Summary
Dit protocol beschrijft een schaalbare individuele grooming assay techniek in Drosophila die robuuste, kwantitatieve data levert om grooming gedrag te meten. De methode is gebaseerd op het vergelijken van het verschil in ophoping van de kleurstof op de lichamen van niet-verzorgde versus geklede dieren over een bepaalde periode.
Abstract
Drosophila grooming gedrag is een complex multi-step lokomotorisch programma dat gecoördineerde beweging van zowel voorbenen als achterpoten vereist. Hier presenteren we een verzorgingsprotocol en een nieuw kamerontwerp dat kostenefficiënt en schaalbaar is voor kleine of grootschalige studies van Drosophila grooming. Vliegen zijn over hun lichaam gestoffeerd met Brilliant Yellow kleurstof en geven de tijd om de kleurstof van hun lichamen in de kamer te verwijderen. Vliegen worden dan in een vast volume ethanol afgezet om de kleurstof te oplossen. De relatieve spectrale absorptie van kleurstof-ethanolmonsters voor verzorgde versus jongroomdieren wordt gemeten en opgenomen. Het protocol levert kwantitatieve gegevens van kleurstofaccumulatie voor individuele vliegen, die gemakkelijk kunnen worden vergeleken en vergeleken over monsters. Dit laat experimenteel ontwerpen toe om makkelijk te kunnen beoordelen van het rijgedrag voor mutante dierstudies of circuitmanipulaties. Deze efficiënte procedure is zowel veelzijdig als schaalbaar. Wij tonen wOrk-flow van het protocol en vergelijkende data tussen WT-dieren en mutante dieren voor de Drosophila type I Dopamine Receptor ( DopR ).
Introduction
Grooming in Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) is een robuust aangeboren gedrag dat de coördinatie van meerdere onafhankelijke motorprogramma's omvat 1 . Fruitvliegen reinigen hun lichamen van stof, microben en andere pathogenen die de normale fysiologische functie zoals visie en vlucht kunnen belemmeren, of leiden tot significante immuunuitdagingen. Bij het detecteren en reageren op zowel mechanische 2 als immuunactivering 3 vliegen vliegen herhaaldelijk hun benen samen of op een gericht lichaamsgebied totdat het voldoende schoon is en de verzorging vordert naar een ander deel van het lichaam. Vliegen verrichten verzorgingsbewegingen in verschillende uitingen die grotendeels voorkomen in stereotype patronen 1 , 4 . Een gedragshiërarchie wordt zichtbaar aangezien de verzorgingssignalen voorrang hebben. Circuits en patronen van de activiteit zijn geïdentificeerd in ondersteuning oFa model dat verzorgingsprogramma's bovenaan de hiërarchie eerst voorkomen en parallelle signalen onderdrukken van gebieden van het lichaam dat later worden verzorgd 5 . Hoogste prioriteit wordt gegeven aan het hoofd, dan de buik, de vleugels en tenslotte de thorax 5 .
Het verzorgingsprogramma in D. melanogaster is een ideaal systeem voor het bestuderen van neurale schakelingen, modulerende moleculaire signalen en neurotransmitters. Bijvoorbeeld, compromis van neurofibromine functie 6 , verlies van Drosophila fragiel X mentale retardatieproteïne ( dfmr1 ) 7 en blootstelling aan bisfenol A (BPA) 8 veroorzaken alles overmatige verzorging en ander gedrag dat analoog is aan discrete menselijke symptomen van neurofibromatose, fragiele X Syndroom, en aspecten van autismespektrum stoornissen en respectievelijk Aandacht-Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD). Grooming gedrag kan ook habitua zijnTed differentieel over mutante stammen 2 , lenend dit motorprogramma aan studies van gedragsplasticiteit. De breedte van neurologische verschijnselen die door Drosophila kunnen worden gemodelleerd, vraagt een nieuwe vergelijkende aanpak om de vliegen te kunnen bepalen om zelf te groomeren.
