本文介绍了一种在分离神经元细胞前对其进行分类，并对单细胞转录组进行后续表征的组合方法。该方案优化了样本制备流程，以确保RNA测序（RNA-Seq）的成功，并描述了一种专门用于深入理解细胞多样性的方法学。
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摘要
摘要
发现细胞类型特异性标记物有助于揭示细胞功能以及细胞异质性的起源。随着近年来对神经元多样性理解的不断深入，鉴定那些表达模式可定义不同细胞亚群的基因显得尤为重要。视网膜是研究中枢神经系统多样性的理想模型，因其包含多种主要的细胞类型。对每一类主要视网膜细胞的研究已鉴定出若干遗传标记物，有助于识别这些细胞群体。然而，在每一类主要视网膜细胞中均存在多个细胞亚型，尽管许多亚型已通过形态学或功能特征得以表征，但其中仅有少数具有已知的遗传标记物。若能明确各视网膜细胞亚型的遗传标记物，将有助于研究和绘制与特定视觉功能相关的脑区投射图谱，同时也可能揭示维持细胞多样性的基因调控网络。目前用于鉴定亚型遗传标记物的方法存在局限性，例如在测序完成后才进行细胞类型的分类，这给数据分析带来挑战，并需要严格的验证手段以确保聚类结果中的细胞具有相同的功能属性。我们提出一种在细胞分离与测序前即确定其形态学特征和功能属性的技术，从而更易于识别亚型特异性的标记物。该技术可拓展应用于非神经元细胞类型，以及具有微小变异的稀有细胞群体。本实验方案可获得高质量的数据，许多文库对单个细胞的测序深度超过2000万条读长。该方法克服了单细胞RNA测序（Single-cell RNA-Seq）中的诸多障碍，适用于希望以简便高效的方式对细胞类型进行图谱绘制的研究人员。
引言
在整个中枢神经系统中都可以观察到神经元的多样性，尤其是在脊椎动物的视网膜中。视网膜是一种高度特化的组织，由1种胶质细胞和6种神经元细胞类型组成，这些细胞均起源于同一群视网膜前体细胞1,2,3。许多细胞亚型可以通过其功能、形态和遗传特征进行分类。本实验方案的目标是将细胞类型的遗传变异与其可识别的功能和/或形态特征联系起来。目前已发现多个可用于细胞分类的基因，但仍有许多亚型尚未被充分表征，因为它们在整体细胞群体中仅占很小比例。鉴定这些特定亚型中的基因将有助于更深入理解视网膜内神经元的多样性，并可能为其他部位神经细胞的多样化机制提供线索。此外，单细胞研究能够揭示以往因在整体群体中占比极低而被忽视的新细胞类型4,5,6,7。
单细胞转录组学的优势之一在于能够发现定义特定细胞亚型的独特标志物或标志物组合。这些标志物随后可用于获得对该细胞类型的遗传操作权限，以进行各种干预。例如，我们正在使用本方案来鉴定表达感光色素黑视蛋白（melanopsin）的一类视网膜神经节细胞的细胞类型特异性基因。在表达黑视蛋白的视网膜神经节细胞中使用荧光标记物，使得研究这些细胞成为可能，因为它们由于表达已知基因而聚集在一起。有趣的是，在小鼠视网膜中目前已知存在这类细胞群体的五种亚型8。因此，为了从每种类型的细胞中分离RNA，我们在转基因模型中利用已建立的形态学分类方法，在细胞分离前识别每种亚型。该技术不仅能够对细胞进行表征，还可直接从视网膜中分离细胞，而无需进行组织解离，从而避免可能引发的细胞应激反应以及因树突被切断而导致的污染9。
近年来，随着RNA-Seq技术的不断发展，涌现出大量新技术。这些工具可在解决特定科学问题时实现细胞获取的最大化，并提高成本效益4,7,10,11,12,13。然而，尽管这些技术已为研究提供了良好的基础，但在实际操作中仍存在若干挑战，而本实验方案能够有效应对这些问题。首先，目前许多实验流程均从解离的组织中分离细胞，并依赖事后进行的主成分分析或层次聚类来确定细胞分类。依赖这些工具对细胞亚型进行分类可能无法获得可靠结果，还可能迫使研究者寻找新的方法来验证基因标记物与功能细胞类型之间的相关性。此外，其他方案中所需的组织解离步骤有时会造成组织损伤，导致神经元突起被切断，从而可能引起mRNA的丢失。同时，在解离后的细胞制备过程中，细胞的应激反应可能已经开始影响其转录组14。本方案通过在细胞分离前即确定其功能细胞类型，并在操作过程中保持视网膜组织的完整性，从而更好地维持细胞的生理状态，克服了上述难题。
