi non specifico. Se legame aspecifico verifica ancora, includere una fase di incubazione 30 min con 5% siero di blocco della stessa specie l'anticorpo secondario.
- Diluire anticorpo primario (CD45 o CD1a) in TBS alla concentrazione desiderata (CD45 diluito 1: 1.000; CD1a diluito a 1: 1,00) e applicarla alle diapositive. Coprioggetti sezioni e incubare una notte a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini in TBS tre volte. Diluire anticorpo secondario biotinilato (diretto contro le specie ospite anticorpi primari, in questo caso di coniglio anti-topo F (ab '2)) in TBS alla concentrazione desiderata (1:300 diluizione) e applicarla alle diapositive. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
- Preparare una streptavidina biotina-perossidasi almeno 30 minuti prima dell'uso. Assicurarsi che vi sia sufficiente a coprire tutte le diapositive. Lavare i vetrini in TBS tre volte. Applicare la soluzione ai vetrini e incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini in TBS tre volte. Preparare 3-ammino-9-etilcarbazolo (AEC) soluzione di substrato perossidasi (fatta secondo le istruzioni del produttore). Applicare alle diapositive e incubare per 20-30 minuti o fino a quando l'intensità colorazione desiderata si sviluppa.
- Sciacquare i vetrini in acqua corrente per il 5 min. Controcolorare sezioni con la soluzione ematossilina di Mayer filtrata per 2 minuti. Lavare i vetrini in acqua corrente per 5 min.
- Scolate le diapositive e coprire le sezioni con un mezzo di montaggio acquoso permanente. Essiccare i vetrini a 80 ° C in un forno di essiccazione. Lasciare raffreddare i vetrini, e poi montarli con DPX e posto un vetrino.
5. StAnalisi aining
- Analizzare le sezioni a 40X di ingrandimento utilizzando un microscopio ottico con una telecamera montata collegata a un computer.
NOTA: Per l'analisi cellulare, conteggio positivamente macchiato, cellule nucleate all'interno della lamina propria bronchiale e l'epitelio intatto, escluse le aree di muscolo liscio, le ghiandole, grandi vasi sanguigni e il tessuto non corrispondenti o danneggiato. - Calcolare la media dei conteggi delle cellule e correggere il numero medio di cellule per l'area della lamina propria e la lunghezza dell'epitelio. L'area della lamina propria e la lunghezza dell'epitelio può essere calcolato utilizzando un programma di analisi di immagine.
6. digestione enzimatica di endobronchiali biopsie
- Biopsie di lavaggio: Utilizzando pinze sterili, posto biopsie intatti in un tubo da 15 ml contenente 10 ml di soluzione salina tamponata di Hank (HBSS) (Figura 3). Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante a 30 rpm. Trasferire le biopsie a un d steriliish per decantazione il contenuto della provetta 15 ml con HBSS.
- L'interruzione di muco con DTT: Sostituire il HBSS nel tubo con 10 ml di HBSS contenente 5 mM 1,4-ditiotreitolo (DTT). Trasferire le biopsie di nuovo nel tubo da 15 ml con pinza sterile. Incubare per 15 minuti a RT su una piattaforma oscillante a 30 rpm.
- Agitare il tubo dolcemente per 15 sec. Trasferire le biopsie su un piatto sterile per decantazione il contenuto della provetta 15 ml di HBSS e DTT.
- Trasferire le biopsie al mezzo di coltura: sostituire il HBSS e DTT nel tubo con 10 ml di RPMI 1640 medium coltura. Trasferire le biopsie di nuovo nel tubo da 15 ml con pinza sterile. Incubare per 10 minuti a RT su una piattaforma oscillante a 30 rpm.
- Digerire biopsie con collagenasi e DNasi.
- Preparare una soluzione di digestione di collagenasi II (0,25 mg / ml) e DNase (0,2 mg / ml) in RPMI preriscaldata contenente soluzione 1 M HEPES. Aggiungere 500 ml di soluzione di digestione per bene in un culto del tessuto 48 pozzettipiatto ure.