De gecombineerde werking van vesiculaire monoamine transporters en de relatieve overvloed aan dopamine en andere biogene aminen in het lichaam is aangetoond dat het vruchtenvliegverzorgingsgedrag 9 , 10 bemiddelt. Octopamine en dopamine stimuleren vergelijkbare hindleg grooming activiteit in decapitated vliegen, terwijl tyramine, de voorloper van octopamine, ook in mindere mate verzorgt 7 . Vier dopamine receptoren zijn geïdentificeerd in D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 DopR, dDA1, dom ) van type I-familie in het achterliggende verzorgingsgedrag 15 .
Grooming kan indirect gekwantificeerd worden door te kijken naar de mate van hygiëne waarmee een dier volledig kan versieren nadat het hele lichaam met een markeringsverf of fluorescerende stof 5 , 16 is gedroogd . De rest van het stof dat op het lichaam ligt, kan als relatieve marker voor het algemene gedrag worden gebruikt. Stofvliegen na het krijgen van voldoende tijd om te bruidegom, kan een specifiek tekort in het verzorgingsgedrag manifesteren. Als verzorgingsonderzoeken uitgebreider zijn, hebben protocollen dergelijke praktijken ingebracht als decapitatie om farmacologische behandelingen op de nekbinding zenuwen toe te voegen 10 , tactiele stimulatie van borstels om de verzorgingsrespons 2 op te wekken,En video-opname van gedrag 15 . Directe waarneming van verzorging kan gemakkelijk worden bestudeerd met behulp van visuele observatie en handmatig registreren van de frequentie en de duur van specifieke verzorgingsgebeurtenissen 4 .
We hebben een vijftien goed verzorgingskamer ontworpen die met een 3D-printer of lasersnijder kan worden geconstrueerd, en de blauwdrukontwerpen zijn beschikbaar voor reproductie 15 . Het ontwerp maakt gebruik van twee gecombineerde centrale platen met openingen die zijn aangepast en gescheiden door mazen en twee extra schuif- en onderplaten, waarvan respectievelijk vliegen en / of kleurstof zijn geladen. Nadat we de stoffige vliegen tijd hebben om te verzorgen, plaatsen we ze in ethanol om de kleurstof te oplossen en de absorptie van deze oplossing te meten op de golflengte van de kleurstof. Een plaatlezer kan gebruikt worden voor meerdere parallelle monsters of een afzonderlijke-lezen spectrofotometer kan voor individuele monsters worden gebruikt. Deze methode minimaliseert de fout veroorzaakt door handelen en alLaagtepunten voor grooming assays worden uitgevoerd op een kleinere, kostenefficiënte schaal. Deze methode is afgeleid en gemodificeerd uit de methoden die door Julie Simpson en Andrew Seeds worden gepresteerd, die grotere verzorgingskamers gebruiken met verwarmingselementen voor temperatuurgevoelige circuitmanipulaties 5 . Het volgende protocol toont de kwantificering van de verzorging van het hele lichaam en toont alternatieve methoden voor het kwantificeren van kleurstofopbouw op individuele lichaamsdelen. We presenteren ook steekproefvergelijkingsgegevens tussen WT- en DopR- mutanten, evenals methoden voor het berekenen van een eenvoudige prestatie-index voor verzorgingsgedrag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding
- Bereid een aspirator voor het verplaatsen van levende Drosophila van een kweek fles naar de verzorgingskamer. Aspiratoren laten overdracht van bewuste dieren toe aan de gedragskamers om ervoor te zorgen dat de narkose geen nadelige gedragswaarneming beïnvloedt.
- Gebruik een schaar, snijd 1,5 meter tygon tubing ID ⅛ ", OD ¼". Schakel tenminste 1 inch van de punt van een 1 ml wegwerp micropipet tip. Houd een 1 cm vierkante maaswijdte (opening 0.196 inch) over de snijpunt.