2014年提出了一种技术，该技术包括对活细胞转录组进行体内分析15。尽管该技术能够在对组织机械损伤最小的情况下检测转录组，但在分析其转录组之前，若不使用特定的报告基因小鼠，则无法对组织内特定细胞类型进行分类。我们的方案不需要特定的报告基因小鼠，因为我们利用细胞填充和电生理学方法在细胞分离前对其进行表征。此前这一方案的另一个局限性在于，它需要特定波长的光来激活光激活元件，而我们的方案则可使用荧光报告蛋白和荧光染料，这些试剂易于获得，也可由各实验室根据需要自行选择。此外，其他实验室已将电生理学与转录组学方法结合，用于研究细胞多样性。在细胞分离前，利用膜片钳记录来表征细胞功能的方法已在解离的神经元上实现16，在某些情况下还结合了微阵列分析技术17。然而，这些方法同样面临类似的问题，即需要对组织进行解离，或依赖微阵列技术，而后者需要将样本与现有的探针进行杂交。最近的一项重要进展是Patch-Seq技术的开发，该技术结合膜片钳记录与RNA-Seq技术，用于研究全脑切片中的细胞18。尽管该技术与本文所述方案具有相似之处，但仍需强调的是，我们的方法能够保持组织的完整性，从而有利于细胞的健康状态。本文中，我们提出了一种优化该联合策略的实验方案，可生成高质量的单细胞文库，用于RNA-Seq分析，以实现高测序深度和高比对覆盖率。
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方案
所有实验程序均经西北大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。
1. 电生理实验溶液的配制（4 小时）
- 制备 0.1% DEPC 处理的 H2通过将1 mL焦碳酸二乙酯（DEPC）加入999 mL反渗透纯化的H₂O中制备0.1%（v/v）DEPC处理水2O. 充分混匀，室温（RT）孵育1小时。随后，对DEPC处理的H2O 在液体循环中处理 15 分钟。让经 DEPC 处理的 H2室温下冷却。
- 通过将一瓶 Ames 培养基与 1.9 g（23 mM）碳酸氢钠混合至 1 L H₂O 中，配制细胞外溶液2O. 用氧气饱和细胞外液
95% O2/5% CO₂2 并将其维持在 pH 值为 7.3-7.4. - 通过将 125 mM K-葡萄糖酸盐、2 mM MgCl₂2，10 mM EGTA，10 mM HEPES 和 0.1% DEPC 处理的 H2O. 以1 mL分装量保存于-20 °C。每次实验开始时加入10 µM荧光示踪剂。
- 将10,000单位的胶原酶和83 mg的透明质酸酶加入4.15 mL细胞外溶液中，配制酶溶液。酶溶液应分装为50 µL每份，于-20 °C保存。
2. 视网膜组织的制备（2 小时）
注意： 本节所有操作均应在红光下进行
- 在解剖前至少将动物暗适应1小时。所有操作均在微弱红光下进行。
- 采用CO2窒息法处死动物，并将眼球摘除至含有预先氧合的细胞外液的培养皿中。
- 用针刺破角膜，并在角膜与巩膜交界处使用眼科剪将角膜剪除19。
- 使用#5镊子移除晶状体。用镊子轻轻撕开巩膜，并在视网膜与巩膜连接处切断视神经。小心地将巩膜从视网膜上完全剥离。
- 使用#5镊子去除透明的玻璃体；去除后，玻璃体会呈现为黏附在镊子上的凝胶状物质。将视网膜切成两半（每只动物得到4片），并将其保存在含氧的细胞外液中，室温下待用。
- 当准备将组织装入记录室时，取一片视网膜置于500 µL含氧细胞外液稀释的酶溶液中孵育。在摇床上室温孵育2分钟。
- 用含氧的细胞外液清洗视网膜组织，然后将其放入玻璃底记录室中；使用切去尖端的塑料移液管，以便转移视网膜时避免对组织造成损伤。
- 用镊子小心地将组织展平，使感光细胞层朝下。用移液管吸除多余液体，并使用带尼龙网的铂金环固定组织。
注意：该方法也可用于制备标记的无长突细胞和双极细胞以提取RNA。 - 向记录室中加入含氧的细胞外液，并将其安装到显微镜载物台上。以2–4 mL/min的速度持续灌注含氧的细胞外液。
3. GFP+ 视网膜神经节细胞的可视化与靶向（10 分钟）
注意： 本节所有操作均应在红光下进行
- 开始前，使用拉针仪将玻璃毛细管（外径：1.2 mm，内径：0.69 mm）拉制成用于电生理记录的玻璃微电极。电极制备采用以下程序（请注意：参数需根据所需阻抗进行相应调整，不同拉针仪及不同玻璃材质下参数可能有所差异）：加热：斜升 +10；拉力：0；速度：23；延迟：1；气压：500；程序循环：5 次。确保电极尖端直径约为 1 µm，用于记录大细胞时阻抗为 2–4 MΩ，用于记录小细胞时阻抗为 5–7 MΩ。
- 使用红外微分干涉差（IR-DIC）显微技术观察神经节细胞层（图1A). 使用落射荧光（~480 nm）鉴定GFP+视网膜神经节细胞（RGCs）图1B).