- Mettere 1 biopsia per pozzetto in soluzione digestione. Incubare la piastra su una piattaforma agitazione per 60 min a 37 ° C a 220 rpm. Pipetta su e giù dopo 30 min di ri-disperdere le biopsie, e dopo 60 min, di disaggregare completamente il tessuto.
- Preparazione sospensioni singola cella.
- Pool insieme biopsie digerito dai pozzetti in una provetta da 50 ml di passare attraverso un filtro cella 40 micron. Raccogliere le cellule rimanenti lavando i pozzetti con tampone FACS ghiacciata (tampone fosfato salino (PBS) contenente 2% di siero fetale bovino).
- Comprimere il tessuto rimanente sul setaccio cellulare utilizzando il retro dello stantuffo di una siringa. Centrifugare le cellule digeriti a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere con attenzione il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di tampone FACS ghiacciata. Contare le cellule utilizzando un emocitometro manualmente e Trypan blu macchia per valutare la vitalità delle cellule.
- Risospendere il pellet cellulare a circa 1 x 10 6 cellule in 200 microlitri di tampone FACS.
- Aggiungere un colorante vitalità cellulare per esclusione cellule morte secondo il protocollo del produttore.
- Aggiungere 5 ml di FcR reagente di blocco e incubare per 5 minuti a 4 ° C.
- Aggiungere gli anticorpi di superficie cellulare contro CD45 (2 ml), stirpe (CD3, CD20, CD56, CD66abce, e CD14, 2 ml ciascuna), CD16 (0,5 ml), HLA-DR (3 ml), CD11c (5 ml), CD123 (5 ml), CD1c (3 ml), e CD103 (2 mL) e incubare per 15 min a 4 ° C. Dettagli sulla anticorpi possono essere trovati nella sezione Metodi, ma, TITOLARE e ottimizzare gli anticorpi al flusso preciso citometro in uso. Lavare anticorpi in eccesso con PBS per 5 min a 400 x g. Acquisire i campioni freschi su un citofluorimetro o fissare le cellule in 1% paraformaldeide prima Acquisiz tardiionico.
- Identificare dendritiche umane in biopsie polmonari utilizzando un citofluorimetro dosaggio 18 (Figura 4).
NOTA: l'utilizzo di un software di analisi di citometria a flusso, le cellule immunitarie si distinguono dalle altre cellule polmonari da gating su CD45. Le cellule morte possono essere escluse come cellule che sono positivi per il colorante Live / Dead. Di tutti CD45 + dal vivo le cellule, le cellule lignaggio (cellule B, le cellule T, le cellule NK, neutrofili e monociti) può essere escluso con un cocktail di anticorpi contro CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14, CD16 e in un canale. Dopo che le cellule, HLA-DR + permetteranno l'identificazione di tutti i DC umane. MDC possono essere distinti da PDC in base alla espressione di CD11c o la mancanza di CD11c, rispettivamente. MDC possono essere ulteriormente suddivise in CD1c + MDC o CD141 +.
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Representative Results
Gli studi che caratterizzano le cellule dei tessuti residenti delle vie respiratorie umane del sistema immunitario, tra cui DC, sono limitate, in gran parte dovuto al fatto che rimosso chirurgicamente o tutto il tessuto polmonare umano è scarso. Qui, un metodo meno invasivo per ottenere tessuto polmonare da biopsie endobronchiali (EBB) su volontari sani e protocolli sviluppati per studiare le cellule immunitarie nel tessuto mediante immunoistochimica o citometria a flusso sono delineati.