OPMERKING: De meeste 1mL tips hebben een gradatie lijn waar de tip zit in de verpakking, typisch gesneden aan die regel. - Plaats een frisse 1 ml micropipetpunt over de maas / snijpunt. Let op de maasvorm een strakke barrière tussen de twee tips. De binnenkant van de nieuwe tip creëert een houderkamer voor vliegen.
- Knip de extreem punt van de nieuwe micropipettip om de opening voldoende te verbreden om een enkele vlieg te laten passeren. De holE komt ongeveer overeen met de opening van de verzorgingskamer (ongeveer 1,5-2 mm in diameter).
- Zet de geneste tips goed aan het uiteinde van de Tygon-buis. Duw de tips in de buis om een strakke pasvorm te waarborgen om druk op de vacuüm mogelijk te maken.
- Aan het andere uiteinde van de buis snijdt u de punt van een 200 μL micropipetpunt en past het smalle snedeinde in de buis. Dit is de "mond" kant van de aspirator.
- Gebruik een schaar, snijd 1,5 meter tygon tubing ID ⅛ ", OD ¼". Schakel tenminste 1 inch van de punt van een 1 ml wegwerp micropipet tip. Houd een 1 cm vierkante maaswijdte (opening 0.196 inch) over de snijpunt.
- Bereid stof aliquot buizen. Weeg ongeveer 5 mg Brilliant Yellow kleurstof op geterd weegpapier. Giet het stof in een 0,6 ml microcentrifuge-buis en sluit de kap strak dicht.
OPMERKING: Wij adviseren het gebruik van nitrilhandschoenen tijdens de bereiding van de alikvoten, aangezien sommige latexhandschoenen doordringbaar zijn voor de kleurstof. - Herhaal stap 1.2) voor alle monsters in het experiment (één voor elke vlieg in elke kamer).
- Bereid ethanol (EtOH) buizen: Pipet 1 ml 100% EtOH in 1,5 ml microcentrifuge buizen. Labelbuizen voor genotypes of condities. </ Li>
- Herhaal stap 1.4) voor alle monsters in het experiment (één voor elke vlieg in elke kamer). Cap en sla de EtOH-buizen op voor het voltooien van de verzorgingstest. Bevat ook tenminste één "Leeg" monster dat alleen 1 ml EtOH zal zijn zonder een vlieg voor negatieve controles.
- Monteer elke verzorgingskamer door de glijdende bovenplaat (met de kleinere gaten) te schroeven, maar laat de bodemplaat (met de grotere gaten) verwijderd worden om stof toe te voegen.
- Plaats elke benodigde verzorgingskamer plat op een tafel met de bovenkant naar beneden. De vlieginvoerzijde is naar beneden gericht.
- Laad 5 mg Brilliant Yellow color-aliquot in elke kamer door de buis tegen het oppervlak van de kamer boven de gewenste put te tikken. Tik de kamer tegen de tafel om ervoor te zorgen dat alle stof door het gaas naar de bovenplaat vallen.
- Schroef de bodemplaat op elke kamer zodanig, dat de bredere uiteinden van de conische openingen naar buiten gericht zijn en de gaten niet over de putjes rusten. Bevestig de botTom plaat stevig zodat het niet glijdt en loslaat.
- Vouw de kamer over en klop het een paar keer plat tegen een tafel zodat het stof door het gaas valt om op de bodemplaat te rusten.
- Schuif de bovenplaat van de kamer in de "open positie" zodat de kleine gaten in lijn zijn met de vijftien putjes, zodat de vliegen in individuele putjes kunnen worden ingevoerd.
2. Vliegvuil en verzorging
- Laad een vlieg in de mondaspecteur door zachtjes door het ene uiteinde van de aspirator te zuigen alsof u een stro gebruikt. Plaats de vliegen door licht te blazen en de opening naar het doel te richten.