- 在微分干涉差（DIC）显微镜下定位装有细胞内液的移液管。施加轻微正压，并将放大器上的任何电压偏移调零。
- 将玻璃微电极轻压至GFP+细胞表面，并施加负压，以在电极与细胞膜之间形成吉欧（GΩ）级密封。施加测试电压指令阶跃例如， 5 mV）以监测封接电阻。形成稳定封接后，施加短暂的负压脉冲破裂细胞膜，从而获得全细胞记录模式。
- 等待1-2分钟，使细胞的树突充分填充荧光示踪剂。
注意：可通过在落射荧光显微镜下观察细胞形态来进行形态学分类图1C）。对于表达黑视蛋白的视网膜神经节细胞（RGCs），通过在落射荧光照明下观察被荧光示踪剂标记的树突，并确定其树突是否远离胞体分布在内丛状层的OFF亚层（M1型ipRGCs），或靠近节细胞层分布在ON亚层（M2型ipRGCs），即可可视化其在内丛状层中的树突分层特征。 & M4 ipRGC），或两者兼有（M3 ipRGC）。该特征结合胞体大小（M4的胞体明显大于其他所有ipRGC亚型），可用于鉴定细胞类型20,21,22因此，该技术可用于鉴定细胞类型 体外 在RNA提取之前。该方法可针对涉及树突形态或细胞生理学的其他细胞类型鉴定方案进行修改。
4. 细胞分离（2 分钟）
- 开始前，将台式微型离心机设置为 2,000 x g。通过将管道（外径：3/32 英寸，内径：1/32 英寸）连接至 1 mL 注射器，制备样品排出装置。
- 将含有 10 µL 裂解缓冲液和 1% β-巯基乙醇的 0.2 mL PCR 管置于冰上。准备一支含有经 DEPC 处理的 H2O 的 1 mL 注射器，用于冲洗移液器吸头。准备一个干冰容器，用于在样品采集后迅速冷冻裂解缓冲液。
- 使用 10 mL 注射器施加负压，小心吸取细胞吸管中的胞质内容物；应尽可能吸出全部胞质内容物，包括细胞器。
- 通过微分干涉差显微镜（DIC）观察细胞体积缩小，以监测提取过程。在吸出胞质内容物后，小心地将吸管从组织上提起，并迅速将其从溶液中取出。
- 迅速将吸管从头部支架上取下，并使用 1 mL 注射器以经 DEPC 处理的 H2O 短暂冲洗吸管尖端。通过紧密连接的管道将吸管与 1 mL 注射器相连，以排出样品。
- 立即将细胞排入含有 1% β-巯基乙醇的 10 µL 裂解缓冲液 1 中，该缓冲液置于 0.2 mL PCR 管内。
注意：应轻柔地将全部吸取物连同细胞完全排出，避免产生气泡。- 在台式小型离心机中以 2,000 x g 短暂离心 10 秒。立即在干冰上快速冷冻样品 5 分钟。冷冻后，为获得最佳效果，可将样品在 -80 °C 保存最多两周；样品可能保存更久，但建议尽快处理。
5. RNA 纯化（30 分钟）
- 开始前，将倒置的 P20 或 P200 吸头盒顶部用胶带固定在 96 孔磁力架上，以搭建磁性分离装置23。
- 新鲜配制 70% 乙醇（EtOH）——每份样品约需 1 mL。将 RNA 磁珠从 4 °C 取出，在室温下解冻至少 30 分钟。
注意：每次处理的样品数不应超过 8 个，因为本方案中的多个步骤依赖于操作效率和快速处理。 - 磁珠达到室温后，涡旋振荡 30 秒，确保溶液充分混匀。
注意：这些磁珠使用特异性结合 RNA 的缓冲液，可在磁力板架上选择性结合 RNA，并去除其他细胞杂质。 - 在室温下解冻细胞 1 分钟，然后向每个样品中加入 5 µL 无 RNase 的 H2O，上下吹打混匀。向每管中加入 22 µL RNA 磁珠，充分吹打混合。室温孵育 5 分钟，使 RNA 与磁珠充分结合。
- 将试管置于磁性分离装置上，静置 8 分钟；在继续操作前，确认上清液已澄清。观察单个磁珠沉淀，确保在移液过程中不将其脱离。
- 吸除样品中的上清液，加入 150 µL 70% EtOH。去除乙醇后，重复洗涤两次。