Volontari sani sono stati sottoposti a broncoscopia, come descritto in precedenza 19, 20. Da sei a nove 1-2 mm 3 biopsie della mucosa endobronchiali sono state prese dalla carena principale e le principali divisioni bronchiali di ogni soggetto con pinze fenestrate (Figura 1A). Due biopsie sono state inserite in GMA e successivamente utilizzati per immunoistochimica per fornire informazioni spaziali. Il restante biopsiES sono stati digeriti enzimaticamente, e le sospensioni monocellulari sono stati analizzati utilizzando multicolore citometria a flusso, che ha permesso un'attenta caratterizzazione di sottoinsiemi di cellule rare (Figura 1B).
Per ottenere più informazioni spaziali possibile dai piccoli pezzi di tessuto, le biopsie sono state inserite in GMA che permette di ultrasottili sezioni micron (Figura 2A-B). Come previsto, le cellule immunitarie CD45-esprimendo erano relativamente rare, in media, + cellule CD45 125 per mm 2 erano presenti nel tessuto polmonare della mucosa durante condizioni di stato stazionario, valutata mediante immunoistochimica (Figura 2C). Il controllo IgG1 isotipo provocato alcun colorazione positiva, che indica alta specificità dell'anticorpo primario. Il numero di cellule positive sia l'epitelio polmonare e il sottostante lamina propria sono stati quantificati e ha mostrato che le cellule CD45 + immunitarie erano più abbondanti nella lapropria mina rispetto nell'epitelio (Figura 2D). Inoltre, le cellule CD1a che esprimono sono stati identificati e enumerati, e molto probabilmente rappresentano DC (Figura 2E). In media, meno di un CD1a cella + per mm 2 è stato identificato nella lamina propria polmone allo stato stazionario (Figura 2F).
Immunoistochimica fornisce informazioni sulla distribuzione anatomica delle cellule nel tessuto intatto, ma è tipicamente limitato nella sua capacità di definire le cellule utilizzando marcatori multipli superficie cellulare. Multicolore citometria a flusso, a seconda dello strumento, ha il vantaggio di fornire ulteriori informazioni per cella, e può essere utilizzato in piccoli campioni. Fino a nove biopsie polmonari della mucosa sono stati riuniti, lavati, e incubate per interrompere il muco. Ogni biopsia è stato poi digerito da collagenasi e DNasi in singoli pozzetti di una piastra da 48 pozzetti-, risultando in un cella singola sospensione (Figures 3A - 3B). In media, 1,5 x 10 6 cellule endobronchiali per soggetto sono stati ottenuti, e è stata osservata una correlazione positiva tra il rendimento e la vitalità cellulare (Figura 3C). La vitalità cellulare ridotta osservata con il numero di cellule inferiori potrebbe potenzialmente essere spiegato con una concentrazione enzimatica più elevata per cellula che è stata ottimale per le cellule. Questa è una sfida con biopsie variando sia in dimensioni e della densità delle cellule, con alcune biopsie campionamento più della mucosa superficiale di altri. Come previsto, analisi citofluorimetrica della cella singola sospensione rivelato che, in media, il 12% delle cellule sono state CD45 + leucociti, mentre la maggior parte delle cellule del tessuto mucoso polmonare in condizioni di stato stazionario non erano cellule immunitarie (Figura 3D ). La citometria a flusso di dati e IHC correlati, che mette in evidenza la forza di impiegare entrambe le tecniche in parallelo.
+ dal vivo leucociti che esprime HLA-DR, ma sono stati negativi per i marcatori lignaggio CD3, CD20, CD56, CD66abce, CD14, CD16 e (Figura 4A). In questa piccola popolazione di cellule, plasmacitoidi DC (PDC) sono stati identificati in base alla loro mancanza di espressione CD11c e la loro elevata espressione di CD123 e HLA-DR (verde acqua). Tra le HLA-DR + cellule CD11c + lignaggio-negativo, sia CD1c + (corallo) e CD141 + (marrone) sono state identificate cellule dendritiche mieloidi (Figura 4A). Per caratterizzare ulteriormente questi sottoinsiemi di cellule, la loro espressione del CD10 integrina 3 che si lega a E-caderina, importante per l'ancoraggio dei tessuti, è stata valutata. Mentre tutti i sottoinsiemi DC, così come le cellule T circolanti nel sangue periferico, erano bassi o negativi per CD103, una parte distinta di cellule T DCS trovati nei polmoni dello stesso individuo espresso CD103. Ciò era vero per cellule trovate sia nel lavaggio broncoalveolare così come nel tessuto polmonare (Figura 4B).