- Aspireer een vlieg in elke bron die gebruikt wordt voor het experiment. Na het laden van een put schuif de bovenplaat zodanig dat de vlieg in de kamer wordt gevangen en plaats de tape over de opening van die goed tijdens het laden van de hele kamer om te voorkomen dat de vlucht ontsnapt terwijl andere bronnen worden geladen. Als meerdere vliegen in een singl worden geoogstWel, laat die opening onbedekt verlaten tot er maar één vlieg overblijft.
- Nadat alle benodigde putjes gevuld zijn met vliegen, flip de kamer zodanig dat de bodemplaat naar boven is, zodat het stof de poten kan bedekken door de maas te vallen.
- Bevestig de boven- en onderplaten stevig door de schroeven aan te draaien en de kamer te vortexen om de vliegen voor 4 s te stofen.
- Knop de kamer (bovenplaat naar beneden) tegen een tafel tweemaal, zodat de kleurstof doorheen gaat naar de andere kant. Draai vervolgens de kamer omhoog (bovenkant van de bovenkant) en keer de kamer tweemaal om ervoor te zorgen dat kleurstof op de bodem van de onderste kamer komt weg van de vlieg in de bovenkamer.
- Voor controlevliegen die niet mogen worden getroffen, ga onmiddellijk door naar stap 3 van het protocol. Voor vliegen die de test afronden, ga verder naar stap 2.7.
- Rust de kamer plat op een tafel of aanrecht met de bovenplaat omhoog dertig minuten omhoog om de vliegen te laten bruiden. Plaats het kamIs in een geluids- en trillingsvrije ruimte om uw omgeving constant te houden voor alle verzorgingsexperimenten (lichtniveau, vochtigheid en temperatuur). Een tafelblad incubator bij RT of 25 ° C met vochtigheidscontroles is ideaal.
3. Bereiding van monsters en absorptieanalyse
- Draai de bodemplaat met de bovenplaat naar boven om de bodemplaat los en verwijder deze uit de kamer, zorg ervoor dat u geen kleur verliest.
- Plaats de kamer op een Fly CO 2 pad met een lage luchtstroom totdat de vliegen zijn verdoofd.
- Draai de bovenplaat uit de kamer. Gebruik voorzichtig pincet om een been te grijpen en één stof met een stof uit elke kamer te verplaatsen en in een 1,5 ml microcentrifugebuis met EtOH te plaatsen. De transfertijd voor 15 kamers, die elk een vlieg bevatten, bedraagt ongeveer 3-5 minuten. Experimenten zouden in overdrachtijden moeten factoren als / wanneer verrassende experimenten met meerdere kamers zorgen voor een efficiënte opstelling van experimenten. Zodra elke microcentrifugebuis 1 vlieg bevat, sluit de dop en draai de buis drie keer in om te roeren en meng de oplossing van kleurstof en ethanol.
- Incubeer buizen die ethanol bevatten en vliegen gedurende 5 uur bij kamertemperatuur om te zorgen voor volledige verwijdering van de kleurstof uit de vlieg in oplossing. Na de 5 uur, vortex elke buis (2 s) kort om de kleur van de vliegen te verruimen.
- Aliquot 50 μL van de experimentele 1,5 ml buis in een putje van een 96-putjesplaat indien beschikbaar, en let op de plaats van elk monster op de plaat. Voeg 200 μl EtOH toe om het monster 5x te verdunnen. De verdunning vermijdt plafondseffecten van zwaar gestoffeerde vliegen of grote verzorgingsfouten.
- Gebruik een plaatlezer om elk monster te analyseren bij 397 nm. Als alternatief meet de absorptie voor individuele monsters en blanks op een standaard spectrofotometer in het zichtbare spectrum als een plaatlezer niet beschikbaar is.
- Lees en teken het monster door de plaatlezer en sla de spreadsheet op met de recordeD monsters op de plaat.