- 让样品在空气中干燥 6 分钟。期间间歇检查管底是否残留乙醇，并及时去除。
- 在样品干燥过程中，通过混合 19 µL 裂解缓冲液 2 和 1 µL RNase 抑制剂（40 U/µL）配制 10X 反应缓冲液。短暂离心后置于冰上保存。
- 当样品完全干燥且磁珠沉淀不再呈现光泽时，将试管从磁性分离装置上取下，加入 9.5 µL 无 RNase 的 H2O 以重悬样品。将样品置于冰上，再向每份样品中加入 1 µL 10X 反应缓冲液。
6. 逆转录（10 分钟）
注意：实验开始前，将反转录（RT）所需的试剂（除酶以外）置于冰上解冻。这些试剂包括：引物II、缓冲液1、寡核苷酸和RNase抑制剂。
- 向每个试管中加入 2 µL 引物 II（AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30)N-1N，其中 N-1 可为 A、C 或 G，N 可为 A、C、G 或 T；12 µM）。将试管放入已预热至 72 °C 的热循环仪中，孵育 3 分钟。
- 在孵育期间，配制反转录主混合液。每项反应中加入 4 µL 缓冲液 1（250 mM Tris-HCl，pH 8.3；375 mM KCl；30 mM MgCl2）、1 µL 寡核苷酸（48 µM）和 0.5 µL RNase 抑制剂（40 U/µL）。
- 孵育结束后，立即将试管置于冰上冷却 2 分钟。
- 向主混合液中每项反应加入 2 µL 反转录酶（100 U/µL），并用移液器充分混匀。向每个试管中加入 7.5 µL 主混合液，轻轻吹打混匀。短暂离心以将液体收集至管底，然后将试管放入预热的热循环仪中，运行以下程序：42 °C 反应 90 分钟，70 °C 反应 10 分钟，最后在 4 °C 保存。
- 可将试管于 -20 °C 过夜保存后再继续后续操作，但建议在长期保存前先完成扩增步骤；其他文献建议此步骤也可在 4 °C 过夜保存24。
7. cDNA 扩增（2.5 小时）
注意：开始之前，将 PCR 缓冲液和 PCR 引物在冰上解冻，并在配制 PCR 大体系之前，使用台式小型离心机离心收集管壁液体。
- 每个反应中，准备PCR预混液，包含25 µL PCR缓冲液、1 µL PCR引物（12 µM）、1 µL DNA聚合酶和3 µL无核酸酶的H2O。在将预混液加入样品前，最后加入DNA聚合酶。
- 向每支试管中加入30 µL预混液，并在2,000 × g下离心10秒，使内容物沉降至试管底部。
- 将试管放入预热的PCR仪中，运行以下程序：95 °C 预变性1分钟；34个循环（98 °C 变性10秒、65 °C 退火30秒、68 °C 延伸3分钟）；72 °C 延伸10分钟；然后在4 °C 保存。
注意：本PCR的循环次数已增加至34次，与试剂生产商建议的循环数不同。经过多次重复测试，该循环数可稳定产生可靠结果。 - 将试管在-20 °C保存，最长可保存一年后再进行后续操作。
8. 扩增后 cDNA 的纯化（30 分钟）
- 开始纯化前，将DNA磁珠和洗脱缓冲液置于室温至少30分钟。配制新鲜的80%乙醇，每份样品准备1 mL即可。向每份样品中加入1 µL的10X裂解缓冲液。
- 涡旋振荡DNA磁珠30秒，然后向每份样品中加入50 µL DNA磁珠。用移液器充分混匀后，在2,000 × g下短暂离心10秒。将离心管在室温下孵育8分钟。
- 将离心管置于磁力分离装置上静置5分钟。轻轻吹打上清液上下混合两次，再静置2分钟。在样品仍处于磁力架上时，吸除上清液并弃去。
- 向每份样品中加入150 µL新配制的80%乙醇，室温静置30秒。吸除乙醇后，重复乙醇洗涤一次。
- 短暂离心样品后，重新放回磁力分离器上静置1分钟。吸除残留的乙醇，并让样品在空气中干燥5分钟。