Figura 1: campionamento di tessuto mucoso polmone umano. (A) broncoscopia sono stati eseguiti su soggetti di ottenere biopsie endobronchiali dalle principali divisioni bronchiali di un polmone con pinze. (B) Le biopsie sono state o incorporati in GMA per il sezionamento dei tessuti e immunoistochimica (schema blu) o enzimaticamente digerito per ottenere sospensioni di singole cellule per citometria di flusso (schema rosa).m / files / ftp_upload / 55222 / 55222fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Incorporare le biopsie in resina GMA. (A) Le biopsie presi dalla broncoscopia sono stati immediatamente trasferiti in fiale di vetro contenenti acetone disidratato ghiacciata (pannello di sinistra). A seguito di fissazione durante la notte, le biopsie sono state infiltrate con una soluzione di metil benzoato. Le biopsie sono stati collocati in embedding capsule riempite con l'incorporamento soluzione per iniziare la polimerizzazione (pannello centrale). biopsie incorporati possono essere conservati a -20 ° C oppure possono essere sezionati per immunoistochimica colorazione (pannello di destra). (B) i punti salienti schematiche passaggi chiave nel processo di biopsie incorporamento utilizzando GMA. Immagini rappresentative della biopsie sezionati che mostrano la presenza di CD45 + (C) o cellule CD1a + (E) sono mostrati rispetto ai rispettivi controlli isotipo (pannelli a destra). colorazione specifica è mostrato in rosso, e nuclei delle cellule di contrasto con ematossilina sono in blu. Barra di scala = 50 micron. Grafici a barre mostrano la mediana ± range interquartile di CD45 + (D) o CD1a + (F) cellule per mm 2 nell'epitelio o lamina propria (n = 20). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: la digestione enzimatica di biopsie per citometria a flusso. (A) Una biopsia endobronchiale preso da un broncoscopia in una capsula di Petri. Le biopsie sono stati lavati in HBSS, trattato con DTT per rimuovere il muco, und ad digerito con collagenasi e DNasi prima della raccolta di singole cellule per l'analisi di citometria di flusso. (B) Lo schema riassume le principali procedure di digerire le biopsie per citometria a flusso. (C) Il grafico mostra la correlazione del rendimento delle cellule e la vitalità, come valutato dal conteggio manuale e Trypan blu esclusione (n = 20). (D) cella singola sospensioni dalla biopsia digeriti sono stati analizzati mediante citometria di flusso e valutati per la vitalità e l'espressione di CD45 (antigene leucocitario comune). La citometria a flusso grafico mostra un donatore rappresentante su 20 soggetti sani. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Identificazione del polmone sottoinsiemi di cellule dendritiche in digerito Biopsies. (A) strategia di gating per l'identificazione di CD1c + e CD141 + DC mieloidi (MDC) e DCS plasmacitoidi (PDC) nel tessuto della mucosa polmonare. La citometria a flusso trame da un soggetto rappresentante sono mostrati. (B) I grafici a punti mostrano l'espressione del CD103 integrina sulle popolazioni di DC nelle biopsie polmonari (pannello di sinistra), lavaggio broncoalveolare (pannello centrale), e del sangue periferico (pannello di destra). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo documento descrive come generare una caratterizzazione spaziale e fenotipica dettagliata del polmone DC tessuti residenti negli esseri umani sani utilizzando immunoistochimica e citometria a flusso su biopsie della mucosa endobronchiali raccolti durante la broncoscopia. Nei paragrafi seguenti passaggi critici nel protocollo sono discusse in dettaglio.