4. Kwantificering van de resultaten
- Stel resultaten samen voor alle monsters en meet de variantie voor elk genotype of conditie.
OPMERKING: Dye accumulatie op tijd 0 min en op tijd 30 min worden beschouwd als afzonderlijke condities met behulp van statistische analyse door eenrichtings ANOVA en Bonferroni correctie of andere correcties voor meerdere parallelle vergelijkingen. - Bereken het percentage verschillend percentage voor elk genotype / conditie aan de hand van de volgende vergelijking: [(gemiddelde accumulatie van de accumulatie van de kleurstof bij tijd 0 '- kleurstofaccumulatie gemiddelde waarde op tijd 30') / kleurstof accumulatie gemiddelde waarde op tijd 0] x 100.
- Geef het percentage voor elk genotype en de conditie in de percelen uit en vergelijk de genotypes en voorwaarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De grooming assay levert kwantitatieve data op om de gedragsprestaties te beoordelen op basis van het relatieve restant van geaccumuleerde kleurstof die op de lichamen van vliegen achterblijft na een ingestelde tijdstip voor grooming (30 minuten). Voorbeeldbeelden van het ontwerp van het glijplezierkamer en de belangrijkste stappen van de analyse worden in Figuur 1 gemarkeerd. Vliegt aggregaat een significante hoeveelheid kleurstof uit onmiddellijke afstoften door vortexeren in aanwezigheid van kleurstof ( Figuur 2d, 2e ). Gevulde vliegen kunnen een reeks kleurstofaccumulatie post-assay behouden ( Figuur 2f, 2g ). Solubilisatie van kleurstofaccumulatie in EtOH en het meten van absorptie van individuele monsters zorgt daarom voor een reproduceerbare en zeer kwantitatieve beoordeling van het verzorgingsvermogen.
In deze studie van DopR bij de regulering van achterliggende verzorging, vergeleken we de verzorgingsprestatie van een sterke hypomorf (
Om de verschillen te onderzoeken zijnTween verzorgingsvermogen van voorbeneg vs hindleg verzorgingsprogramma's, hebben we direct opgebouwd kleurstof accumulatie op scheidbare lichaamsdelen tijdens het verzorgen ( Figuur 4 ). Door de koppen, vleugels of "lichaam" (buik / thorax / benen) van de individuele vliegen na de analyse te analyseren, waren we in staat om verschillen en gelijkenissen tussen genotypes op betrouwbare wijze te kwantificeren. De bevindingen ondersteunen een interpretatie dat er geen verschillen aanwezig waren voor voorlopige verzorgingsprogramma's, aangezien er geen significante verschillen werden waargenomen voor hoofden van WT Vs. DopR mutanten. Er werden echter significante verschillen waargenomen voor zowel vleugel- als lichaamsmetingen tussen genotypen. Deze aanvullende techniek voor het uitvoeren van de primaire test op lichaamsdelen in plaats van hele vliegen, maakt een eenvoudige methode mogelijk om aanvankelijk onderscheid te maken tussen voorgeprogrammeerde en achterblijvende verzorgingsprogramma's. Deze resultaten werden verder uitgebreid en ondersteund door zorgvuldige gedragswaarnemingen en video-opname of het volgen van individuele componenten van de voorpoot of hIndleg gedrag. Alle resultaten van de figuren 2-4 worden gereproduceerd met toestemming van genen, hersenen en gedrag 15 .