- 间歇性检查样品，观察是否有乙醇积聚，并用移液器吸除。
- 当磁珠沉淀不再呈现光泽（但尚未出现裂纹）时，将离心管从磁力分离器上取下，加入17 µL洗脱缓冲液。轻轻吹打上下混合，彻底重悬磁珠。
- 将重悬后的样品在室温下孵育2分钟。
- 短暂离心以使液体全部收集至管底，再将离心管置于磁力分离器上静置2分钟。转移15 µL澄清上清液至一个1.5 mL无RNase的离心管中，并于-20 °C保存。
- 使用高灵敏度生物分析仪芯片检测cDNA文库的质量和片段大小，上样量为1 µL cDNA。理想的cDNA文库片段大小为0.3–2 Kb，浓度至少为10 ng/µL（图2）。
注意：在继续样品制备之前，可选择使用PCR方法对样品进行筛选，以确认已知标志物的表达。
9. 测定浓度并片段化 cDNA（20 分钟）
- 开始前，将检测试剂、稀释缓冲液和标准品置于室温下平衡30分钟。每反应配制含有1 µL检测试剂和199 µL稀释缓冲液的主混合液。取199 µL该混合液分装至500 µL检测管中。加入1 µL样品，充分混匀。
- 将190 µL主混合液分装至1号管中 & 2. 向1号管中加入10 µL标准品1，向2号管中加入10 µL标准品2。将所有样本管和标准品管涡旋振荡5秒，在室温下孵育3分钟。
- 使用高灵敏度荧光计测定样品浓度。通过选择正确的样品输入量以确保样品量准确 "计算储备液" 选项和高亮显示 "1 µL". 在单独的1.5 mL离心管中将每个样本稀释至终浓度为0.2 ng/µL，溶剂为无RN酶的H2O.
注意：尽管制造商的说明建议起始使用总量为1 ng/µL的DNA，但我们采用了更少的起始量，并对实验步骤进行了相应调整以适应此修改。 - 在新的 0.2 mL PCR 管中，加入 2.5 µL 缓冲液 2。向相应的管中加入 1.25 µL cDNA，使总量达到 250 pg。最后，向每管中加入 1.25 µL 标签化混合物，并充分吹打混匀；标签化混合物中的转座酶将 DNA 切割成短片段，并在每条片段的两端连接接头，供测序仪器后续使用。
注意：用于标签化（tagmentation）和索引连接（index coupling）的体积仅为制造商说明书建议用量的一部分。这不仅有助于节约试剂，而且根据我们的经验， consistently 能够获得良好的标签化样本。 - 在台式微量离心机中离心试管1分钟。
- 将试管置于预热的热循环仪中，按照以下程序运行：55 °C 反应 10 分钟，然后在 10 °C 保存。
注意：此孵育时间长度为10分钟，与制造商建议的5分钟不同。 - 此程序一结束，立即取出离心管，向每管中加入1.25 µL的片段化反应终止缓冲液。充分吹打混匀，室温孵育5分钟。请迅速完成此步骤，因为转座酶在缓冲液中和酶活性并终止反应前仍保持活性。
10. 指数耦合与纯化（1 小时）
注意：实验开始前，将DNA磁珠和重悬缓冲液置于室温至少30分钟。确定每个样本所使用的索引。
注意：这些索引将连接到片段化 DNA 的相应 5' 和 3' 末端，以便在测序后识别样品。确保可能一起测序的样品之间没有相同的索引组合。例如，如果样品 1 使用白色索引 1 和橙色索引 1，则样品 2 应使用白色索引 1 和橙色索引 2，或白色索引 2 和橙色索引 2，但绝不能使用相同的索引组合。该试剂盒包含 4 种不同的白色索引和 6 种不同的橙色索引。所有不同的组合方式最多允许将 24 个样品混合于一个测序通道中。尽管我们通常每个通道仅混合 10 个样品，但也可以使用包含 24 种索引的试剂盒，这样最多可在单个测序通道中混合 96 个样品，具体可根据需要选择。
- 向每个试管中加入 1.25 µL 的左侧index和 1.25 µL 的右侧index（针对该特定样本），再加入 3.75 µL 的PCR主混合液，并用移液器充分混匀。