I passaggi critici con il protocollo
Sezionamento e immunoistochimica: E 'fondamentale per mantenere i blocchi di biopsia a -20 ° C quando non li utilizzano (passo 2,5). blocchi caldi a volte può diventare morbida e non saranno sezione pure. Inoltre, mantenendo i blocchi a -20 ° C conserverà siti antigenici e risultare in una migliore colorazione immunoistochimica utilizzando.
Sezioni e immunoistochimica: Quando sezionare le biopsie GMA-embedded, è conveniente avere 3-4 contenitori di acqua ammoniaca disponibili a galleggiare sezioni su. Quando una sezione viene raccolto, make sicuri di sostituirla con una sezione fresca (passo 3.4). Ciò garantisce che, dal momento che la sezione è gestita nuovo, sarà stato galleggia sull'acqua ammoniaca per circa la corretta lunghezza di tempo (45-90 sec), che aiuta nella presentazione dell'antigene e la successiva immunoistochimica. Taglio 2 sezioni micron in questo modo consente anche di sezionamento consecutivi, il che significa che la stessa cellula può potenzialmente essere trattata con diversa superficie cellulare o marcatori intracellulari. È importante non toccare il bordo tagliente della lama vetro quando sezionamento, come è facilmente danneggiato. Se c'è detriti dalla lama che deve essere rimosso, sempre spazzare via dal tagliente.
digestione enzimatica e citometria a flusso: in campioni di tessuto in cui le cellule immunitarie sono rari, è fondamentale per comprendere CD45 nel pannello colorazione flusso in primo luogo identificare leucociti (in minoranza) prima DC ulteriore elemento di identificazione o di altre cellule immunitarie di interesse. Inoltre, "fcontrolli luorescence meno uno "o isotipo sono fondamentali per comprendere durante la convalida dei pannelli di anticorpi utilizzati per garantire che gli eventi rari sono vere segnale su rumore.
Modifiche e risoluzione dei problemi
Sezioni e immunoistochimica: Per la maggior parte marcatori cellulari espressi dalle cellule immunitarie, tessuto tonsillare può essere utilizzato come un buon controllo positivo e titolazione anticorpi per immunoistochimica per evitare sprechi limitata materiale bioptico endobronchiale (fase 4). Per visualizzare i processi dendritiche di DC, tessuti possono essere sezionate parallelamente all'epitelio, piuttosto che perpendicolarmente attraverso la mucosa 21. Altri substrati perossidasi possono essere utilizzati in aggiunta a AEC, come DAB, se l'utente richiede un colore diverso substrato. Il complesso enzimatico avidina / biotina può anche essere sostituito, per esempio, con fosfatasi alcalina.
digestione enzimatica e citometria a flusso: Anche se alla finebiopsie obronchial sono piccole, le cellule del tessuto residenti sopravvivono alla digestione enzimatica e la trasformazione in una cella singola sospensione di analisi citofluorimetrica (Figura 3). Tuttavia, è importante valutare il potenziale impatto degli enzimi sulle macchie utilizzati nella citometria a flusso pannello di anticorpi. Per verificare se le si unirà protocollo digestione enzimatica off, altera, o interferisce con la colorazione anticorpi, più facilmente accessibili le cellule che esprimono i marcatori simili, come le cellule mononucleate del sangue periferico, possono essere trattati con gli enzimi digestivi (fase 6) o meno, e loro può successivamente colorate con fluorescente anticorpi e analizzate mediante citometria di flusso (punto 7). Se la collagenasi e DNasi non interferiscono con la disponibilità di antigene, le macchie con o senza trattamento delle cellule con enzimi dovrebbero simile. Inoltre, questo può essere verificata utilizzando sia citofluorimetria, nonché intatta sezioni di tessuto e immunoistochimica (Figure 2 - 3) 19.