Figuur 1: Drosophila Grooming Assay Workflow. Deze vereenvoudigde flowchart geeft een overzicht van de belangrijkste stappen in het verzorgingsprotocol, waarbij u een aantal van de benodigde materialen en apparatuur onderstreept. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Kwantificering van verzorging op basis van kleurstofaccumulatie. (A) verzorging kamer. Individuele vliegen en briljante gele kleurstof worden in individuele putten geplaatst (1 vlieg: 1 put). DimensiesEn blauwdrukken voor productie in aanvullende gegevens. ( B, d, f ) WT volwassen mannelijke Drosophila (+ / +). ( C, e, g ) DopR f02676 / DopR f02676 volwassen mannelijke Drosophila. ( B, c ) Vliegt voor afvallen. ( D, e ) Vloeien direct na het vuilen door de vortexkamer, voorafgaand aan het verzorgen (tijd: 0 min). ( F, g ) Vliegt na verzorging (tijd: 30 min). Schaalbalk = 400 μm. Reprinted met toestemming van genen, hersenen en gedrag 15 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Dopamine Receptor ( DopR / dDA1 / dumb ) is vereist voor Modulatie van Grooming Gedrag. (A , c, e ) GroominG wildtype (blauw) en mutant vliegen (rood / oranje) gemeten op 0 min of 30 min na afstoten. SEM wordt gemeten voor elk genotype en conditie. (A , b ) n = 43 vliegen per genotype en conditie. (A) WT en DopR f02676 vliegt zowel vertonen verzorgen gedrag (+ / + 30' tegenover + / + 0' = p-waarde <0,0001, DopR f02676 30' vergeleken met DopR f02676 0' = p-waarde <0,0001). DopR vliegen drukken ook niet zo goed als WT dieren ( DopR f02676 30 'vergeleken met + / + 30' = p waarde <0.001). Acute uitstoten van elk genotype bij 0 'resulteert in equivalente accumulatie van stof (ns = niet significant). ( B, d, f ) Grooming percentage verschil wordt berekend voor elk genotype (kleurstof bij 0 '- kleurstofaccum bij 30' / kleurstof accum. 0 'x 100) een relatieve waarde voor het vergelijken van verzorgingsgedrag. ( C ) DopR attp / DopR
G4.jpg "/>
Figuur 4: Dopamine Receptor Function stimuleert Hindleg Grooming. (A) Grooming afzonderlijke gebieden van WT (blauw) en DopR f02676 / DopR f02676 (rood) gemeten bij 30 minuten na afgestoft en daaropvolgende dissectie. P waarde voor vleugelverzorging = 0,0204. P waarde voor lichaam = 0,0302. N = 33-35 vliegen voor alle omstandigheden. SEM wordt gemeten voor elk genotype en conditie. Statistische analyse door One Way ANOVA en Bonferonni Correction. Reprinted met toestemming van genen, hersenen en gedrag 15 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend Figuur: Alternatieve methode voor visuele kwantificering van verpleegkundige gedrag met behulp van NIH Image J Pixel Intensity Software. ( A ) Visualisatie van wilDtype Drosophila onder het oplossen van de reikwijdte. Ovaal definieert dorsale buik als het gebied van analyse voor pixelintensiteit. ( B ) Visualisatie van dorsale buik na het uitstoten met Ultra Green V10 fluorescerende verf pigment. Standaardfilter voor groene fluorescentie legt het blauwgroen pigment vast. ( C ) WT dier na coating met UGV10 pigment (pregrooming). ( E ) WT dier na coating met UGV10 pigment (postgrooming). ( D ) DopRf02676 homozygote mutant na coating met UGV10 pigment (pregrooming). ( F ) DopRf02676 homozygote mutant na coating met UGV10 pigment (post-grooming). ( G ) Kwantificering van pixelintensiteit voor alle omstandigheden. N = 15 vliegt voor elk genotype of conditie. Statistische analyses door One Way ANOVA en Bonferonni Correction. Ns = niet significant verschil. *** staat voor ap <0,001. plGemak klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De grooming assay is relatief eenvoudig, maar we zouden waarschuwingsexperimenten speciale aandacht besteden aan de volgende problemen. Het vasthouden van een strakke afdichting door de schroeven op de boven- en onderplaten aan te trekken na het invoeren van vliegen en kleurstof is essentieel voor reproduceerbare resultaten. De briljante gele kleurstof is zeer goed en losse gewrichten zullen verliezen van kleurstof uit de randen van de kamer toestaan. De onregelmatigheid in kleurstofgehalte voor elke put kan gemakkelijk groomkwantificatie afwerpen omdat niet-uniforme afstoting variantie en valse positieve percentages voor groomevenementen zal verhogen. Daarnaast raden wij experimenten aan om zich bewust te zijn van het milieu waarin zij ervoor kiezen om de verzorgingskamer gedurende de 30 minuten verzorgingsperiode te houden. Milieu constancy voor temperatuur, verlichting, tijd van de dag en vochtigheid zijn essentieel voor consistente prestaties voor Drosophila gedragsonderzoeken. Houdt de verzorgingskamers binnen een kleine incubator om afleiding te minimaliseren oR variabele labomgevingen is ideaal voor maximale reproduceerbaarheid van resultaten, maar andere ruimtelijke voorzieningen kunnen ook succesvol zijn.