- 在台式微量离心机中离心 1 分钟。
- 将试管放入预热的热循环仪中，运行以下程序：72 °C 保温 3 分钟；95 °C 保温 30 秒；进行 12 个循环（95 °C 10 秒、50 °C 30 秒、72 °C 1 分钟）；72 °C 延伸 5 分钟；最后在 4 °C 保存。
注意：第一步的 95 °C 取代了试剂盒说明书建议的 98 °C。此外，循环参数已作调整，以确保我们的样本获得最佳的片段化（tagmentation）效果。最终的 72 °C 延伸步骤为本方案自行添加，未包含在试剂盒说明书中。 - 短暂离心以使管内液体沉降至管底。将DNA磁珠涡旋振荡 30 秒，然后向每管中加入 30 µL，并通过移液充分混匀。
- 在室温下孵育样本 5 分钟。
- 将样本置于磁力架上 2 分钟。用移液器将上清液上下吹打两次，继续孵育 1 分钟。
- 移除并弃去澄清的上清液。向每个样本中加入 150 µL 80% 乙醇，随后弃去。重复乙醇洗涤一次。
- 让样本在空气中干燥 10 分钟。期间应不时检查是否有乙醇积聚在管底，并根据需要予以清除。
- 当DNA磁珠沉淀开始出现裂纹时，将样本从磁力架上取下，加入 27.5 µL 重悬缓冲液以重新水合沉淀。确保沉淀完全重悬后，在室温下孵育 2 分钟。
注意：重悬缓冲液的体积已根据本方案起始材料量较少的情况进行了调整，与试剂盒说明书建议的体积不同。 - 将试管置于磁力架上 2 分钟。将 25 µL 澄清上清液转移至无RNase的试管中，于 -20 °C 保存。
注意：无需继续按照试剂盒说明书进行文库标准化操作。样本在此步骤后已成功制备，可直接用于测序。 - 使用生物分析仪芯片及每个样本 1 µL 样品分析样本的片段化情况。
注意：条带分析方法与之前相同；但此时cDNA应在 0.2–1 Kb 的大小范围内被检测到（图 3）。低于该范围的弥散条带可能表示样本降解，而更大的弥散条带则提示片段化不完全。
11. 样本合并（10 分钟）
- 使用之前获得的高灵敏度荧光计测定标签化片段样品的浓度，并确定其以 nM 为单位的浓度。
注意：该计算可借助网络转换工具完成，需依据生物分析仪图谱中的平均片段长度。要确定平均片段长度，需单独观察每个样品的图谱，判断平均 DNA 片段的大小。也可在分析生物分析仪图谱时，通过选中弥散条带的范围，并查看软件计算出的摩尔浓度来获得此值。 - 将各样品混合，使混合池中各样品的浓度相同。不要稀释样品；混合池的稀释程度不应超过浓度最低的样品，理想情况下总浓度应至少达到 15 nM。
- 在测序前将混合后的样品储存于 -20 °C；建议在混合后 1 周内完成测序。使用 HiSeq 平台进行双端 100 bp 测序。
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结果
通过染料注射后可轻松对细胞类型进行分类
图1 显示了一个GFP+ RGC在荧光示踪剂填充前后的示例。该细胞是根据其在转基因品系中表达GFP而鉴定的图1A). 使用拉制的细尖玻璃电极与该细胞的胞体形成紧密封接。为了鉴定其亚型，将荧光染料注入胞体，并使其充分填充所有相关突起结构（图1B）。通过观察发现该细胞具有非常大的胞体，且其突起终止于内丛状层的ON亚层，因此可将其归类为M4型ipRGC。图1C）。为了说明在分离的视网膜制备样本中可分辨的不同分层模式，我们使用荧光示踪剂标记了M1型（OFF分层）、M3型（双分层）和M4型（ON分层）的内在光敏性视网膜神经节细胞（ipRGCs），固定后对ON和OFF亚层进行了共聚焦成像图1D）。通过共聚焦成像对树突进行的这种可视化观察，与未固定的树突形态非常相似...