LIMITI DELLA TECNICA
Broncoscopia: La maggior parte sana individui tollerano una broncoscopia bene, ed è un metodo di routine utilizzato per esaminare e assaggiare i polmoni, tra cui quello di raccogliere le biopsie della mucosa endobronchiali, come descritto qui (fase 1). Tuttavia, broncoscopia non è tipicamente un metodo adatto a svolgere per campionamento longitudinale, essendo spesso percepito come disagio, ed è anche un procedimento tempo e risorse esigenti. Pertanto, biopsie endobronchiali forniscono solo un'istantanea delle cellule immunitarie presenti nel tessuto della mucosa polmonare in un dato momento, piuttosto che uno studio a lungo termine delle variazioni dinamiche o cinetiche.
Importanza della tecnica con rispetto agli attuali metodi alternativi /
Sezionamento e immunoistochimica: Il vantaggio di incorporare in GMA piuttosto che di paraffina o crioconservazioneè la conservazione superiore della morfologia e antigeni, e maggior numero di sezioni dalle piccole biopsie, a causa di sezioni sottili che possono essere ottenuti 17.
digestione enzimatica e citometria a flusso. Con l'ottenimento di cellule singole da piccole biopsie, molte più informazioni può essere raggiunto con multicolore citometria a flusso.
Le applicazioni future o Indicazioni Dopo aver imparato questa tecnica
Questo protocollo descritto due metodi paralleli per massimizzare le informazioni che possono essere ottenute da piccole biopsie endobronchiali combinando immunoistochimica e citofluorimetria. Per caratterizzare la distribuzione spaziale delle cellule immunitarie rari come DC, biopsie possono essere incorporati in GMA per ottenere sezioni sottili per immunoistochimica, mentre per distinguere DC da altre cellule del sistema immunitario con marcatori simili, la digestione enzimatica delle biopsie permette citometria a flusso multi-colore per essere performed. Per permettere l'identificazione imparziale delle caratteristiche innovative di DC durante l'infiammazione o la malattia, l'analisi automatizzata dei dati di citometria a flusso può essere effettuata mediante l'applicazione di algoritmi di estrazione funzione 22. Le applicazioni future includono l'utilizzo di queste singole cellule per l'ordinamento delle cellule di raccogliere specifiche popolazioni cellulari che possono essere utilizzati per il sequenziamento di RNA o di profilazione trascrittomica. L'identificazione delle DC residenti nei polmoni può essere importante per comprendere i cambiamenti nel paesaggio immunitario in salute e malattia.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare i volontari che hanno contribuito materiale clinico a questo studio. Siamo anche grati al personale presso il Dipartimento di Sanità Pubblica e Medicina Clinica, Divisione di Medicina / Medicina Respiratoria, Ospedale Universitario, Umeå (Norrlands Universitetssjukhus) per la raccolta di tutto il materiale clinico.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a AS-S dal Consiglio svedese della ricerca, la Fondazione svedese cuore-polmone, la Fondazione svedese per la ricerca strategica, e il Karolinska Institutet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20 mm x 27 mm |
| Glucose 25% | 500 ml intravenous | ||
| Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
| Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o | Can be used for extra relaxation | ||
| Lidocaine, 40 mg/ml | Mouth and throat administration / Gargled | ||
| Lidocaine 100 mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
| Lidocaine 20 mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
| GMA processing and embedding | |||
| Glass vials | 5 ml | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Molecular sieves, 4 Å | Alfa Aesar | 88120 | 3-4 mm diameter pellets |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035 g/100 ml acetone |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37 g/100 ml acetone |
| Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | 500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
| Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8 mm capsules |
| JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
| Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6 mm |
| GMA sectioning | |||
| Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
| Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
| Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
| Vice | |||
| Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%) |
| Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
| Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
| GMA Immunohistochemistry | |||
| Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
| Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
| Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
| Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
| Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
| Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Drying oven | |||
| DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
| Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
| Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Enzymatic digestion | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Flow cytometry | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
| FlowJo | FlowJo | Software for analysis | |
References
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