Met betrekking tot kleurstofaccumulatiemetingen hebben we geconstateerd dat de kleurstof doorlaatbaar is voor latexhandschoenen, zodat nitrilhandschoenen de voorkeur hebben voor het hanteren en weegen van stof. Wees voorzichtig om stof niet breed te verspreiden over de laboratoriumoppervlakken, omdat het kleding gemakkelijk kan vlek en oppervlakken of uitrusting kunnen vervuilen. Het isoleren van een gebied en één vliegstation / CO 2 pad voor experimenten heeft de voorkeur om kleurstofblootstelling te bevatten. We raden de experimenten aan om zeker de UV-transparante 96-platen te gebruiken. De absorptiepiek van 397 nm voor Brilliant Yellow-kleurstof ligt dichtbij het UV-spectrum, en standaard 96-platen kunnen zwakke of onnauwkeurige maatregelen voor kleurstofverdunningen veroorzaken. De kleurstof is ook oplosbaar in water als een alternatief voor EtOH. Drosophila zinken echter niet gemakkelijk in water zonder significante vortexing en kleine luchtbellen aloNg het lichaam van gekleurde dieren laat lagere consistentie en oplosbaarheid van kleurstof zien. Ethanol toont consistente betere resultaten en lagere variantie bij directe vergelijkingen.
Onze analyse kan gemakkelijk worden aangepast voor aanvullende technieken en meer verfijnde studies, zoals dissectie van het vliegenlichaam post-assay ( Figuur 4 ). Dergelijke aanvullingen kunnen nodig zijn om te begrijpen welke verzorgingsstappen aangetast zijn, aangezien de kleurstofaccumulatie alleen in ruime mate wijst op gedragsveranderingen zonder de fundamentele biologische of neurale oorzaak te adresseren. Zodra er verschillen zijn waargenomen, zijn parallelle experimenten die gebruik maken van video-opname of direct-observatiemethoden essentieel om het gedragswortel van eventuele verschillen in het rijgedrag te begrijpen. Dit kan verder worden onderzocht door visuele kwantificering van stofpartikelopbouw op specifieke lichaamsdelen met behulp van pixelintensiteitsmaatregelen via het NIH ImageJ softwareprogramma, samen met directe tracking van voor- en achterlichtGedrag door videobeelden te scoren. Met betrekking tot alternatieve methoden voor visuele kwantificering van fluorescerend stof, hebben vroege experimenten in het laboratorium gebruik gemaakt van een fluorescerende verfpigment afgeleid van Alkaline Rare Earth Metal Silicaat-Aluminaat Oxide Europium. Na het vuilen van de vliegen met het fluorescerende verfpigment en het anaesthetiseren of decapiteren van de dieren na het verzorgen, kunnen de lichamen worden geregistreerd en geanalyseerd door middel van digitale microscopie met behulp van een standaard fluorescerend filter voor GFP op een dissecterende scope ( Supplemental Data ). Hoewel deze methode een nauwkeurige kwantificering van de pixelintensiteit mogelijk maakt die overeenkomt met de resultaten waargenomen met behulp van Brilliant Yellow-kleurstof, vonden we dat de doorvoer van deze methode relatief langzaam is en de pigmentdeeltjes licht enigszins variëren en minder uniform zijn dan de laag waargenomen voor Brilliant Gele kleurstof. Voor sommige experimentele toepassingen is deze alternatieve methode echter geschikt, en er is een aanzienlijke variëteit in de beschikbare fluoResent kleuren die nuttig kunnen zijn voor drosophila en nondrosophila applicaties of iteratieve stofzuivering experimenten waarbij kwantificering van afzonderlijke gebeurtenissen essentieel is. Opgemerkt dient te worden dat het verfpigment zelf in water oplosbaar is, maar snel de fluorescentie in water verliest, waardoor het nut van dit pigment ernstig wordt gehandhaafd voor standaard absorptiemaatregelen.