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讨论
本方案通过一种快速且易于使用的指南，展示了一种制备特定形态学类别单细胞以进行高质量测序的方法，同时对样品造成的损伤极小。在本论文中，我们对内在光敏性视网膜神经节细胞进行了形态学表征、分离，并为其RNA测序做好准备。在视网膜操作过程中可能会产生细胞应激；因此，我们规定每块组织使用时间不超过4小时即予以更换。我们可通过电生理设备记录这些细胞的电活动并监测其反应，从而评估细胞状态，确保细胞处于良好健康状态。在处理的23个样本中，本方案成功构建了15个cDNA文库，成功率为65%。此外，测序数据质量优异，细胞中表达基因的平均数量范围为2,316至10,353个，平均有5,683个基因的FPKM值非零。这些数值与其他神经元研究中报道的表达基因数量相近5，表明我们的数据同样具有高质量。
尽管本方案在这些特定神经元上已取得成功，但应注意，对该技术进行少量修改后，可适用于多种不同应用。在另一个小鼠模型中使用荧光激活细胞分选仪（FACS），我们已从中枢神经系统中分离出少量标记有GFP的细胞群体（1,000–25,000个）。从这些细胞群体中提取RNA，...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Jennifer Bair 和 Einat Snir，以及爱荷华大学人类遗传学研究所，在样本制备和处理过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 艾姆斯培养基 | Sigma Aldrich | A1420-10X1L | |
| 碳酸氢钠 | Sigma Aldrich | S8875 | |
| K-葡萄糖酸盐 | Spectrum Chemical | PO178 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| 焦碳酸二乙酯（DEPC） | Sigma Aldrich | D5758 | |
| Alexa Fluor 594 肼 | Invitrogen | A10442 | |
| 胶原酶 | 沃辛顿生物化学 | LS005273 | |
| 透明质酸酶 | 沃辛顿生物化学 | LS002592 | |
| 培养皿（35 mm 直径） | 赛默飞世尔科技 | 153066 | |
| 眼科剪 | 精细科学工具 | 15000-00 | |
| #5 镊子 | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| 微孔板振荡器 | Fisher Scientific | 13-687-708 | |
| 玻璃微移液管 | Sutter | BF120-69-10 | |
| 微移液管拉制仪 | Sutter | P-1000 水平拉针仪 | |
| 1 mL 注射器 | Fisher Scientific | 14-823-2F | |
| 柔性管 | Fisher Scientific | 14-171 | |
| TCL 裂解缓冲液 | Qiagen | 1031576 | 裂解缓冲液1 |
| β-巯基乙醇 | Sigma Aldrich | M3148 | |
| 无RNase水 | Qiagen | 129112 | |
| 0.2 mL PCR管 | Eppendorf | 30124359 | |
| 乙醇，纯品 | Sigma Aldrich | E7023 | 乙醇 |
| 模拟旋涡混合器 | 赛默飞世尔科技 | 02215365 | 涡旋 |
| 迷你离心机 | 赛默飞世尔科技 | 05-090-100 | |
| Agencourt RNAClean XP 磁珠 | 贝克曼库尔特 | A63987 | RNA磁珠 |
| MagnaBlot II 磁力分离器 | Promega | V8351 | 磁力架 |
| 1.5 mL MCT 带刻度离心管 | 赛默飞世尔科技 | 05-408-129 | |
| Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA试剂盒 | Clontech | 634888 | 逆转录与PCR扩增试剂 |
| 10x 裂解缓冲液 | 裂解缓冲液2 | ||
| 5x 超低起始链缓冲液 | 缓冲液1 | ||
| 3' SMART-Seq CDS 引物 II A | 引物 II | ||
| SMART-Seq v4 寡核苷酸 | 寡核苷酸 | ||
| SMARTScribe 反转录酶 | 逆转录酶（RT） | ||
| 2x SeqAamp PCR缓冲液 | PCR缓冲液 | ||
| PCR 引物 II A | PCR 引物 | ||
| SeqAmp DNA聚合酶 | DNA聚合酶 | ||
| Mastercycler pro S | Eppendorf | 950030020 | PCR仪 |
| Agencourt AMPure XP 磁珠 | 贝克曼库尔特 | A63881 | DNA磁珠 |
| 2100 生物分析仪 | 安捷伦科技 | G2939AA | |
| HS Bioanalyzer芯片 &和试剂 | 安捷伦科技 | 5067-4626 | |
| Qubit HS 检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | Q32851 | 用于计算样品浓度 |
| Qubit 检测管 | 赛默飞世尔科技 | Q32856 | |
| Qubit 2.0 荧光仪 | 赛默飞世尔科技 | Q32866 | |
| Nextera XT DNA样本制备试剂盒 | Illumina | FC-131-1024 | 用于标签化片段化和索引连接的试剂 |
| TD缓冲液 | 缓冲液2 | ||
| ATM | 标签化混合液 | ||
| NT缓冲液 | 标签化中和缓冲液 | ||
| NPM | PCR预混液 | ||
| Nextera XT Index试剂盒 | Illumina | FC-131-1001 | Tagmentation指数 |
| N501 | 白色 1 | ||
| N502 | 白色 2 | ||
| N701 | 橙色 1 | ||
| N702 | 橙色 2 | ||
| HiSeq 2500 | Illumina | SY-401-2501 | 完成样本测序 |
参考文献
- Austin, C., Cepko, C. L. Specification of Cell Fate in the Vertebrate Retina. Neural Cell Specif. 3, 139-143 (1995).