Deze soorten methoden die gericht zijn op specifieke voor- of achterlichtverzorgingsgebeurtenissen zijn essentieel voor het begrijpen van de exacte aard van een fenotype en kunnen potentiële neurale circuits of locomotorische programma's benadrukken om verder te onderzoeken. Bovendien, voor parallelle besturingsexperimenten, is het essentieel om potentiële niet-specifieke gedragsredenen uit te sluiten dat verzorging beïnvloed kan worden. Als dieren brede motorische tekorten of abnormaliteiten vertoonden, is het mogelijk dat grooming tekorten secundair zijn aan de brede locomotorische fenotypes. Eenvoudige video-tracking van WT dieren tegen de mutant of cirCuit gemanipuleerde condities kunnen gemakkelijk onderscheiden tussen grote verschuivingen in snelheid of totale afstand afgelegd, onafhankelijk van grooming tekorten.
De grooming assay is een veelzijdige methode die geschikt is voor zowel kleine als grootschalige studies van dit complexe multistep locomotor programma; De ontwerpen worden gemakkelijk aangepast om de kamerafmeting of nummer 15 te verhogen. De methode levert robuuste kwantitatieve gegevens die ideaal zijn voor een vergelijkende beoordeling van vliegen 'verzorgingsvermogen. De productie van de kamers is kostenefficiënt en kan worden gemaakt met behulp van veel verschillende machines (3D printers, lasersnijmachines, CNC-molens), afhankelijk van de beschikbare bronnen. De techniek zorgt voor intermediaire doorvoer van individuele monsters die gemakkelijk kunnen worden uitgebreid voor genetische schermen en functionele circuit-mapping studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij danken Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon en Rose Hedreen voor vroegtijdig werk in het testen en opzetten van deze methodologie en kamerontwerpen. We bedanken Kelly Tellez en Graham Buchan voor het lezen en bewerken van het manuscript. We danken Andrew Seeds en Julie Simpson voor hun pionierswerk en hun advies en ondersteuning bij het suggereren van het gebruik van Brilliant Yellow Dye (Sigma). Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door de Mary E. Groff Chirurgische en Medische Research and Education Charitable Trust, het Bronfman Science Center en het Hellman Fellows Programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1 mL and 200 μL) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96-well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8 - 32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Dawkins, R., Dawkins, M. Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies. Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).
- Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951 (2014).
- King, L. B., et al. Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila. G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).
- Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome. Plos One. 6 (11), e27100 (2011).
- Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
- Chang, H. Y., et al. Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine. Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).
- Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).
- Feng, G. P., et al. Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).
- Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5). Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).
- Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).
- Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines. Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).
- Pitmon, E., et al. The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila. Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).
- Phillis, R. W., et al. Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).
- Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. Elife. 4, e08758 (2015).
- Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior. Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).