- Masland, R. H. The Neuronal Organization of the Retina. Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).
- Rodieck, R. The First Steps in Seeing. , Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA. (1998).
- Chiu, I. M., et al. Transcriptional profiling at whole population and single cell levels reveals somatosensory neuron molecular diversity. Elife. 3, e04660(2014).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat. Neurosci. 19 (2), 335-346 (2016).
- Trapnell, C. Defining cell types and states with single-cell genomics. Genome Res. 25 (10), 1491-1498 (2015).
- Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Schmidt, T. M., Do, M. T. H., Dacey, D., Lucas, R., Hattar, S., Matynia, A. Melanopsin-Positive Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells: From Form to Function. J. Neurosci. 31 (45), 16094-16101 (2011).
- Eberwine, J., Miyashiro, K., Kacharmina, J. E., Job, C. Local translation of classes of mRNAs that are targeted to neuronal dendrites. Proc. Natl. Acad. Sci. 98 (13), 7080-7085 (2001).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat. Neurosci. 18 (1), 145-153 (2015).
- Poulin, J. F., Zou, J., Drouin-Ouellet, J., Kim, K. Y. A., Cicchetti, F., Awatramani, R. B. Defining midbrain dopaminergic neuron diversity by single-cell gene expression profiling. Cell. Rep. 9 (3), 930-943 (2014).
- Gross, A., Schoendube, J., Zimmermann, S., Steeb, M., Zengerle, R., Koltay, P. Technologies for Single-Cell Isolation. Int. J. Mol. Sci. 16, 16897-16919 (2015).
- Lovatt, D., et al. Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue. Nat Methods. 11 (2), 190-196 (2014).
- Qiu, S., et al. Single-neuron RNA-Seq: Technical feasibility and reproducibility. Front. Genet. 3 (124), 1-8 (2012).
- Subkhankulova, T., Yano, K., Robinson, H. P. C., Livesey, F. J. Grouping and classifying electrophysiologically-defined classes of neocortical neurons by single cell, whole-genome expression profiling. Front. Mol. Neurosci. 3 (10), 1-11 (2010).
- Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat. Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells. J. Vis. Exp. (47), e2367(2011).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 29 (2), 476-482 (2009).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Structure and Function of Bistratified Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells in the Mouse. J Comp Neurol. 519 (8), 1492-1504 (2011).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Differential cone pathway influence on intrinsically photosensitive retinal ganglion cell subtypes. J Neurosci. 30 (48), 16262-16271 (2010).
- Clontech Laboratories I. SMARTerTM Ultra Low RNA Kit for Illumina® Sequencing. , (2013).
- Trombetta, J. J., Gennert, D., Lu, D., Satija, R., Shalek, A. K., Regev, A. Preparation of single-cell RNA-Seq libraries for next generation sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol. 4 (22), 1-17 (2014).
- Ecker, J. L., et al. Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: Cellular diversity and role in pattern vision. Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).
- Schmidt, T. M., et al. A Role for Melanopsin in Alpha Retinal Ganglion Cells and Contrast Detection. Neuron. 82 (4), 781-788 (2014).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The Types of Retinal Ganglion Cells: Current Status and Implications for Neuronal Classification. Annu. Rev. Neurosci. 38, 221-246 (2014).
- Goetz, J. J., Trimarchi, J. M. Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons. J. Vis. Exp. , e3824(2012).
- Trimarchi, J. M., et al. Molecular Heterogeneity of Developing Retinal Ganglion and Amacrine Cells Revealed through Single Cell Gene Expression Profiling. J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).
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